辛旭，吳香菊，齊靜，王永志，李相安，杜正國(guó)，單虎，杜以軍*

(1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266000；2. 山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100；3. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東 濟(jì)南 250100；4. 濟(jì)南護(hù)理職業(yè)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250100；5. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海都學(xué)院，山東 萊陽(yáng) 265200；6. 沂水縣畜牧局姚店子畜牧獸醫(yī)工作站，山東 沂水 276400)

口蹄疫(foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是一類在偶蹄目動(dòng)物之間傳播的嚴(yán)重疾病，傳播速度快，危害嚴(yán)重，被世界各國(guó)廣泛重視[1]?？谔阋卟《?foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)共有O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2、SAT3等7個(gè)血清型，不同型病毒的血清之間無(wú)交叉保護(hù)[2]。目前全球各國(guó)對(duì)該病的防控方法主要是注射疫苗, 在暴發(fā)口蹄疫時(shí)，歐盟規(guī)定，可進(jìn)行疫苗的緊急接種[3]。

口蹄疫病毒主要有8個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(L、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D)，其中一些非結(jié)構(gòu)蛋白具有免疫原性，3B蛋白便是其中之一[4]。3B蛋白也稱Vpg蛋白，共有3種不同的3B蛋白(3B1、3B2、3B3)，分別由口蹄疫病毒基因組中的P3編碼區(qū)里3個(gè)相連的基因編碼，此現(xiàn)象在RNA病毒中比較少見(jiàn)[5]。目前對(duì)于3B蛋白的功能研究已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展，由于3B蛋白有pUpU結(jié)構(gòu)，故可與新合成的子代RNA相連，在病毒RNA復(fù)制合成時(shí)可以起引物的作用[6-7]。

本研究通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)口蹄疫病毒的3B蛋白并進(jìn)行純化，再多次免疫試驗(yàn)動(dòng)物，制備針對(duì)3B蛋白的多克隆抗體并進(jìn)行鑒定，為3B蛋白的相關(guān)研究提供了重要的材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

體重約2 kg的新西蘭大白兔購(gòu)自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑

載體pET28a、pXJ-3B質(zhì)粒、HEK-293T細(xì)胞及HeLa細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司；Millipore超濾濃縮管購(gòu)自密理博(中國(guó))有限公司；dNTP、PrimeSTAR?HS DNA Polymerase、DL5000 DNA Marker購(gòu)自TaKaRa生物公司；Lipofectamine?2000 Reagent、Alexa Fluor 594標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自Invitrogen公司；Co-IP及Western blot細(xì)胞裂解液、PMSF購(gòu)自碧云天公司；XhoⅠ、BamHⅠ等限制性核酸內(nèi)切酶以及T4 DNA連接酶均購(gòu)自Thermo公司；Supersignal?West Pico Trial Kit化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自Pierce公司；羊抗兔IgG抗體購(gòu)自Abcam(中國(guó))有限公司；β-actin抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自北京天根生物有限公司。

1.3 PCR引物的設(shè)計(jì)與合成

由O型口蹄疫病毒在GenBank中公布的3B基因序列以及pET28a載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)酶切位點(diǎn)，利用分子生物學(xué)軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)了1對(duì)用于擴(kuò)增3B基因的特異性引物：F-pET28a-3B-BamHⅠ和R-pET28a-3B-XhoⅠ。序列如下所示：

F-pET28a-3B-BamHⅠ：5′-CGCGGATCCATGGGACCCTACACCGGT-3′；

R-pET28a-3B-XhoⅠ：5′-CCGCTCGAGCTATTACTCAGTGACAATCAA-3′。

2條引物F-pET28a-3B-BamHⅠ和R-pET28a-3B-XhoⅠ橫跨3B蛋白的整個(gè)蛋白編碼區(qū)，其中上游引物5′端引入酶切位點(diǎn)BamHⅠ，下游引物5′端引入酶切位點(diǎn)XhoⅠ，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為231 bp。

1.4 3B基因的PCR擴(kuò)增及膠回收純化

以pXJ-3B質(zhì)粒為PCR模板，用F-pET28a-3B-BamHⅠ和R-pET28a-3B-XhoⅠ為引物擴(kuò)增3B基因，PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃終末延伸10 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，將目的條帶用膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收。

1.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

將回收純化的3B基因及pET28a載體分別用BamHⅠ/XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳并膠回收純化，回收產(chǎn)物在T4 DNA連接酶的作用下，16 ℃過(guò)夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，具體步驟按DH5α感受態(tài)細(xì)胞的操作說(shuō)明書進(jìn)行。挑取LB固體培養(yǎng)基上的形成的單菌落，將其接種于含卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下培養(yǎng)過(guò)夜。第2天提取菌液中的質(zhì)粒，具體步驟按質(zhì)粒小提試劑盒的操作說(shuō)明書進(jìn)行。用BamHⅠ、XhoⅠ2種酶進(jìn)行雙酶切鑒定，將最終檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的質(zhì)粒送生物公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒命名為pET28a-3B。

1.6 3B蛋白的表達(dá)與純化

將pET28a-3B重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，置37 ℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)，第2天挑取單菌落接種到含卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中。置搖床中過(guò)夜培養(yǎng)。將菌液轉(zhuǎn)接入含卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，OD600=0.6～0.8時(shí)，向菌液中加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，16 ℃過(guò)夜誘導(dǎo)。第2天將菌液4℃離心，棄上清用，PBS溶液重懸后再離心，棄上清，用重懸液重懸后置超生波儀進(jìn)行超聲破碎，離心后上清和沉淀分別取適量樣品，剩余上清經(jīng)過(guò)Ni-NTA純化，取樣。用Millipore超濾管進(jìn)一步純化濃縮，取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析，用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。

1.7 3B重組蛋白的動(dòng)物免疫

將重組蛋白與等量的弗氏完全佐劑混合進(jìn)行乳化，取試驗(yàn)動(dòng)物新西蘭大白兔，將混合的液體注射于其背部皮下。2周后進(jìn)行第1次加強(qiáng)免疫，再經(jīng)過(guò)兩周后進(jìn)行第2次加強(qiáng)免疫。第2次加強(qiáng)免疫后的第10天在耳緣靜脈處注射約1 mg的蛋白液，3 d后對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行心臟采血，將血清分離出來(lái)。用重組蛋白G瓊脂糖凝膠FF進(jìn)行純化，得到抗3B蛋白的多克隆抗體。

1.8 抗體效價(jià)的測(cè)定

用間接ELISA試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)制備的多克隆抗體效價(jià)：以重組蛋白包被ELISA板，置于4 ℃環(huán)境中包被過(guò)夜。一抗為3B蛋白多克隆抗體(2倍倍比稀釋)，陰性對(duì)照為未進(jìn)行免疫的新西蘭大白兔的血清，二抗為1∶8 000稀釋的羊抗兔IgG，測(cè)OD值并分析結(jié)果。

1.9 3B蛋白多克隆抗體反應(yīng)性檢測(cè)

用Western blot試驗(yàn)檢測(cè)其反應(yīng)性：將蛋白上樣緩沖液分別與100 ng和50 ng純化濃縮后的3B蛋白混合，進(jìn)行SDS-PAGE；將蛋白條帶轉(zhuǎn)印至NC膜上；用含5%脫脂奶粉的TBST溶液作為封閉液，封閉1 h；孵育一抗，用制備的3B蛋白多克隆抗體和兔陰性血清分別作為一抗(1∶500)，4 ℃條件下過(guò)夜孵育，用TBST溶液洗滌；孵育二抗，用羊抗兔IgG作為二抗(1∶8 000)，室溫下孵育1 h，用TBST溶液洗滌；在化學(xué)曝光儀上進(jìn)行曝光并紀(jì)錄結(jié)果。

1.10 3B蛋白多克隆抗體應(yīng)用于3B蛋白細(xì)胞定位的檢測(cè)

用間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)檢測(cè)多克隆抗體是否能檢測(cè)到過(guò)表達(dá)后3B蛋白的亞細(xì)胞定位：將細(xì)胞爬片放置于24孔板中，將HeLa細(xì)胞均勻鋪入其中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待密度達(dá)70%～80%時(shí)，部分細(xì)胞轉(zhuǎn)染本實(shí)驗(yàn)室保存的pXJ-3B質(zhì)粒，其他細(xì)胞轉(zhuǎn)染空載體pXJ41作為陰性對(duì)照。24 h后，加入PBS溶液洗滌，用4%多聚甲醛固定，用PBS溶液洗滌；加入0.2% TritonX-100通透；加入制備的3B蛋白多克隆抗體(1∶100)至載玻片，在37 ℃環(huán)境下孵育45 min，用PBS溶液洗滌；加入的羊抗兔IgG(1∶600)二抗，在37 ℃環(huán)境下孵育45 min，用PBS溶液洗滌；將含有60%甘油、0.1%疊氮鈉的PBS溶液滴入的長(zhǎng)載玻片上，將載玻片置于上面，用指甲油封邊，置熒光顯微鏡下觀察。

1.11 3B蛋白多克隆抗體應(yīng)用于細(xì)胞表達(dá)的3B蛋白的檢測(cè)

用Western blot試驗(yàn)檢測(cè)3B多克隆抗體是否能檢測(cè)到過(guò)表達(dá)的3B蛋白：將HEK-293T細(xì)胞鋪入6孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)密度達(dá)70%～80%時(shí)，部分細(xì)胞轉(zhuǎn)染本實(shí)驗(yàn)室保存的pXJ-3B質(zhì)粒，其他細(xì)胞轉(zhuǎn)染空載體pXJ41作為陰性對(duì)照，24 h后收集樣品；孵育一抗，用制備的多克隆抗體作為一抗，4 ℃環(huán)境下孵育過(guò)夜，用TBST溶液洗滌；孵育二抗，用羊抗兔IgG作為二抗，室溫下孵育1 h，用TBST溶液洗滌；在化學(xué)曝光儀上對(duì)NC膜進(jìn)行曝光，并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 FMDV 3B基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

以pXJ-3B質(zhì)粒為PCR模板，使用特異性引物F-pET28a-3B-BamHⅠ和R-pET28a-3B-XhoⅠ進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果如圖1所示，在231 bp處出現(xiàn)了特異性條帶，符合目的基因大小。

M. DL5000；1. 3B基因；2. 陰性對(duì)照

2.2 重組質(zhì)粒pET28a-3B的鑒定

用BamHⅠ及XhoⅠ2種酶對(duì)重組質(zhì)粒pET28a-3B進(jìn)行雙酶切鑒定。如圖2所示， 獲得了大小約5 369 bp(pET28a)和231 bp(3B基因)的2條特異性條帶，表明3B基因已成功連接到pET28a原核表達(dá)載體中。將該重組質(zhì)粒送生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示連接至pET28a原核表達(dá)載體中的序列與口蹄疫病毒參考毒株(GenBank 登錄號(hào):AJ539138.1)的核苷酸序列一致。以上結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pET28a-3B構(gòu)建成功。

M. DL5000；1. BamHⅠ/XhoⅠ酶切結(jié)果

2.3 3B重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將重組質(zhì)粒pET28a-3B轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)，收集誘導(dǎo)后的菌液、超聲破碎后的上清、沉淀及Ni-NTA瓊脂糖親和層析純化后得到的樣品進(jìn)行SDS-PAGE并用考馬斯亮藍(lán)試劑染色。誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液在未超聲破碎前各種蛋白較少，超聲破碎后的上清及沉淀蛋白明顯增多，但雜蛋白較多(圖3A)；經(jīng)過(guò)Ni-NTA瓊脂糖親和層析純化得到的蛋白中除了3B蛋白之外的雜蛋白較少(圖3B)，3B蛋白理論的預(yù)期大小約10 kDa，但純度有待提高。

2.4 3B重組蛋白的超濾濃縮

將蛋白樣品進(jìn)行了Millipore超濾管濃縮純化，如圖4所示，純化后的蛋白可用于下一步的試驗(yàn)。

2.5 重組蛋白濃度測(cè)定結(jié)果

BCA法測(cè)蛋白濃度結(jié)果約為1.84 mg/mL(表1)，可用于下一步試驗(yàn)。

A. 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)鑒定分析:M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1. 誘導(dǎo)后的菌液；2. 超聲破碎后的上清；3. 超聲破碎后的沉淀

M. 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1. 超濾濃縮前的3B重組蛋白；2. 超濾濃縮后的3B重組蛋白

表1 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)3B蛋白的吸光度及濃度

2.6 3B蛋白多克隆抗體效價(jià)及反應(yīng)性測(cè)定

2.6.1 3B蛋白多克隆抗體效價(jià)測(cè)定

將純化濃縮后的3B蛋白免疫新西蘭大白兔，經(jīng)過(guò)多次免疫，最終心臟采血并將血清分離。經(jīng)過(guò)重組蛋白G瓊脂糖凝膠FF純化制備出了兔源的抗3B蛋白多克隆抗體。用間接ELISA方法檢測(cè)抗體的效價(jià)達(dá)1∶512 000。

2.6.2 3B蛋白多克隆抗體反應(yīng)性測(cè)定

將純化的3B重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜，進(jìn)行Western blot檢測(cè)。如圖5所示，純化后的3B蛋白可被多克隆抗體檢測(cè)到，而不能被兔陰性血清檢測(cè)到，說(shuō)明了本研究制備的3B蛋白多克隆抗體可以與3B蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。

2.7 3B蛋白多克隆抗體的應(yīng)用性檢測(cè)

2.7.1 3B蛋白多克隆抗體檢測(cè)過(guò)表達(dá)的3B蛋白在細(xì)胞中的定位

在IFA試驗(yàn)中，用制備的3B多克隆抗體檢測(cè)了轉(zhuǎn)染pXJ-3B質(zhì)粒和pXJ41空載體質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞。如圖6所示，轉(zhuǎn)染了pXJ-3B的Hela細(xì)胞中，可以檢測(cè)到過(guò)表達(dá)后定位于細(xì)胞核周圍和細(xì)胞質(zhì)中的3B蛋白。同時(shí)，轉(zhuǎn)染了pXJ41空載體的Hela細(xì)胞中沒(méi)有檢測(cè)到特異性的紅色熒光。說(shuō)明制備的多克隆抗體可應(yīng)用于該蛋白的亞細(xì)胞定位研究。

M. 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1. 100 ng 3B蛋白(一抗為制備的3B多克隆抗體)；2. 50 ng 3B蛋白(一抗為制備的3B多克隆抗體)；3. 100 ng 3B蛋白(一抗為兔陰性血清)；4. 空白對(duì)照

A. 轉(zhuǎn)染pXJ-3B細(xì)胞的3B多克隆抗體染色；B. 轉(zhuǎn)染 pXJ-3B細(xì)胞的DAPI染色；C. A與B疊加圖D. 轉(zhuǎn)染pXJ41空載體細(xì)胞的3B多克隆抗體染色；E.轉(zhuǎn)染pXJ41空載體細(xì)胞的DAPI染色；F. D與E疊加圖

2.7.2 3B多克隆抗體檢測(cè)3B蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)情況

Western blot試驗(yàn)中，用制備的多克隆抗體作為一抗檢測(cè)分別轉(zhuǎn)染了pXJ-3B與空載體pXJ41的HEK-293T細(xì)胞樣品。如圖7所示，轉(zhuǎn)染了pXJ-3B質(zhì)粒的樣品在10 kDa處檢測(cè)到了特異性條帶，符合3B蛋白10 kDa的預(yù)期大??；而轉(zhuǎn)染了空載體pXJ41的樣品未檢測(cè)到該條帶，說(shuō)明制備的3B蛋白多克隆抗體能夠用于檢測(cè)細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的3B蛋白。

1. 轉(zhuǎn)染pXJ-3B質(zhì)粒；2. 轉(zhuǎn)染pXJ41空載體

3 討論

雖然口蹄疫病毒的致死率并不高，但它可以在患病家畜體內(nèi)長(zhǎng)期存活，使得健康家畜患病風(fēng)險(xiǎn)增加，是嚴(yán)重傳染原?？谔阋咭褔?yán)重影響了國(guó)際貿(mào)易中動(dòng)物及家畜產(chǎn)品的進(jìn)出口，并給畜牧業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[8]。目前，用于制備針對(duì)各種病毒的多克隆抗體免疫抗原的主要是活病毒以及該病毒的重組蛋白，其中利用重組蛋白不僅避免了病毒在免疫過(guò)程中引起散播的危險(xiǎn)，還可以相對(duì)地提高針對(duì)目的蛋白的多克隆抗體的特異性[9],因此本研究選擇了重組蛋白作為免疫原免疫動(dòng)物制備多克隆抗體。

從作為免疫原進(jìn)行疫苗、抗體等的應(yīng)用研究角度來(lái)說(shuō)，非結(jié)構(gòu)蛋白比結(jié)構(gòu)蛋白更有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)槠渥儺愋愿10-11]，因此本研究選擇了口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白之一的3B蛋白作為免疫抗原。3B蛋白在病毒RNA復(fù)制合成時(shí)有重要作用。研究表明，感染了口蹄疫病毒的家畜體內(nèi)會(huì)生成抗3B蛋白的抗體，可見(jiàn)3B蛋白具有免疫原性[12]。本研究用制備的純度較高且濃度合格的3B蛋白注射試驗(yàn)動(dòng)物，獲得了抗3B蛋白的多克隆抗體。

本研究采用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)3B重組蛋白，將表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行純化，得到的3B蛋白成分純度較高，將該3B蛋白作為免疫原免疫新西蘭大白兔，最終制備的多克隆抗體經(jīng)間接ELISA測(cè)定顯示其效價(jià)高達(dá)1∶512 000。用制備的多克隆抗體進(jìn)行了Western blot試驗(yàn)，結(jié)果顯示該多克隆抗體可以檢測(cè)到3B重組蛋白，表明其反應(yīng)性良好。將該多克隆抗體對(duì)真核表達(dá)系統(tǒng)過(guò)表達(dá)的3B蛋白進(jìn)行了應(yīng)用性檢測(cè)，IFA結(jié)果顯示，3B蛋白多克隆抗體可以檢測(cè)到過(guò)表達(dá)后定位于真核細(xì)胞細(xì)胞核周圍和細(xì)胞質(zhì)中的3B蛋白；Western blot結(jié)果顯示該多克隆抗體可以檢測(cè)到在真核細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的3B蛋白。以上結(jié)果說(shuō)明3B蛋白多克隆抗體制備成功，為口蹄疫病毒3B蛋白的生物學(xué)功能研究和病原感染機(jī)制及致病機(jī)理的研究提供了重要的工具支持。