謝 飛，李淑嫻，火興民，劉麗萍，李 瑞，張學(xué)鋒，王雯慧

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

T淋巴細(xì)胞簡稱為T細(xì)胞，是一類重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，可分為αβT細(xì)胞和γδT細(xì)胞2類[1]。其中，αβT細(xì)胞是參與介導(dǎo)和調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫應(yīng)答的重要組成成分，也是機(jī)體內(nèi)數(shù)量最多的T細(xì)胞亞群。跟據(jù)表面標(biāo)志物的不同，可將其進(jìn)一步分成CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞2種，雖然兩者都起源于胸腺前體細(xì)胞，但所發(fā)揮的生物學(xué)效應(yīng)有著明顯的區(qū)別[2]。CD8+T細(xì)胞作為αβT細(xì)胞的一種，在機(jī)體內(nèi)主要發(fā)揮消除腫瘤細(xì)胞和壞死組織的作用，是保護(hù)和維持機(jī)體細(xì)胞健康的“衛(wèi)士”。其活化受到雙重信號(hào)的介導(dǎo)，第1個(gè)信號(hào)是由TCR與pMHCⅠ類復(fù)合體相互識(shí)別后產(chǎn)生的，第2個(gè)信號(hào)則主要來源于其所作用的靶細(xì)胞。因此，靶細(xì)胞即是CD8+T細(xì)胞所針對(duì)的對(duì)象，也是使其開始增殖和分化的動(dòng)力。當(dāng)靶細(xì)胞受到外界感染而失去信號(hào)傳導(dǎo)的功能時(shí)，CD8+T細(xì)胞也就不能被活化，甚至還能引起疾病的發(fā)生。

家兔是我國養(yǎng)殖業(yè)中重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，也是實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常使用的試驗(yàn)動(dòng)物，在我國經(jīng)濟(jì)和科學(xué)研究領(lǐng)域具有不可替代的作用[3-5]。本試驗(yàn)選取不同年齡家兔作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，研究和描述其不同年齡、不同胃腸部位CD8+T細(xì)胞的分布規(guī)律，旨在為進(jìn)一步探討家兔胃腸道黏膜免疫提供一些資料，同時(shí)也為本課題組的相關(guān)研究提供比較性資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物30只日本大耳白兔按照幼年組(2月齡)、青年組(6月齡)、老年組(36月齡)3個(gè)年齡段分為3組，每組10只，雌雄各半。

1.2 樣品的采集采用耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉的方法處死，迅速剖檢取其胃(胃底腺區(qū)、幽門腺區(qū))、小腸(十二指腸、空腸、回腸)和大腸(盲腸、結(jié)腸、直腸 )不同部位組織，放入10%中性甲醛溶液中；按常規(guī)制作石蠟切片，進(jìn)行免疫組化染色。

1.3 免疫組織化學(xué)染色采用SABC免疫組織化學(xué)的染色方法，依次將切片放入二甲苯、苯酒精、100%酒精、95%酒精和80%酒精中，再經(jīng)H2O2滅活、抗原修復(fù)、BSA封閉、一抗(羊抗鼠CD8多克隆抗體，購于SANTA CRUZ)和二抗孵育(生物素化的驢抗羊IgG，購于博奧森)、DAB顯色、復(fù)染、脫水和透明等過程，最后封片并進(jìn)行顯微鏡觀察、照相。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法用OlympusDP-71顯微鏡觀察組織切片并拍照。每個(gè)年齡段從胃到直腸各個(gè)部位的組織樣品隨機(jī)取5張切片，每張切片隨機(jī)選10個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)單位面積內(nèi)陽性細(xì)胞的數(shù)量。采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，差異顯著性檢驗(yàn)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05判斷為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 CD8+T細(xì)胞在胃中分布的特征

2.1.1CD8+T細(xì)胞在胃中分布的位置 呈色反應(yīng)陽性的CD8+T細(xì)胞為棕黃色，呈圓形或不規(guī)則形，主要位于胃的固有層中并沿黏膜肌層進(jìn)行分布。有時(shí)在固有層的胃腺間也可見到散在的CD8+T細(xì)胞，但數(shù)量較少(圖1)。

A．CD8+T細(xì)胞在胃底腺區(qū)的分布情況(40×)；C.CD8+T細(xì)胞在幽門腺區(qū)的分布情況(40×);B,D.分別為A、C的局部放大(100×)。黑色箭頭.陽性細(xì)胞。下同

2.1.2CD8+T細(xì)胞在胃中分布的數(shù)量變化 統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，CD8+T細(xì)胞在幽門腺區(qū)和胃底腺區(qū)處分布的數(shù)量無顯著性差異(P>0.05)，但在不同年齡組中，青年組CD8+T細(xì)胞的分布數(shù)量要顯著高于幼年組和老年組(P<0.05),而幼年組和老年組之間CD8+T細(xì)胞的數(shù)量差異并不顯著(P>0.05)(表1,圖2)。

表1 不同年齡組家兔胃中CD8+T細(xì)胞分布的數(shù)量差異

圖2 不同年齡組家兔胃中CD8+T細(xì)胞分布的數(shù)量變化趨勢

2.2 CD8+T細(xì)胞在小腸中分布的特征

2.2.1CD8+T細(xì)胞在小腸中分布的位置 CD8+T細(xì)胞為棕黃色，呈圓形或橢圓形，主要分布于小腸各段的固有層和隱窩處，其余部位未見有CD8+T細(xì)胞的存在(圖3～5)。

A.CD8+T細(xì)胞在十二指腸腸絨毛不同區(qū)域內(nèi)的分布情況(40×);B,C.分別為a、b的局部放大(100×);D，E.為陰性對(duì)照(100×)

A.CD8+T細(xì)胞在空腸腸絨毛不同區(qū)域內(nèi)的分布情況(40×)；B,C.分別為a、b的局部放大(100×)；D，E.陰性對(duì)照(100×)

A.CD8+T細(xì)胞在回腸腸絨毛不同區(qū)域內(nèi)的分布情況(40×);B,C.分別為a、b的局部放大(100×)；D,E.陰性對(duì)照(100×)

2.2.2CD8+T細(xì)胞在小腸中分布的數(shù)量變化 統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，相同年齡組內(nèi)，小腸CD8+T細(xì)胞分布的數(shù)量差異并不顯著(P>0.05)；不同年齡組間，青年組各腸段內(nèi)CD8+T細(xì)胞的分布數(shù)量顯著高于幼年組和老年組，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而幼年組和老年組之間的差異并不顯著(P>0.05)(表2，圖6)。

表2 不同年齡組家兔小腸各段CD8+T細(xì)胞分布的數(shù)量差異

2.3 CD8+T細(xì)胞在大腸中分布特征

2.3.1CD8+T細(xì)胞在大腸中分布位置 CD8+T細(xì)胞為棕黃色，呈圓形或橢圓形，主要分布在盲腸、結(jié)腸以及直腸的固有層和隱窩處，在黏膜下層、肌層以及漿膜層均未見有陽性細(xì)胞的分布(圖7，8，9)。

2.3.2CD8+T細(xì)胞在大腸中分布的數(shù)量變化 統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，相同年齡組內(nèi)，CD8+T細(xì)胞在盲腸、結(jié)腸以及直腸的數(shù)量差異并不顯著(P>0.05)；青年組CD8+T細(xì)胞的數(shù)量顯著高于老年組和幼年組，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；老年組和幼年組之間CD8+T的數(shù)量差異并不顯著(P>0.05)(表3,圖10)。

圖6 不同年齡組家兔小腸各段CD8+T細(xì)胞分布的數(shù)量變化趨勢

A.陽性細(xì)胞(40×);B.a的局部放大(100×);C.陰性對(duì)照(100×)

A.陽性細(xì)胞(100×);B.陰性對(duì)照(100×);黑色箭頭所示為陽性細(xì)胞

A.陽性細(xì)胞(40×);B.A的局部放大(100×);黑色箭頭所示為陽性細(xì)胞

表3 不同年齡組家兔大腸各段CD8+T細(xì)胞分布的數(shù)量差異

圖10 不同年齡組家兔大腸各段CD8+ T細(xì)胞分布的數(shù)量變化趨勢

3 討論

胃腸道不僅是體內(nèi)最大的消化器官，同時(shí)也是外界病原侵襲和感染的主要部位[6]。有資料表明[7-8]，每8～10個(gè)腸上皮細(xì)胞之間就有一個(gè)上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(IEL)的存在，主要由CD8+T細(xì)胞組成，起局部黏膜免疫的作用。因此，CD8+T細(xì)胞是小腸上皮內(nèi)數(shù)量最多的T細(xì)胞亞群，也是腸相關(guān)淋巴組織的重要組成成分，在機(jī)體抵御外界病原菌感染的過程中發(fā)揮著重要的作用。

雖然家兔是一種常見的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，但對(duì)其胃腸道CD8+T細(xì)胞分布的特征卻知之甚少[9-10]。本試驗(yàn)通過對(duì)不同年齡組家兔胃腸道CD8+T細(xì)胞進(jìn)行定位和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得出以下結(jié)論：從家兔年齡來看，相同年齡組家兔之間CD8+T細(xì)胞的數(shù)量差異并不顯著(P>0.05)，而不同年齡組家兔之間,青年組CD8+T細(xì)胞的數(shù)量顯著高于老年組和幼年組，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。老年組CD8+T細(xì)胞的數(shù)量和幼年組相比差異并不顯著(P>0.05)，表明CD8+T細(xì)胞的數(shù)量隨著年齡的變化呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢性變化。這與吳永堅(jiān)[11]和李銘德[12]的研究結(jié)果相符，說明CD8+T細(xì)胞在人和家兔胃腸道內(nèi)的數(shù)量隨著年齡的變化有相同的趨勢，都隨著年齡的增長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢性變化。導(dǎo)致這種趨勢性變化的原因有很多，但胸腺的發(fā)育及退化可能是其最為重要的原因之一。這不僅拓展了CD8+T細(xì)胞在胃腸道分布的理論基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步研究胃腸道相關(guān)性疾病提供了科學(xué)依據(jù)[13]。從分布的位置來看，本試驗(yàn)CD8+T細(xì)胞在胃底腺區(qū)和幽門腺區(qū)分布的位置完全相同，都位于固有層中。而小腸和大腸中CD8+T細(xì)胞的分布位置相同，都分布于腸道各段的固有層中，在隱窩處也有散在分布。這與莫修建等[14]的研究結(jié)果比較符合，說明腸道上皮和固有層是CD8+T細(xì)胞的主要定植部位，也是其發(fā)揮功能的主要場所。從分布的數(shù)量來看，CD8+T細(xì)胞在各腸段之間分布的數(shù)量無明顯的差異，但在小腸與大腸內(nèi)分布的數(shù)量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其分布的總量按照小腸、大腸、胃的順序依次遞減。但張永東等[15]在其研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)CD8+IEL的分布數(shù)量沿腸道依次遞減,而CD8+LPL的分布數(shù)量則沿腸道依次遞增。綜合分析，可以做出以下推斷：CD8+T細(xì)胞在胃腸道內(nèi)分布的總量和CD8+IEL分布的趨勢變化一致，都沿腸道依次遞減，而CD8+LPL的分布數(shù)量則沿腸道依次遞增。引起這種趨勢性變化的原因很有可能與腸道不同部位的功能有關(guān)。小腸是機(jī)體內(nèi)進(jìn)行物質(zhì)交換的主要場所，也是最易受到病原感染的部位，對(duì)整個(gè)機(jī)體的健康具有十分重要的意義。因此，CD8+T細(xì)胞選擇性的大量定植于此，確保了腸道的完整和健康，從而為整個(gè)機(jī)體的健康保駕護(hù)航。同時(shí)，IEL作為腸道上皮內(nèi)重要的免疫細(xì)胞之一，是離外界病原菌最近的部位，同時(shí)也是腸道免疫應(yīng)答中的第一梯隊(duì)，因此，CD8+T細(xì)胞在IEL內(nèi)聚集，可以在最短的時(shí)間內(nèi)與病原菌結(jié)合并發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，體現(xiàn)了機(jī)體免疫調(diào)節(jié)的精密性和可操作性。而CD8+LPL的分布趨勢原因亦是如此[16]。