火興民，李淑賢，王雯慧

(甘肅農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730070)

作為與外部環(huán)境接觸最為密切的機體內(nèi)表面，胃腸道在承擔著消化吸收功能的同時，還要時刻警惕來源于機體外部環(huán)境的病原菌入侵，當覺察到危險時要迅速地做出反應(yīng)發(fā)動黏膜免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫保護[1]。在黏膜的免疫保護反應(yīng)中，T細胞是參與其中的一類重要的免疫細胞[2]，其中T細胞亞群中的CD4+T細胞在維持腸道內(nèi)部環(huán)境的穩(wěn)定和保護腸黏膜免受致病微生物侵害的過程中發(fā)揮主要的作用，這也使得CD4+T細胞在腸道固有層T細胞總數(shù)中占比較大，超過了50%以上[3]。T淋巴細胞依照其組成表面抗原受體的2條異二聚體的不同，可以分類為T細胞和T細胞，T細胞依據(jù)其表面另一類具有在抗原識別過程中發(fā)揮協(xié)助功能的分子的差異，進一步被分為CD4+T細胞和CD8+T細胞。CD4+T細胞為輔助性T細胞[4]，CD4分子是單次跨膜的單鏈糖蛋白，通過與專職攝取加工呈遞抗原的細胞外部MHCⅡ類分子特異性結(jié)合從而參與到TCR對抗原的識別的過程中[5]。

CD4+T細胞通過分泌細胞因子調(diào)節(jié)B細胞產(chǎn)生免疫球蛋白，召集白細胞抵達感染和炎癥部位，并且調(diào)動其他T細胞發(fā)揮相應(yīng)的效應(yīng)功能，以及促進巨噬細胞的活性等方面發(fā)揮積極的作用[6]。有研究表明，當CD4+T細胞在腸內(nèi)出現(xiàn)大量聚集的狀態(tài)時，是炎癥性腸病(IBD)發(fā)生的典型表現(xiàn)之一,這種異常聚集的現(xiàn)象不僅是疾病發(fā)生時的組織病理表現(xiàn)，同時也有可能是導(dǎo)致IBD發(fā)生的直接原因[7]。CD4+T細胞發(fā)揮適度的功能是維持機體健康的前提，自體防御系統(tǒng)發(fā)生異常而引發(fā)的疾病往往就是因為反應(yīng)過于劇烈造成的不良后果，反應(yīng)太弱則會面臨感染和炎癥的風險[8]。

有學者對人和兔腸黏膜相關(guān)淋巴組織(GALT)特征進行了研究比較，發(fā)現(xiàn)GALT結(jié)構(gòu)在人與兔之間擁有很高的相似度，因此對兔消化道黏膜免疫的研究可為人醫(yī)臨床中腸相關(guān)疾病的研究提供可參考的資料[9]。

1 材料與方法

1.1 實驗動物30只白兔市購，按不同年齡歸類為幼年組(2月齡)、青年組(6月齡)和老年組(36月齡)，每組5只雌性、5只雄性。

1.2 樣本采集使用0.1 mL/kg戊巴比妥鈉經(jīng)耳緣靜脈注射后致死白兔，取胃、小腸、大腸并浸泡在固定液中。

1.3 染色切片脫蠟后，依次滴入30% H2O2，0.1% 胰蛋白酶，5% BSA封閉液，一抗Anti-CD4抗體[KEN4](ab194998，Abcam)，二抗驢抗羊IgG(博奧森),SABC試劑，DAB顯色液，之后蘇木精輕度復(fù)染，脫水，透明，封片，觀察。

1.4 統(tǒng)計方法從各組各部位染色后的切片中任意挑選5個樣本，每個樣本隨機挑選10個視野，計算單位面積CD4陽性細胞的數(shù)目。應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件計算，獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 CD4+T細胞在胃中的分布特征

2.1.1CD4+T細胞在胃中的定位 大多數(shù)CD4+T細胞定位在黏膜肌層周圍，胃腺之間偶爾可見分布，但數(shù)量較少(圖1，2)。

A1.為局部放大后CD4+T細胞在胃底腺區(qū)的分布情況，箭頭所示為CD4+細胞；A2.陰性對照

B1.為局部放大后CD4+T細胞在幽門腺區(qū)的分布情況，箭頭所示為CD4+細胞；B2.陰性對照

2.1.2CD4+T細胞在胃中的數(shù)量變化 胃底腺區(qū)的陽性細胞數(shù)目明顯少于幽門腺區(qū)。各部位的陽性細胞數(shù)目隨著年齡增長呈現(xiàn)先增后減的趨勢(表1，圖3)。

表1 胃CD4+ T細胞數(shù)量統(tǒng)計

2.2 CD4+T細胞在小腸中的分布特征

2.2.1CD4+T細胞在小腸中的定位 CD4+T細胞的基本形態(tài)主要為圓形或橢圓形。CD4+T細胞大多定位于固有層中，且絨毛固有層中分布較多(圖4～6)。

圖3 胃中CD4+ T細胞數(shù)量隨年齡變化趨勢

C1,C2.CD4+ T細胞在十二指腸腸絨毛不同部位的定位情況，箭頭指向的是CD4+細胞；C3,C4.陰性對照

D1,D2.CD4+ T細胞在空腸腸絨毛不同部位的定位情況，箭頭指向的是CD4+細胞；D3,D4.陰性對照

E1,E2.CD4+ T細胞在回腸腸絨毛不同部位的定位情況，箭頭指向的是CD4+細胞；E3,E4.陰性對照

2.2.2CD4+T細胞在小腸中的數(shù)量變化 小腸不同部位CD4+T細胞數(shù)目無明顯的差異，由十二指腸到回腸表現(xiàn)為小幅遞增。小腸各段的陽性細胞數(shù)量隨年齡的增長表現(xiàn)出先增后減的變化趨勢(表2,圖7)。

表2 小腸CD4+ T細胞數(shù)量統(tǒng)計

圖7 小腸CD4+ T細胞數(shù)量隨年齡變化趨勢

2.3 CD4+T細胞在大腸中的分布特征

2.3.1CD4+T細胞在大腸中的定位 CD4+T細胞主要定位于大腸黏膜固有層中(圖8～10)。

2.3.2CD4+T細胞在大腸中的數(shù)量變化 大腸不同部位CD4+T細胞數(shù)量差距不明顯，由前段向后段小幅度遞減。CD4+T細胞的數(shù)量隨月齡增加表現(xiàn)為先增后減的變化趨勢，而2月齡組與36月組齡未見明顯差異(表3,圖11)。

F1.陽性細胞在盲腸的定位情況，箭頭指向的是CD4+細胞；F2.陰性對照

3 討論

本試驗結(jié)果顯示，CD4+T細胞在胃底腺區(qū)的定位數(shù)量要明顯低于幽門腺區(qū)。胃底腺區(qū)有大量的主細胞，由它分泌的鹽酸不僅幫助消化食物，而且還可以殺滅隨著食物進入到胃中的病原微生物，同時胃酸可以在胃底腺區(qū)黏膜表面形成一層屏障，可有效的隔絕病原與黏膜接觸。幽門腺區(qū)缺乏主細胞，因此是鹽酸形成保護屏障的非優(yōu)勢區(qū)域，而食物在經(jīng)過幽門進入小腸時可與黏膜充分接觸，增加了黏膜暴露于有害因子中的風險，所以這一區(qū)域需要較多數(shù)量的CD4+T細胞參與免疫保護反應(yīng)，這可能是胃底與幽門部CD4+T細胞數(shù)量出現(xiàn)差異的原因之一。

G1,G2.CD4+ T細胞在結(jié)腸不同部位的定位情況，箭頭指向的是CD4+細胞；G3,G4.陰性對照

H1,H2.CD4+ T細胞在回腸腸絨毛不同部位的定位情況，箭頭指向的是CD4+細胞；H3,H4.陰性對照

表3 大腸CD4+ T細胞數(shù)量統(tǒng)計

CD4+T細胞在腸道中主要分布于固有層中，固有層是T細胞發(fā)揮功能的主要部位，效應(yīng)部位的幼稚T細胞受到抗原刺激后迅速發(fā)生分化和增殖，之后轉(zhuǎn)移到固有層等部位參與保護反應(yīng)，研究中發(fā)現(xiàn)陽性細胞尤其在腸絨毛固有層中表現(xiàn)聚集性的分布，這與腸絨毛負責營養(yǎng)物質(zhì)吸收功能而與腸內(nèi)容物緊密接觸相關(guān)，食靡中的病原可能會對絨毛上皮完整性造成破壞，所以有較多的T細胞存在于這一區(qū)域及時參與免疫保護。小腸各部分CD4+T細胞分布數(shù)量的變化與對大鼠和小鼠的研究結(jié)果吻合，均呈現(xiàn)由小腸前段到后段的小幅度遞增[10]。在腸道中與宿主共同生活的微生物群落與免疫系統(tǒng)息息相關(guān)[11]，它們在免疫系統(tǒng)的發(fā)育成熟和功能發(fā)揮以及其他調(diào)節(jié)機體正常生理功能方面起著直接或間接的作用[12]，據(jù)此猜測CD4+T細胞在小腸中呈現(xiàn)如此的分布變化可能與定殖于小腸各部分黏膜表面的微生物群落的數(shù)量有很大程度的關(guān)聯(lián)，而且年齡、飲食等因素也在影響著微生物群落的構(gòu)成[13-14]，從而間接影響CD4+T細胞的分布，這也是為什么家兔陽性細胞的分布隨年齡變化出現(xiàn)差異的原因之一。有人對腸道中的菌群分布特點進行研究后發(fā)現(xiàn)，腸道中大多數(shù)的菌群主要定殖于小腸后段和大腸前段，小腸中除了后段以外的其余部分普遍表現(xiàn)出較低的菌群豐度[15]，這一結(jié)果更加印證了先前的猜測，微生物群落定殖數(shù)量直接影響著CD4+T細胞分布數(shù)量。此外，資料證實小腸中巨噬細胞數(shù)量的變化趨勢由前段到后段表現(xiàn)為逐漸遞增，這與CD4+T細胞的分布變化特點相同，這是因為巨噬細胞的活力增強受CD4+T細胞所分泌的細胞因子的調(diào)控[16]，因此出現(xiàn)了這種相伴分布的狀態(tài)。腸道各部位CD4+T細胞數(shù)量隨年齡增長表現(xiàn)出先增后減的變化趨勢，和小鼠GALT增齡性變化相符[17]。目前，生理衰老對CD4+T細胞表型和功能影響的研究有限，但是衰老在腸黏膜上皮屏障完整性缺失的過程中起到了推動作用，同時也是對腸道病原微生物防御能力下降的一個因素，老年動物受此影響，遭受疾病侵擾的風險增加。

圖10 大腸CD4+ T細胞數(shù)量隨年齡變化趨勢