許星鴻 , 甘宏濤 劉統(tǒng)昊 孟 霄 丁子媛 徐國成 周麗青, 陸子俊葛春年

(1. 江蘇海洋大學 江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點實驗室, 江蘇 連云港 222005; 2. 江蘇海洋大學 江蘇省海洋生物技術重點實驗室, 江蘇 連云港 222005; 3. 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室, 山東 青島 266071)

染色體作為遺傳物質的載體和細胞功能的組織者, 是生物生長發(fā)育、遺傳和變異的物質基礎, 因此染色體及核型研究是遺傳學的重要基礎[1]。目前, 關于魚類[2]、甲殼類[3]和貝類[4]等水生動物的染色體研究已有較多報道。單環(huán)刺螠 (Urechis unicintus)隸屬螠蟲動物門螠綱無管螠目刺螠科, 俗稱海腸, 為我國沿海分布的唯一無管螠目物種[5]。其肉味鮮美, 富含人體必需氨基酸、不飽和脂肪酸和具有藥用價值的提取物,被稱為裸體海參, 并能對改善海洋環(huán)境污染起到積極作用, 具有較大的開發(fā)利用前景[6-7]。近年來由于過度捕撈, 單環(huán)刺螠天然資源量日益減少, 亟待開展人工繁育工作。染色體研究是遺傳育種工作的基礎, 但目前我國對單環(huán)刺螠的研究主要集中在形態(tài)特征[5]、生態(tài)環(huán)境[8]、繁殖發(fā)育[9]與增養(yǎng)殖技術[10]等方面, 關于單環(huán)刺螠的遺傳學基礎研究相對薄弱, 僅見不同地理種群遺傳多樣性分析和微衛(wèi)星標記開發(fā)[11-12], 迄今尚未見有關單環(huán)刺螠染色體的文獻報道。本研究探索了單環(huán)刺螠染色體制備方法, 并進行了核型分析, 以期為相關細胞遺傳學和育種研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用單環(huán)刺螠體長(10.1±3.2) cm、體質量(15.4±3.5) g, 于2019 年4 月購自江蘇省連云港市海寧路水產(chǎn)品市場, 胚胎和幼體由本課題組人工繁育所得。取成熟精卵進行人工授精, 受精卵洗卵后轉入水族缸中, 水溫15～16 ℃, 鹽度25, 自然光照, 連續(xù)充氣, 孵化后日投喂2 次金藻(Isochrysis galbana)。胚胎和幼體取樣時間分別為受精約18 h(膜內擔輪幼蟲)、孵化后2 d(擔輪幼蟲)和孵化后12 d(體節(jié)幼蟲)。

1.2 方法

1.2.1 成體組織制片

前處理: 將單環(huán)刺螠成體隨機分兩組, 一組按10 μg/g 體質量向體腔一次性注射植物血球凝集素(phytohaemagglutinin, PHA), 12 h 后用秋水仙素處理。另一組不注射PHA, 直接用秋水仙素處理。秋水仙素處理分別采用浸泡法和注射法進行對比, 濃度為0.4 和0.6 g/L, 處理時間設置為6、8、10、12和14 h, 以篩選出秋水仙素處理的適宜方法。各組處理溫度均為20℃。解剖取呼吸腸和體腔液, 呼吸腸剪碎, 200 目篩絹過濾至離心管中; 體腔液于4℃以1 000 r/min 離心5 min, 收集沉淀細胞。

低滲: 低滲液用0.075 mol/L KCl 溶液, 低滲時間分別為30、45、60 和75 min。

固定: 將含有材料的低滲液于 4℃以1 000 r/min離心5 min, 棄上清。加入5 mL 預冷的卡諾氏固定液(甲醇: 冰醋酸=3: 1), 輕輕吹打混勻, 4℃固定15 min后, 4℃以1 000 r/min 離心5 min, 棄上清。更換新固定液3 次, 使固定總時間達1 h。

解離: 向沉淀中加入2 mL 預冷50%冰乙酸, 吹打混勻, 解離5 min。

滴片: 分別采用熱滴片法和冷滴片法, 將細胞懸液滴在載玻片上, 滴片高度1～2 m, 自然風干。

染色: 用10%Giemsa 染液染色20～30 min, 用蒸餾水沖洗并晾干。

1.2.2 胚胎和幼體制片

分別取胚胎(膜內擔輪幼蟲)和幼體(擔輪幼蟲或體節(jié)幼蟲)于含0.4 g/L 秋水仙素的海水中培養(yǎng)12 h,于4℃以1 000 r/min 離心5 min, 棄上清, 取沉淀。低滲、固定、解離等其他步驟同成體材料。

1.3 染色體計數(shù)及核型分析

染色體標本用尼康(ECLIPSE 90i)光學顯微鏡觀察,拍照。選取100 個分散良好的染色體分裂相, 統(tǒng)計染色體數(shù)目, 根據(jù)頻率分布確定染色體數(shù)目。選取10 個數(shù)目完整、形態(tài)清晰的中期分裂相, 采用Adobe Photoshop CC 2018 圖像處理軟件測量染色體長度, 并根據(jù)Levan 等[13]的分類標準計算單環(huán)刺螠染色體的相對長度以及臂比等基本參數(shù), 進行染色體配對和分類。

2 結果

2.1 單環(huán)刺染色體制片材料和方法的比較

對分別以胚胎、幼體以及成體體腔細胞和呼吸腸為材料進行染色體的制片效果進行比較, 結果表明: 以成體體腔細胞、胚胎和幼體為材料均能觀察到中期分裂相, 以呼吸腸為材料獲得分裂相極少。以成體體腔細胞和幼體為材料得到的分裂相分別為(5.92±1.03)%和(5.67±0.64)%, 兩者差異不顯著(P>0.05)。以胚胎為材料得到的有絲分裂相雖然較多, 但制片雜質很多嚴重影響觀察。

秋水仙素處理以濃度0.4 g/L、浸泡12 h 得到的分裂相較清晰, PHA 對增加分裂相無顯著影響。采用0.075 mol/L KCl 處理 45 min 低滲的染色體分散度較好, 熱滴片法制片效果優(yōu)于冷滴片法。

2.2 單環(huán)刺染色體的形態(tài)

采用單環(huán)刺螠體腔細胞制備染色體標本, 經(jīng)Giemsa 染色后, 顯微鏡下呈現(xiàn)清晰的血細胞有絲分裂中期的分裂相, 多數(shù)染色體呈X 型, 為中部或亞中部著絲粒染色體(圖1a)。體腔中精母細胞分裂相可見處于減數(shù)分裂細線期的染色體, 呈長絲狀相互連接或纏繞(圖1b), 聯(lián)會后的二價體則呈短棒狀(圖1c)。

圖1 單環(huán)刺螠體腔細胞分裂相(Giemsa 染色)Fig. 1 Division phase of chromosomes of coelomocytes in Urechis unicinctus (Giemsa staining)

2.3 單環(huán)刺染色體數(shù)目

選取單環(huán)刺螠染色體分裂相共100 個, 其中65 個為體腔血細胞有絲分裂中期, 35 個為精母細胞減數(shù)分裂二價體。對染色體數(shù)目及出現(xiàn)的頻率統(tǒng)計結果見表1。單環(huán)刺螠染色體眾數(shù)為146, 出現(xiàn)頻率為64.62%, 體腔精母細胞二價體眾數(shù)為73, 占減數(shù)分裂細胞個數(shù)的57.14%。結果顯示, 單環(huán)刺螠二倍體染色體數(shù)目為2N=146。

表1 單環(huán)刺螠體腔細胞染色體和二價體數(shù)目出現(xiàn)頻率Tab. 1 Frequency of chromosomes and bivalent number in Urechis unicinctus

2.4 單環(huán)刺染色體核型分析

根據(jù) Levan 等[13]的染色體分類方法, 單環(huán)刺螠染色體的核型數(shù)據(jù)統(tǒng)計結果見表2。單環(huán)刺螠73 對染色體可分為4組(圖2), 核型圖中染色體按M(metacentric chromosome, M)、SM(submetacentric chromosome,SM)、ST(acrocentric chromosome, ST)、T(telocentric chromosome, T)的順序分類排列, 同一類型的染色體按相對長度遞減的順序排列。M 組(1～29 對)共有58條染色體, 臂比值為1.0～1.7, 著絲粒清晰可辨, 為中部著絲粒染色體; SM 組(30～42 對)共有26 條染色體, 臂比值為1.7～3.0, 為亞中部著絲粒染色體; ST組(43～52 對)共有20 條染色體, 臂比值為3.0～7.0, 為亞端部著絲粒染色體; T 組(53～73 對)共有42 條染色體, 臂比值>7.0, 為端部著絲粒染色體。單環(huán)刺螠核型公式為 2N=58M+26SM+20ST+42T, 染色體臂數(shù)NF=250, 未發(fā)現(xiàn)異形性染色體和隨體。

表2 單環(huán)刺螠染色體核型數(shù)據(jù)Tab. 2 Karyotype data on chromosomes in Urechis unicinctus (n = 10)

3 討論

3.1 單環(huán)刺染色體制備

選用適宜材料是制作動物染色體標本的關鍵。魚類染色體制片一般采用頭腎[2,14], 甲殼類發(fā)育期的精巢可以獲得較多的中期分裂相[15-16], 鰓和外套膜是貝類染色體制片常用的材料[4,17]。單環(huán)刺螠機體結構簡單, 僅由體壁、消化道和腎管組成, 其消化道中有一段壁薄、彈性大, 具有呼吸作用, 稱為呼吸腸[5]。單環(huán)刺螠生殖腺體積微小, 通過肌束附著于后腸壁和體壁上, 產(chǎn)生的生殖細胞放散于體腔中,進一步成熟后收集于腎管中[9,18]。本研究嘗試了用單環(huán)刺螠的胚胎、幼體、成體的體腔細胞和呼吸腸等材料進行染色體制片, 結果顯示用呼吸腸難以獲得分裂相, 可能與其分裂指數(shù)不高有關。譚杰等[19]以刺參(Apostichopus japonicus)原腸后期胚胎為材料獲得了效果良好的中期分裂相染色體, 但本研究以單環(huán)刺螠后期胚胎為材料雖然有絲分裂相較多, 但由于其為間黃卵, 卵黃含量顯著多于刺參的均黃卵, 因此制片雜質較多而影響觀察效果。星蟲類機體組成與單環(huán)刺螠相近, 取其體腔液細胞制片染色體清晰可見[20]。本研究以單環(huán)刺螠成體體腔細胞和幼體為材料均能觀察到中期分裂相, 但幼體材料受繁殖季節(jié)的限制, 獲取幼體的人工繁育手段亦較繁瑣, 因此單環(huán)刺螠染色體制片以采用成體體腔細胞更方便。取單環(huán)刺螠生長期雄體的體腔液既可以得到體腔血細胞的有絲分裂相, 又可以觀察到體腔中精母細胞的減數(shù)分裂。

續(xù)表

圖2 單環(huán)刺螠染色體核型Fig. 2 Karyotype of Urechis unicinctus

PHA 作為有絲分裂原可以促進細胞分裂, 常用于魚類染色體研究[14], 在刺參[19]、鋸緣青蟹(Scylla serrata)[21]和貝類[22]中也有良好效果。而本研究中PHA 對于增加單環(huán)刺螠分裂相沒有明顯的促進作用。秋水仙素能抑制微管聚合、紡錘體形成, 從而阻止染色體分離, 使細胞停滯于分裂中期, 利于觀察染色體。用秋水仙素處理成體多采用注射法, 取材為胚胎、幼體或離體組織時用浸泡法[23-24]。在本研究中, 單環(huán)刺螠成體注射秋水仙素的制片效果不如浸泡法, 可能與其體形細長、注射部位作用范圍受局限有關。秋水仙素的使用劑量和處理時間是影響染色體制片效果的重要因素[17]。以往文獻中用秋水仙素浸泡制片材料的濃度在0.1 g/L～1 g/L 之間, 浸泡時間為40 min～24 h, 秋水仙素濃度與處理時間因所用材料而不同。本實驗篩選得出單環(huán)刺螠適宜的秋水仙素處理濃度為0.4 g/L、浸泡12 h, 與裸體方格星蟲(Sipunculus nudus)一致[25]。當秋水仙素用量過大或作用時間過長, 會導致染色體凝縮過度, 反之, 當秋水仙素用量不足或者作用時間過短, 則會導致分裂相少且染色體細長, 相互連接而影響觀察。

3.2 單環(huán)刺染色體數(shù)目及核型分析

螠蟲動物全世界僅約140 余種, 最初作為螠蟲綱, 與星蟲類、沙蠶等同屬環(huán)節(jié)動物門, 后來被單列為螠蟲動物門[26]。根據(jù)李石磊等[27]對線粒體基因比較及系統(tǒng)發(fā)育分析得出, 螠蟲類和星蟲類、多毛類聚為一進化分枝, 表明其親緣關系接近。星蟲動物染色體數(shù)目2N介于18～34, 多為20 條[20]。中國沿海常見的可口革囊星蟲(Phasolosma esculenta) 核型公式為2N=20=4M+10SM+6ST[28], 裸體方格星蟲染色體數(shù)目多于其他星蟲(2N=34), 核型公式為2N=26M+8SM[25]。目前已知的多毛類染色體數(shù)目2N為18～38 條, 如多齒圍沙蠶(Perinereis nuntia)核型為2N=28=4M+10SM[29],Nephtys incisa核型為2N=38=4M+3SM+12ST[30]。本研究中單環(huán)刺螠具有146 條染色體(2N=58M+26SM+20ST+42T), 明顯多于星蟲類和多毛類。李樹深[31]認為在特定分類階元中, 具有較多中部或亞中部著絲粒染色體的是特化類群, 而具有較多端部著絲粒染色體的為原始種群。本研究發(fā)現(xiàn)單環(huán)刺螠具有58 條中部著絲粒染色體和26 條亞中部著絲粒染色體, 占染色體總數(shù)的 57.53%, 表明其為特化種類。根據(jù)Admed[32]提出M 和SM 染色體可使染色體組型穩(wěn)定,而T 和ST 染色體比較多變的觀點, 表明單環(huán)刺螠有比較穩(wěn)定的染色體組型。

環(huán)節(jié)動物門蛭綱和寡毛綱動物的染色體數(shù)量2N介于16～32[33-34]。在軟體動物門中, 雙殼類染色體數(shù)量2N為14～48 條, 其中約40%具有38 條染色體[35];腹足類染色體數(shù)量2N為14～72 條; 頭足類染色體數(shù)量2N相對較多, 如金烏賊(Sepia esculenta)[36]、長槍烏賊(Heterololigo bleekeri)和萊氏擬烏賊(Sepioteuthis lessoniana)[37]等都含有92 條染色體。與軟體動物門其他類群相比, 頭足類在形態(tài)結構上具有高度進化的特征[38]。節(jié)肢動物門甲殼類染色體數(shù)目2N隨種類不同在64～376 之間變化較大[39], 如鋸緣青蟹98條[21]、日本114 條[15]、克氏原螯蝦188 條[16]。Murofuchi[40]認為在節(jié)肢動物門十足類中, 染色體數(shù)目多的類型較為進化。棘皮動物門是無脊椎動物中最高等的一個類群, 其染色體數(shù)目卻相對較少, 如刺參染色體數(shù)目2N為46 條[19]、馬糞海膽(Hemicentrotus pulcherrimus) 為42 條[41]。本研究結果表明,單環(huán)刺螠染色體數(shù)目和染色體組型分別為2N=146和2N=58M+26SM+20ST+42T, 在無脊椎動物中屬于染色體數(shù)目較多的類群, 處于較特殊的進化地位。

迄今尚無其他螠蟲動物的染色體核型研究報道,很難從綱目科屬種的層次上探討其系統(tǒng)演化關系,因此需要研究更多的螠蟲動物核型及帶型, 并結合熒光原位雜交等分子生物學技術手段, 以深入進行螠蟲動物的系統(tǒng)分類和進化研究。

4 結論

單環(huán)刺蛻染色體數(shù)目為 2N=146,核型公式為2N=58M+26SM+20ST+42T，染色體臂數(shù)NF=250，未發(fā)現(xiàn)異形性染色體和隨體，在無脊椎動物中處于較特殊的進化地位，核型數(shù)據(jù)可為相關細胞遺傳和育種研究提供基礎。