劉 洋，姚睿智，劉 鵬，史宏昭，胡亞婕，徐 彬，呂紅明，李士澤

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院 動(dòng)物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，黑龍江 大慶 163319)

在全球變暖的背景下，環(huán)境愈加復(fù)雜而多變，對(duì)動(dòng)物的擾動(dòng)愈加頻繁[1-2]。低溫環(huán)境作為高寒地區(qū)最為常見應(yīng)激源之一，其對(duì)野生動(dòng)物的巨大危害是不言而喻的[3]，機(jī)體神經(jīng)-內(nèi)分泌[4]、生理[5]、生化[6-7]、免疫[8]等都會(huì)受到一定的影響。低溫環(huán)境會(huì)對(duì)動(dòng)物皮膚和下層組織造成不同程度的損傷，輕者對(duì)皮膚和皮下組織的淺表局部造成損傷，而嚴(yán)重者則涉及肌肉、 肌腱和骨骼等深部組織[9]；低溫環(huán)境可造成皮膚和肢端感覺下降，關(guān)節(jié)的靈活性以及骨骼肌的協(xié)調(diào)能力減弱，容易發(fā)生肌肉和肌腱撕裂、抽筋等運(yùn)動(dòng)性損傷[10]；另外，低溫環(huán)境所引起的低體溫更可使肌肉僵硬、黏滯性升高，最終出現(xiàn)凍僵反應(yīng)和不可逆轉(zhuǎn)的損傷，這些研究都在提示著低溫環(huán)境對(duì)動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)能力有著一定的影響。目前,低溫環(huán)境對(duì)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)能力影響的報(bào)道較少，而且在這些研究中某些潛在的影響因素常常被忽視。我們認(rèn)為低溫環(huán)境對(duì)運(yùn)動(dòng)能力的這種影響有可能會(huì)進(jìn)一步降低野生動(dòng)物的采食或捕食能力；同時(shí)，這種惡劣氣候環(huán)境也往往意味著可供應(yīng)食物的減少，而食物供應(yīng)減少會(huì)促進(jìn)動(dòng)物機(jī)體對(duì)儲(chǔ)備能量的調(diào)動(dòng)及利用，最終導(dǎo)致機(jī)體狀況整體下降[11]。一旦機(jī)體能量水平降低這對(duì)于動(dòng)物機(jī)體即將進(jìn)行的各種運(yùn)動(dòng)是非常不利，又會(huì)進(jìn)一步降低動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)耐力和強(qiáng)度。

自發(fā)運(yùn)動(dòng)是指僅由動(dòng)物內(nèi)部的刺激或狀態(tài)所引起的活動(dòng)，不同動(dòng)物有著獨(dú)特的自發(fā)運(yùn)動(dòng)，如小鼠的走動(dòng)、站立、舐足和嗅聞等[12]，能夠在一定程度上反映動(dòng)物的生理特征(運(yùn)動(dòng)或活動(dòng)能力)，常用曠場試驗(yàn)來評(píng)價(jià)。因此，本試驗(yàn)應(yīng)用曠場試驗(yàn)(open field test，OFT)來測定不同時(shí)長4℃冷暴露下采食和禁食的C57BL/6小鼠自發(fā)運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而分析低溫環(huán)境下禁食對(duì)C57BL/6小鼠自發(fā)運(yùn)動(dòng)的影響。而動(dòng)物在低溫環(huán)境下寒顫產(chǎn)熱過程中，骨骼肌儲(chǔ)存的能量隨著冷暴露的時(shí)間延長和溫度降低被大量消耗[13]。維持寒冷暴露中骨骼肌的能量水平對(duì)于寒冷環(huán)境下動(dòng)物運(yùn)動(dòng)能力的正常發(fā)揮有著十分重要的作用。因此，我們測定了腓腸肌中過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活劑l α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-l α,PGC-lα)和雌激素相關(guān)受體 α(estrogen-related receptorα，ERRα)表達(dá)水平，共同探討對(duì)環(huán)境低溫下禁食對(duì)C57BL/6小鼠自發(fā)運(yùn)動(dòng)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑PGC-1α(1∶1 000,#ab54481)抗體購自Abcam公司(英國)；ERRα(1∶1 000,#13826)抗體購自CST公司(美國)；山羊抗兔IgG(1∶20 000，#SA00001-2，Proteintech，美國)。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及分組8周齡雄性C57BL/6小鼠100只，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。每5只小鼠群養(yǎng)于聚苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)鼠籠中[鼠籠大小為375 mm(長)×173 mm(寬)×165 mm(高)]，并每籠給予200 g的松軟木屑?jí)|料，每周更換墊料2次。日光燈采光，明暗周期比為12 h∶12 h(開燈8：00，關(guān)燈20：00)，光照強(qiáng)度為200 lx。小鼠在人工智能氣候室中進(jìn)行為期7 d適應(yīng)性飼養(yǎng)，溫度為(28.0±0.5)℃，濕度為(40±5)%，自由采食標(biāo)準(zhǔn)鼠糧和飲水。

適應(yīng)性飼養(yǎng)完成后，隨即將小鼠初步分為自由采食組和限制采食組。自由采食組全天給予豐富的食物；限制采食組每天8：00-20：00剝奪食物，其余飼養(yǎng)條件2組均保持不變且一致，為期7 d。試驗(yàn)期間，每天抓摸2組小鼠10 min，使其適應(yīng)試驗(yàn)者的捕捉和操作；每天將2組小鼠移入測試室適應(yīng)20 min，以減少新異環(huán)境刺激對(duì)小鼠活動(dòng)的影響，保證試驗(yàn)時(shí)小鼠趨于穩(wěn)定。限飼適應(yīng)完成后，觀察小鼠的健康狀況和測定體質(zhì)量，進(jìn)行篩選從而剔除異常和發(fā)情小鼠。

自由采食組隨機(jī)分為7組(n=5)：自由采食常溫對(duì)照組，自由采食+冷刺激2 h組，自由采食+冷刺激4 h組，自由采食+冷刺激6 h組，自由采食+冷刺激8 h組，自由采食+冷刺激10 h組，自由采食+冷刺激12 h組；限制采食組隨機(jī)分為7組(n=5)：限制采食常溫對(duì)照組，限制采食+冷刺激2 h組，限制采食+冷刺激4 h組，限制采食+冷刺激6 h 組，限制采食+冷刺激8 h組，限制采食+冷刺激10 h組，限制采食+冷刺激12 h組。各組間小鼠體質(zhì)量經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)未見顯著性差異。

各組于人工氣候室中完成相應(yīng)時(shí)長的冷暴露后，立即進(jìn)行曠場試驗(yàn)。測試結(jié)束后，立即安樂死小鼠，快速采集其后肢腓腸肌組織，-80℃超低溫冰箱保存，以待后續(xù)分析。試驗(yàn)方案見圖1。

圖1 試驗(yàn)禁食及冷暴露處理方案

1.3 試驗(yàn)儀器與裝置本試驗(yàn)中所用的TM-Vision行為學(xué)試驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)和OFT-100曠場活動(dòng)試驗(yàn)箱以及落地式試驗(yàn)站等主要儀器均購自于成都泰盟軟件有限公司。曠場試驗(yàn)箱外形尺寸為625 mm(長)×740 mm(寬)×510 mm(高)，正面外側(cè)配有反光鏡，底壁及四周側(cè)壁由黑色塑膠構(gòu)成(圖2)。落地式試驗(yàn)站相對(duì)獨(dú)立于外界環(huán)境，可減少行為學(xué)試驗(yàn)因環(huán)境、燈光、氣流、噪音、人為干擾等的影響，因此所有的行為學(xué)測試全程均在落地式試驗(yàn)站中進(jìn)行。其頂部兩側(cè)裝有2盞40 W的日光燈作為照明系統(tǒng)，以保持觀察箱內(nèi)的光照條件一致；箱頂正中固定一個(gè)與TM-Vision行為學(xué)試驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)連接的高清攝像頭，用以采集圖像、記錄試驗(yàn)的全過程。

圖2 曠場試驗(yàn)裝置示意圖

1.4 試驗(yàn)方法與程序各組均在上午(8：00-11：00)時(shí)間段內(nèi)依次完成相應(yīng)的神經(jīng)行為學(xué)測試。每只小鼠僅測試1次。打開OFT-100曠場試驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)，設(shè)置試驗(yàn)各項(xiàng)數(shù)據(jù)(如試驗(yàn)人員、項(xiàng)目名稱和簡短描述等)，同時(shí)將單次試驗(yàn)總時(shí)間設(shè)為300 s，數(shù)據(jù)顯示間隔設(shè)為3 s；打開攝像頭，調(diào)節(jié)光線亮度與試驗(yàn)箱的位置。進(jìn)行區(qū)域設(shè)定，選擇25宮格模式，確定站立區(qū)和中心區(qū)域比例；最終設(shè)定標(biāo)尺。設(shè)置完成后，點(diǎn)擊“開始試驗(yàn)”，填寫動(dòng)物編號(hào)、溫度、濕度等試驗(yàn)參數(shù)。而后將C57BL/6小鼠背對(duì)試驗(yàn)員放入曠場試驗(yàn)箱中央，點(diǎn)擊“確定”命令，即可通過視頻行為分析系統(tǒng)觀察和分析受試小鼠在曠場試驗(yàn)箱內(nèi)5 min的活動(dòng)情況，觀察、記錄指標(biāo)包括：總活動(dòng)度、休息時(shí)間、活動(dòng)時(shí)間、區(qū)域分布指標(biāo)(四角、四周、中央的活動(dòng)情況)、站立次數(shù)、運(yùn)動(dòng)軌跡等。

每次測試結(jié)束，清理糞便，清洗試驗(yàn)裝置底部和側(cè)壁，并噴灑75%酒精。同時(shí)通風(fēng)，待試驗(yàn)裝置及落地試驗(yàn)站內(nèi)干燥無異味后方可進(jìn)行下1只小鼠的測試，避免前次試驗(yàn)小鼠的殘留氣味影響下一次的試驗(yàn)。

1.5 Western blot分析(1)蛋白提取及濃度測定。用含苯基甲烷磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解緩沖液(P0013B，碧云天，海門，中國)裂解組織樣品，隨后使用球磨儀將其均質(zhì)化以獲得總蛋白裂解物，BCA蛋白測定試劑盒(P0010，碧云天，海門，中國)測定組織裂解物的蛋白濃度。(2)蛋白變性。按比例加入5×蛋白上樣緩沖液，10 min煮沸，使蛋白變性。(3)凝膠電泳。使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離等量的蛋白裂解物。(4)轉(zhuǎn)膜。將電泳凝膠上的蛋白質(zhì)通過濕轉(zhuǎn)移儀轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(0.45 μm，Millipore，Darmstadt，德國)。(5)封閉及雜交反應(yīng)。PVDF膜用5%脫脂奶粉的封閉液在室溫下封閉1 h，封閉結(jié)束后，與目的一抗孵育，4℃過夜。TBST洗滌PVDF膜5次(每次10 min)后與二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜5次。(6)顯影。在Chemi Doc XRS+學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)下對(duì)膜滴加ECL發(fā)光液(WBLUR0100，Millipore)進(jìn)行曝光。(7)灰度分析。使用Image J 軟件(http://imagej.nih.gov/ij/)分析目的條帶的灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Two-way ANOVA 方法分析，并作圖。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 環(huán)境低溫下短期禁食對(duì)C57BL/6小鼠曠場測試中各項(xiàng)指標(biāo)的影響

2.1.1運(yùn)動(dòng)距離、運(yùn)動(dòng)時(shí)間與靜止時(shí)間 自由采食組和限制采食組小鼠運(yùn)動(dòng)距離在對(duì)照及2，4，6，8，10，12 h未見顯著性差異，但兩者變化趨勢相近，相比于對(duì)照，小鼠運(yùn)動(dòng)距離縮短，12 h變化最為明顯，而在4 h和 10 h卻略微上升；同時(shí)，除對(duì)照和10 h外，自由采食組運(yùn)動(dòng)距離均低于限制采食組(圖3A)。

自由采食組和限制采食組小鼠運(yùn)動(dòng)時(shí)間和靜止時(shí)間在對(duì)照及2,4,6,8,10,12 h未見顯著性差異，但兩者變化趨勢相近。相比于對(duì)照，小鼠運(yùn)動(dòng)時(shí)間減少，12 h變化最為明顯，而在2，4，8 h卻略微上升。除對(duì)照和10 h外，自由采食組運(yùn)動(dòng)時(shí)間均低于限制采食組(圖3 B)。相比于對(duì)照，小鼠靜止時(shí)間增加，12 h變化最為明顯，而在2,4,8 h卻略微下降，除對(duì)照和10 h外，自由采食組靜止時(shí)間均高于限制采食組(圖3 C)。

A.小鼠運(yùn)動(dòng)距離；B.小鼠運(yùn)動(dòng)時(shí)間；C.小鼠靜止時(shí)間

2.1.2中心、角落和周邊區(qū)域滯留時(shí)間 自由采食組和限制采食組小鼠中心滯留時(shí)間在對(duì)照及2，4，6，8，10 h未見顯著性差異，而12 h自由采食組顯著低于限制采食組(P<0.05)(圖4 A)，且兩者變化趨勢不同，自由采食組先上升后下降，限制采食組先下降后上升；角落滯留時(shí)間在對(duì)照及2，4，6，8，10 h無顯著性差異，而12 h的自由采食組顯著高于限制采食組(P<0.01)(圖4B)；四周滯留時(shí)間在對(duì)照及2，4，6，8，10，12 h未見顯著性差異(圖4 C)。

A.中心滯留時(shí)間；B.角落滯留時(shí)間；C.四周滯留時(shí)間

2.1.3站立次數(shù) 自由采食組和限制采食組小鼠站立次數(shù)在對(duì)照及2，4，6，10 h未見顯著性差異，而8 h 的自由采食組顯著低于限制采食組(P<0.05)和12 h的自由采食組顯著高于限制采食組(P<0.01)(圖5)。

2.1.4運(yùn)動(dòng)軌跡 圖6為曠場試驗(yàn)各組C57BL/6小鼠在試驗(yàn)箱中5 min內(nèi)的運(yùn)動(dòng)軌跡，從圖中可以看出，自由采食組和限制采食組小鼠在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)下的運(yùn)動(dòng)情況及在中心、角落和周邊區(qū)域內(nèi)的分布狀態(tài)，基本符合我們統(tǒng)計(jì)的結(jié)果。

圖5 曠場測試中小鼠站立次數(shù)

圖6 曠場試驗(yàn)小鼠活動(dòng)軌跡圖

2.2 環(huán)境低溫下短期禁食對(duì)C57BL/6腓腸肌中PGC-1α和ERRα表達(dá)的影響骨骼肌中β-actin受外界環(huán)境的影響會(huì)有較大的波動(dòng)，因此，將麗春紅染色作為內(nèi)參，以目的條帶的灰度值與麗春紅染色的灰度值的比值為結(jié)果。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)，自由采食組小鼠的腓腸肌PGC-1α表達(dá)在4，8 h極顯著低于限制采食組(P<0.01)，12 h差異顯著(P<0.05)。自由采食組小鼠的腓腸肌ERRα表達(dá)在4，6 h 時(shí)差異極顯著高于限制采食組(P<0.01)(圖7)。

3 討論

曠場試驗(yàn)是評(píng)價(jià)嚙齒類試驗(yàn)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)功能、探索行為和焦慮狀態(tài)的經(jīng)典行為學(xué)方法之一，其中運(yùn)動(dòng)距離、運(yùn)動(dòng)時(shí)間和靜止時(shí)間可作為評(píng)定小鼠自發(fā)運(yùn)動(dòng)的指標(biāo)；中心、角落和周邊區(qū)域滯留時(shí)間可作為評(píng)定小鼠情緒的指標(biāo)；站立次數(shù)可作為評(píng)定小鼠探索行為的指標(biāo)。自由采食組在不同冷刺激時(shí)長下C57BL/6小鼠的自發(fā)運(yùn)動(dòng)與我們的前期研究結(jié)果較為一致[14]，但與限制采食組相比并無顯著性差異，即兩者變化的趨勢相近。因此，我們認(rèn)為冷刺激對(duì)小鼠自發(fā)運(yùn)動(dòng)的影響更大，禁食對(duì)小鼠自發(fā)運(yùn)動(dòng)的影響只在更強(qiáng)的冷刺激作用下才得以表現(xiàn)的出來。至于冷刺激所引起的自發(fā)運(yùn)動(dòng)變化趨勢，我們推測4～6 h 的不同變化趨勢是機(jī)體內(nèi)相關(guān)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)介質(zhì)作用的結(jié)果，而隨著時(shí)間的推移和冷暴露程度的加強(qiáng)，機(jī)體處于穩(wěn)態(tài)超負(fù)荷狀態(tài)，最終導(dǎo)致了10～12 h的這些劇烈變化。有趣的是，除12 h冷刺激時(shí)長外，在0～10 h的不同時(shí)長冷刺激下限制采食組小鼠的自發(fā)運(yùn)動(dòng)指標(biāo)大多優(yōu)于自由采食組。這些結(jié)果完全出乎我們前期對(duì)試驗(yàn)的預(yù)測。我們查閱文獻(xiàn)后認(rèn)為動(dòng)物受到環(huán)境干擾后，下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA)激活，從而調(diào)節(jié)生理和行為[15-16]，但攝食量減少也會(huì)導(dǎo)致HPA軸活動(dòng)變化，造成皮質(zhì)醇升高，這可能是導(dǎo)致這種情況的主要原因之一。JESSE等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，雄性白冠麻雀在越冬期間禁食無論時(shí)間長短，在限制采食期間內(nèi)運(yùn)動(dòng)能力有所增強(qiáng)。與此同時(shí)，我們也推測導(dǎo)致這種情況的另一原因是限制采食導(dǎo)致小鼠處于“饑餓”狀態(tài)，從而引起其“覓食”動(dòng)機(jī)增加，導(dǎo)致覓食活動(dòng)加大，最終提高了自主運(yùn)動(dòng)。站立次數(shù)與自主運(yùn)動(dòng)相似的變化趨勢也表明了小鼠探索行為的變化有一定的可能與其自主運(yùn)動(dòng)變化有關(guān)；而小鼠在低溫環(huán)境下的“覓食”未果，又引起焦慮加劇，這又完全符合0～10 h限制采食組小鼠的焦慮樣行為高于自由采食組的趨勢；可以說這些結(jié)果都間接地支持我們的推測。至于12 h冷刺激時(shí)長下自由采食組曠場試驗(yàn)各指標(biāo)高于限制采食組，可能因?yàn)榇藭r(shí)冷刺激強(qiáng)度過大，限制采食組鼠體內(nèi)能量儲(chǔ)存不能再滿足在應(yīng)對(duì)低溫環(huán)境的能量需求[18]；但這時(shí)自由采食組由于能夠持續(xù)的攝入食物，其體內(nèi)可利用能量狀態(tài)得以改善并發(fā)揮作用[19]。因?yàn)榭沙掷m(xù)的能量攝入對(duì)于動(dòng)物機(jī)體而言確實(shí)是十分重要的[20]。其一旦受限，會(huì)使動(dòng)物生存和繁殖出現(xiàn)能量上限[21]，低溫環(huán)境下小型哺乳動(dòng)物體溫調(diào)節(jié)所需巨大的能量情況完全符合上述情形[22]。

圖7 環(huán)境低溫下短期禁食對(duì)C57BL/6腓腸肌中PGC-1α和ERRα表達(dá)的影響

PGC-1α是一種功能廣泛的協(xié)同激活因子，參與多種代謝過程，如適應(yīng)性產(chǎn)熱、葡萄糖的攝取、肝臟糖異生、肝臟脂肪酸β氧化、脂肪細(xì)胞分化、肌肉類型轉(zhuǎn)換等[23]。在棕色脂肪組織、肝臟、胰腺、腎臟、骨骼肌和心肌以及大腦中都有表達(dá)，其表達(dá)和活性受由多種信號(hào)所誘導(dǎo)[24]，如禁食能夠誘導(dǎo)肝臟中PGC-1α表達(dá)上調(diào)[25]，在運(yùn)動(dòng)或鍛煉下骨骼肌PGC-1α表達(dá)上調(diào)[26]，寒冷環(huán)境能夠誘導(dǎo)棕色脂肪組織和骨骼肌中PGC-1α表達(dá)上調(diào)[27-28]，棕色脂肪組織中PGC-1α可增加30～50倍，而骨骼肌中PGC-1α的增加需要較長時(shí)間[29]。同時(shí)，ERRα在產(chǎn)能和能量調(diào)節(jié)、線粒體功能和生物發(fā)生、發(fā)育、組織修復(fù)、缺氧和癌癥等方面具有積極作用[30]。ERRα(與共調(diào)節(jié)分子PGC-1α結(jié)合)是能量和內(nèi)平衡的連接點(diǎn)，可以促進(jìn)損傷修復(fù)和應(yīng)對(duì)應(yīng)激環(huán)境[30]。ERRα在調(diào)節(jié)棕色脂肪細(xì)胞組織線粒體氧化功能以及與相關(guān)的代謝控制中具有重要作用[31]。 Western blot結(jié)果顯示,不同冷刺激時(shí)長PGC-1α和ERRα的表達(dá)變化趨勢與曠場試驗(yàn)指標(biāo)相近，特別是PGC-1α在4，6,8 h組間存在顯著性差異，ERRα在4,6 h時(shí)2組間存在顯著性差異，這些時(shí)間點(diǎn)正是小鼠行為學(xué)產(chǎn)生特殊變化的階段，造成PGC-1α和ERRα產(chǎn)生這樣的結(jié)果除了上述的可能原因外，也可能與限制采食小鼠在面對(duì)寒冷環(huán)境時(shí)糖、脂等能量動(dòng)員與自由采食小鼠存在差異有關(guān)，即動(dòng)物機(jī)體為了應(yīng)對(duì)食物供應(yīng)的減少不得不促進(jìn)對(duì)儲(chǔ)備能量的調(diào)動(dòng)及利用[12]。但PGC-1α和ERRα在能量調(diào)控方面有著復(fù)雜的機(jī)制，其具體機(jī)制還有待我們進(jìn)一步的研究，這將作為我們接下來的研究目標(biāo)和重點(diǎn)。

綜上所述，低溫環(huán)境下禁食對(duì)C57BL/6小鼠自發(fā)運(yùn)動(dòng)未出現(xiàn)明顯影響，而對(duì)小鼠焦慮情緒、探索行為和骨骼肌中PGC-lα、ERRα表達(dá)存在不同程度的影響，相比于禁食而言，冷刺激對(duì)小鼠機(jī)體的影響更大。