谷長(zhǎng)維，胡 博，2*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 特產(chǎn)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130112;2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部經(jīng)濟(jì)動(dòng)物疫病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130112)

光動(dòng)力失活(photodynamic inactivation,PDI)可用于殺滅病原微生物，包括細(xì)菌、病毒、真菌和原生動(dòng)物[1-3]，這些對(duì)于病毒相關(guān)病變的治療[4]、水的消毒[5]、血液制品處理[6]具有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。PDI技術(shù)是將微生物暴露在光敏劑中，在光敏劑相對(duì)應(yīng)的特定吸收波長(zhǎng)下，進(jìn)行激光照射，使微生物吸收的光敏劑受到激發(fā)，激發(fā)態(tài)的光敏劑又把能量傳遞給周圍的氧，生成活性很強(qiáng)的單態(tài)氧，單態(tài)氧和相鄰的生物大分子發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，導(dǎo)致病原微生物失活。

包膜病毒(如流感病毒、免疫缺陷病毒、單純皰疹病毒等)可被多種光敏劑失活，包括亞甲藍(lán)[7]、花青素540[8]、金絲桃素、玫瑰紅[9]、卟啉[10]和酞菁[11-12]等。盡管所有的病毒成分都可以作為活性氧(reactive oxygen species，ROS)的潛在分子靶點(diǎn)，但最容易受到損傷的是病毒包膜中的蛋白質(zhì)和不飽和脂肪[ 13]。COSTA 等[14]認(rèn)為光動(dòng)力破壞哺乳動(dòng)物病毒薄膜的主要類型包括：改變蛋白質(zhì)交聯(lián)，蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化、相對(duì)分子質(zhì)量和電荷的改變。這些病毒粒子的損傷形式可以阻止病毒的吸附和對(duì)宿主的滲透，進(jìn)而抑制膜融合，降低感染性。病毒失活的速率取決于光敏劑濃度、單線態(tài)氧的產(chǎn)率以及激光照射參數(shù)[9,14]。ZARUBAEV等[15]研究表明，尿囊液中用 0.5 g/L光敏劑、5 h激光照射可使H1N1流感病毒表面糖蛋白損失和細(xì)胞膜分裂；然而病毒是否因?yàn)樘堑鞍讚p失和病毒膜氧化破壞而失活，目前尚不清楚。同時(shí)，在尿囊液長(zhǎng)時(shí)間激光照射是否會(huì)引起其他不良反應(yīng)尚未確定。本試驗(yàn)用不同濃度(2，4 μmol/L)光敏劑A01，激光照射20 min進(jìn)行光動(dòng)力失活高致病性H9N2流感病毒，通過(guò)電鏡對(duì)流感病毒的相關(guān)形態(tài)學(xué)的變化進(jìn)行觀察。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器超濾濃縮離心管，購(gòu)自Sartorius；細(xì)胞培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清均購(gòu)自GIBCO；光敏劑A01購(gòu)自常熟吉化有限公司，純度大于95%(高效液相色譜檢測(cè))，綠色粉末；激光器購(gòu)自南京來(lái)創(chuàng)激光科技有限公司。

1.2 病毒的產(chǎn)生和純化A型鴨流感病毒/家鴨/蘇州/103/2015 (H9N2)接種10日齡的雞胚。37℃孵育3 d后，收獲尿囊液儲(chǔ)存-80℃?zhèn)溆?。所有的H9N2流感病毒試驗(yàn)都按照BSL3實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程不包括純化步驟，只是嘗試觀察PDI對(duì)非純化的尿囊液的影響。由于尿囊液含有高濃度的蛋白質(zhì)和其他生物分子，可能掩蓋了病毒顆粒。將尿囊液通過(guò)一個(gè)0.22 μm的過(guò)濾器過(guò)濾，PBS稀釋5倍，裝入超濾濃縮離心管(“Vivaspin 6”MWCO 300 kDa)混懸，4 000×g離心5 min，PBS加到6 mL，收集混懸液，以上步驟重復(fù)5次。第5次離心后，從濃縮器中收集懸浮液(大約每管1 mL分裝)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和病毒滴定37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)MDCK細(xì)胞，病毒接種后，細(xì)胞培養(yǎng)要補(bǔ)充0.2% 的牛血清白蛋白、50 mg/L的慶大霉素和2 mg/L 的胰酶。試驗(yàn)中設(shè)沒(méi)有感染病毒的細(xì)胞作為對(duì)照。當(dāng)96孔板中的MDCK細(xì)胞生長(zhǎng)到90%融合時(shí)進(jìn)行病毒滴定。首先用PBS洗滌細(xì)胞，病毒進(jìn)行10倍系列稀釋(10-1～10-8)后感染MDCK細(xì)胞，37℃孵育30 min，棄掉上清，加200 μL的病毒生長(zhǎng)培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)5 d。病毒滴度測(cè)定采用TCID50法。為防止樣品(包括光敏劑)意外照射，96孔板用錫箔紙包裹。

1.4 光動(dòng)力失活光敏劑A01給藥濃度設(shè)置為 2，4 μmol/L，分別加入到2瓶病毒懸液中進(jìn)行失活，每瓶1 mL。激光照射劑量均為12 J/cm2，照射時(shí)間20 min，測(cè)量的電表容量是10 MW/cm2。裝有病毒懸浮液的小瓶隨后被放入一個(gè)裝滿水的塑料盒中，以防止過(guò)熱。此外，設(shè)置2個(gè)對(duì)照治療組：暗(光敏劑在黑暗中孵育)和激光(沒(méi)有光敏劑照射)組。

1.5 電鏡成像將病毒懸液滴加到覆蓋有Formvar膜的200目銅網(wǎng)上，吸附5 min，然后用濾紙將銅網(wǎng)上的病毒懸液吸去，待Formvar膜干燥后滴加 20 g/L磷酸鎢進(jìn)行負(fù)染，染色時(shí)間1 min，然后用濾紙將磷酸鎢吸干，待銅網(wǎng)干燥后，用JEM-1400 電鏡進(jìn)行觀察。所有的樣品制備都在黑暗的房間進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 純化和非純化尿囊液電鏡檢測(cè)結(jié)果加有2 μmol/L 光敏劑未純化的尿囊液，很難觀察到任何結(jié)構(gòu)變化，這可能是因?yàn)槟蚰乙豪锖懈邼舛鹊鞍踪|(zhì)和其他生物分子掩蓋病毒粒子。然而對(duì)于純化的尿囊液，電鏡照片顯示大大提高了病毒粒子結(jié)構(gòu)的可見(jiàn)性，并且病毒粒子呈典型的流感病毒形態(tài)，直徑100～130 nm(圖1)。基于病毒濃度純化技術(shù)和經(jīng)典的超速離心法病毒純化技術(shù)相比較，本試驗(yàn)使用方法既快又容易。因此，非純化的尿囊液不能用于光動(dòng)力失活后的流感病毒超微結(jié)構(gòu)檢查，一定需要純化的病毒懸液，才能精確的可視化。

A.比例尺200 nm;B.100 nm

2.2 H9N2流感病毒光動(dòng)力失活電鏡檢測(cè)結(jié)果用透射電鏡對(duì)5個(gè)不同條件處理的H9N2流感病毒進(jìn)行觀察，結(jié)果表明沒(méi)有處理的病毒(圖1)、光對(duì)照組病毒(圖2)和暗對(duì)照組病毒(圖3)之間，病毒在形態(tài)學(xué)上沒(méi)有差異。用2 μmol/L光敏劑失活的病毒粒子保持正常的近球形形狀，其膜結(jié)構(gòu)保持了較好的完整性，但病毒粒子表面變的“光禿”，病毒粒子表面被涂上了一層“光環(huán)”，這可能意味著病毒粒子表面膜糖蛋白受到了不完全的氧化破壞(圖4)。用4 μmol/L光敏劑失活后的病毒懸液中包含3種形式的“禿”病毒粒子：光滑球形病毒顆粒(25%)，膜結(jié)構(gòu)部分破壞的病毒粒子(60%)，細(xì)胞膜完全破壞的病毒粒子(15%)(圖5，6)，表明經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間用高濃度光敏劑激光照射可破壞所有的病毒粒子。

圖2 光對(duì)照組(未加光敏劑的激光照射組)

圖3 暗對(duì)照組(光敏劑濃度4 μmol/L，未激光照射)

2.3 H9N2流感病毒光動(dòng)力失活感染性檢測(cè)結(jié)果不同條件處理的H9N2流感病毒采用MDCK細(xì)胞測(cè)定滴度，結(jié)果如表1所示，沒(méi)有經(jīng)過(guò)純化處理的病毒滴度和對(duì)照相近，而含有2種濃度光敏劑的病毒樣品經(jīng)激光照射后，均達(dá)到完全失活。

3 討論

本試驗(yàn)考察了PDI后H9N2流感病毒的超微結(jié)構(gòu)屬性，論證了PDI誘導(dǎo)病毒粒子失去表面糖蛋白，甚至破壞病毒粒子表面膜結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致病毒粒子喪失感染性。由于蛋白質(zhì)很容易被單線態(tài)氧所氧化[13]，H9N2流感病毒膜表面的血凝素糖蛋白、神經(jīng)氨酸酶糖蛋白易受到PDI產(chǎn)生的單線態(tài)氧的影響。此外，對(duì)PDI導(dǎo)致病毒膜結(jié)構(gòu)損傷的另一種解釋是：PDI所產(chǎn)生的膽固醇的氫過(guò)氧化物可破壞其他脂質(zhì)[16]?？偟膩?lái)說(shuō)，4 μmol/L光敏劑(A01)激光照射后出現(xiàn)的3種不同損害形態(tài)的病毒粒子均是由病毒粒子受PDI引起的，其感染性亦完全喪失；而2 μmol/L 光敏劑(A01)激光照射組出現(xiàn)的“光禿”樣病毒粒子雖然具有較為完整的膜結(jié)構(gòu)，但是其病毒粒子缺乏感染性，同時(shí)無(wú)法觀察到流感病毒表面的血凝素糖蛋白、神經(jīng)氨酸酶糖蛋白，病毒粒子表面被涂上了一層“光環(huán)”。在本研究中，光敏劑A01(2，4 μmol/L)的處理激光照射H9N2流感病毒20 min可有效失活流感病毒，同時(shí)研究表明在其他參數(shù)相同的條件下，光敏劑對(duì)病毒粒子膜結(jié)構(gòu)的破壞隨光敏劑濃度的提高而逐漸加劇，即呈現(xiàn)正相關(guān)。事實(shí)上，在黑暗中化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的高活性ROS[17]和免疫細(xì)胞在氧化過(guò)程中[18]也表現(xiàn)出殺死病毒的性能，產(chǎn)物可攻擊病毒粒子的膜蛋白和不飽和脂質(zhì)，從而引起膜蛋白的光氧化，導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)的損傷。

A.球形囊泡S表示球形囊泡；B，C.病毒粒子表面有類似球形囊泡樣結(jié)構(gòu)；V表示保持結(jié)構(gòu)完整性的病毒粒子；箭頭所示光環(huán)可能存在糖蛋白

A.比例尺1 μm，黑框區(qū)域?yàn)榉糯髤^(qū)域；B.比例尺200 nm，“3”表示光滑的球形病毒粒子，“1”和“2” 箭頭表示病毒粒子的膜結(jié)構(gòu)部分受到破壞

A1～A3.膜結(jié)構(gòu)保持完整，膜損傷輕微，箭頭標(biāo)記；B1～B3.部分病毒粒子膜被破壞；C1～C3.膜被破壞，病毒粒子解體

表1 MDCK細(xì)胞病毒滴定法測(cè)定病毒滴度

經(jīng)光敏劑處理的病毒電鏡觀察結(jié)果表明，處理后光失活流感病毒粒子發(fā)生不同程度破裂，對(duì)照組病毒粒子完好無(wú)損，這些結(jié)果為光敏劑導(dǎo)致病毒光失活提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。從電鏡觀察光敏劑失活的病毒脂膜發(fā)生破損，推測(cè)本病毒光敏失活的可能機(jī)制是由光敏劑A01同流感病毒脂蛋白囊膜的親水區(qū)結(jié)合，經(jīng)光照射后，光敏劑被激發(fā)到三線態(tài)，然后與基態(tài)氧作用產(chǎn)生激發(fā)態(tài)單線態(tài)氧分子，對(duì)流感病毒囊膜造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷。