左冉坤，遲 良，董記紅，李心慰，王 哲，劉國文，劉煥奇*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，山東 青島 266109；2.吉林大學 動物醫(yī)學學院,吉林 長春 130062)

圍產(chǎn)期(通常是指產(chǎn)前3周和產(chǎn)后3周)是奶牛泌乳周期中非常關鍵的一個時期。產(chǎn)后奶牛由于干物質(zhì)攝入減少，泌乳啟動，導致能量需求增加，使奶牛機體處于能量負平衡狀態(tài)，進而動員脂肪，脂肪分解增加，導致高非酯化脂肪酸(non-esterified fatty acid，NEFA)血癥。當肝細胞吸收大量NEFA，超過了自身代謝能力時，可造成NEFA不完全被氧化，產(chǎn)生大量酮體，如β-羥丁酸(β-hydroxybutyrate，BHBA)、乙酰乙酸和丙酮，造成酮病的發(fā)生[1]。研究表明，酮病奶牛肝臟炎性水平顯著增加，肝臟NF-κB炎性通路顯著激活，炎性細胞因子TNF-α和IL-1β等濃度顯著升高[2-3]，與酮病奶牛的高BHBA血癥密切相關。

線粒體融合蛋白2(mitofusin 2，MFN2)，是定位于線粒體外膜的高度保守的GTP酶，能參與線粒體外膜的融合，對線粒體功能的發(fā)揮起著重要的作用[4-6]。而線粒體是脂肪酸氧化的主要場所[7-8]，并且線粒體的功能與NF-κB通路的活化有關[9]，然而，MFN2對奶牛肝細胞NF-κB通路的影響尚未見報道。因此，本研究采用Western blot和qRT-PCR技術檢測NF-κB炎性通路關鍵分子的蛋白和基因表達，探討高表達MFN2對高BHBA活化的NF-κB通路的影響，為奶牛酮病臨床病理學研究提供理論依據(jù)。

1 材料方法

1.1 主要試劑雙抗(青鏈霉素)、Tris和地塞米松均購自Sigma公司；胎牛血清和RPMI-1640購自Gibco公司；Trizol和Premix Ex-Taq購自TaKaRa公司。

1.2 奶牛肝細胞的分離與培養(yǎng)采用兩步灌流法分離原代肝細胞[10]。手術切除荷斯坦犢牛肝尾狀葉，用灌流液A (140 mmol/L NaCl,10 mmol/L HEPES,6.7 mmol/L KCl,0.5 mmol/L EDTA,2.5 mmol/L 葡萄糖;pH7.2～7.4,37℃)灌注肝臟12 min，流速為50 mL/min。然后用灌流液B (140 mmol/L NaCl,30 mmol/L HEPES,6.7 mmol/L KCl,5 mmol/L CaCl2,2.5 mmol/L 葡萄糖;pH7.2～7.4,37℃)灌注肝臟3 min，流速50 mL/min，直至液體澄清。隨后，以20 mL/min的流速用膠原酶Ⅳ溶液(0.1 g膠原酶Ⅳ溶解在0.5 L灌注溶液B中，pH7.2～7.4，37℃)消化肝臟15～20 min。消化后將肝臟放入無菌平板中，加入100 mL胎牛血清終止消化。切開肝臟后取出血管和結(jié)締組織，用100目和200目的細胞篩依次過濾，得到單個肝細胞。在六孔板中培養(yǎng)72 h后，換成含有不同濃度BHBA(0.0，1.2，2.4，4.8 mmol/L)的RPMI-1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染腺病毒空載體(Ad-GFP)或MFN2過表達腺病毒(Ad-MFN2)，用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)7 h后，換成生長培養(yǎng)基培養(yǎng)41 h。

1.3 蛋白的提取和Western blot收集六孔板上的細胞，加入適量(由細胞量決定)的RIPA裂解液進行裂解，按照蛋白濃度測定試劑盒(上海生工生物科技有限公司)說明書測定蛋白濃度。用15%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。將膜在3%BSA/Tris緩沖鹽水/Tween(TBS-T)緩沖液中常溫封閉4 h，再分別將膜放在IKBα、p-IKB、NF-κB p65、p-NF-κB p65和MFN2的一抗中孵育過夜，隨后用TBS-T清洗膜，與辣根過氧化物酶標記的抗兔或抗小鼠免疫球蛋白室溫孵育45 min，使用Protein Simple成像儀對條帶成像。

1.4 總RNA提取和實時熒光定量PCR根據(jù)說明書使用TRIzol收集細胞，總RNA提取試劑盒提取總RNA，應用cDNA合成試劑盒合成cDNA。利用TaKaRa熒光定量試劑Premix Ex Taq和7500 Real-time PCR System檢測IL-1β、IL-6、TNFα和MFN2的mRNA水平。反應條件：94℃初始變性2 min，擴增35個循環(huán)(94℃變性10 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s)，然后在72℃下延伸5 min。用ABI PRISM 7500型熒光定量PCR擴增儀進行熒光定量PCR,使用2-△Ct法進行計算。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度BHBA對奶牛肝細胞NF-κB炎性通路的影響奶牛肝細胞經(jīng)過不同濃度的BHBA刺激后，檢測NF-κB炎性通路相關蛋白(IKBα、p-IKBα、NF-κB p65和p-NF-κB p65)和炎性細胞因子(IL-1β、IL-6和TNFα)mRNA的表達量。結(jié)果顯示，隨著BHBA濃度的增加，p-IKBα和p-NF-κB p65蛋白的相對表達量顯著增加(圖1A，B，C)，IL-1β、IL-6和TNFα的mRNA水平顯著升高(圖1D，E,F)，表明BHBA可激活奶牛肝細胞NF-κB炎性通路。

A.NF-κB炎性通路相關蛋白的表達;B.p-IKBα/IKBα;C.p-NF-κB p65/NF-κB p65;D.IL-1β的mRNA表達;E.IL-6的mRNA表達;F.TNFα的mRNA表達

2.2 不同濃度BHBA對MFN2表達的影響不同濃度BHBA刺激牛肝細胞后，檢測MFN2的mRNA和蛋白的表達情況，來判定不同濃度的BHBA對奶牛肝細胞MFN2表達的影響。結(jié)果顯示，MFN2的mRNA和蛋白的表達水平隨著BHBA的濃度的增加而顯著降低，表明BHBA在體外會降低奶牛肝細胞MFN2的表達水平(圖2A，B，C)。

A.MFN2 mRNA的表達;B.MFN2蛋白的表達;C.MFN2/β-actin

2.3 過表達MFN2后細胞內(nèi)MFN2的變化采用MFN2過表達腺病毒(Ad-MFN2)轉(zhuǎn)染奶牛肝細胞，檢測MFN2過表達情況。結(jié)果顯示， Ad-MFN2處理組與Ad-GFP處理組相比，MFN2的mRNA和蛋白的表達量顯著升高，AD-MFN2+BHBA處理組MFN2的mRNA和蛋白表達量也顯著高于Ad-GFP+BHBA處理組(圖3A，B，C)，這表明MFN2在奶牛肝細胞內(nèi)成功過表達，能逆轉(zhuǎn)BHBA對MFN2表達的抑制作用。

2.4 過表達MFN2對BHBA活化的NF-κB炎性通路的影響采用腺病毒過表達MFN2后，檢測IKBα、p-IKBα、NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白的表達量，以及IL-1β、IL-6和TNFα mRNA的表達水平。結(jié)果顯示，與Ad-GFP處理組相比，Ad-MFN2處理組p-NF-κB p65蛋白的表達水平顯著降低(圖4A，C)，IL-1β、IL-6和TNFα mRNA的表達水平也顯著降低(圖4D,E,F)。而Ad-MFN2 + BHBA處理組的p-IKBα和p-NF-κB p65蛋白的表達水平與Ad-GFP + BHBA處理組相比顯著降低(圖4A，B，C)，IL-1β、IL-6和TNFα mRNA的表達水平相比也顯著低于Ad-GFP+BHBA處理組(圖4D,E,F)。結(jié)果表明，過表達MFN2可抑制奶牛肝細胞BHBA引起的NF-κB炎性通路活化。

A.MFN2的mRNA表達;B.MFN2的蛋白表達;C.MFN2/β-actin

A.NF-κB炎性通路相關蛋白的表達;B.p-IKBα/IKBα;C.p-NF-κB p65/NF-κB p65;D.IL-1β mRNA的表達;E.IL-6 mRNA的表達;F.TNFα mRNA的表達

3 討論

奶牛酮病是圍產(chǎn)期奶牛常發(fā)的一種代謝性疾病，圍產(chǎn)期奶牛干物質(zhì)攝入減少，能量需求增加，導致脂肪動員，致使奶牛體內(nèi)堆積大量酮體，引發(fā)代謝障礙而產(chǎn)生酮病[11-12]。酮病奶牛表現(xiàn)出高NEFA和高BHBA血癥[13]，并且存在系統(tǒng)性的非感染性炎癥，血液中炎性細胞因子TNF和IL-6水平顯著升高[14]。NF-κB和NLRP3炎性通路是調(diào)節(jié)炎性細胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β產(chǎn)生的主要調(diào)節(jié)通路，而奶牛酮病的發(fā)病過程中肝臟NF-κB和NLRP3信號通路過度的活化[3]，所以NF-κB和NLRP3介導的炎性因子的升高與NEFA和BHBA的升高相關。史曉霞等[15]研究發(fā)現(xiàn)，體外添加NEFA處理奶牛原代肝細胞，可以促進NF-κB炎性通路的活化，促進炎性細胞因子的合成。本試驗結(jié)果表明，在體外培養(yǎng)的奶牛肝細胞中添加高濃度的BHBA會促進NF-κB相關蛋白及炎性細胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β) mRNA的表達，能量負平衡產(chǎn)生的高BHBA和NEFA血癥可激活肝細胞NF-κB炎性通路的活化，加劇酮病的發(fā)生和發(fā)展。

MFN2是線粒體膜上的蛋白，它可以參與線粒體融合，當其表達受到抑制時，會損害線粒體的功能[16]。在患有非酒精性脂肪肝炎的人和奶牛肝臟內(nèi)均出現(xiàn)線粒體功能障礙，MFN2蛋白和mRNA表達顯著降低[16-17]。DONG等[18]研究發(fā)現(xiàn),脂肪肝奶牛肝臟MFN2表達水平顯著降低。所以MFN2的表達降低可能與高濃度BHBA的脂毒性有關，MFN2的低表達可能參與了奶牛肝臟炎性通路的活化和肝臟能量代謝紊亂的發(fā)生。本試驗結(jié)果表明，高濃度BHBA可以顯著抑制MFN2基因和蛋白的表達，這說明高濃度的BHBA可顯著抑制MFN2的表達，損傷線粒體功能，進而可能進一步活化炎性信號通路，加劇酮病的產(chǎn)生。

在大鼠肝臟缺血再恢復灌注造成的炎性損傷中，線粒體損傷隨缺血時間的延長而加重，MFN2蛋白和mRNA的表達也隨之降低，同時表現(xiàn)出大量的炎性細胞浸潤[19]，這說明MFN2的表達與炎性水平有關。但關于MFN2的低表達是否參與了BHBA誘導的NF-κB炎性通路活化尚未見報道。本試驗通過在奶牛肝細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染腺病毒發(fā)現(xiàn)，MFN2過表達后，可抑制由BHBA引起的p-NF-κB p65和p-IKBα蛋白及炎性細胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表達水平升高，表明BHBA誘導的NF-κB炎性通路的活化被過表達的MFN2顯著抑制，說明MFN2可作為奶牛酮病的治療靶點，通過過表達MFN2一方面改善肝細胞線粒體功能，另一方面抑制肝細胞炎性通路的活化，起到防治酮病病理損傷的作用。

綜上所述，BHBA在體外培養(yǎng)的奶牛肝細胞中可以誘導NF-κB炎性通路的激活，而過表達MFN2可以逆轉(zhuǎn)BHBA引起的奶牛肝細胞炎性通路的激活，提示MFN2有望成為圍產(chǎn)期奶牛酮病疾病治療靶點。