方光遠(yuǎn)，樊金云，談福利，金海燕，黃心昱，王喜國(guó)，張玉紅，陳俊紅，王楠楠，戴鼎震

(1. 金陵科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210038；2. 乾元浩生物股份有限公司南京生物藥廠，江蘇 南京 210012)

犬細(xì)小病毒(canine parvovirus，CPV)屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬，病毒粒子大小為20～22 nm，病毒核酸為單股DNA，基因組全長(zhǎng)為5 323 bp，基因組包含2個(gè)基因開放閱讀框，分別編碼結(jié)構(gòu)蛋白(VP1和VP2)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1和NS2)，其中衣殼蛋白VP2(基因長(zhǎng)度為1 755 bp)主要影響CPV的抗原性和感染宿主范圍[1-3]。犬細(xì)小病毒主要感染6個(gè)月齡以內(nèi)的幼犬，特別是1～3月齡的幼犬，感染病犬表現(xiàn)為心肌炎型、腸炎型、心肌炎腸炎混合型。心肌炎型主要發(fā)生于8周齡以下的幼犬，多見于4～6周齡幼犬，常無(wú)先兆性癥狀，或僅表現(xiàn)輕微腹瀉，繼而突然衰弱、呻吟、黏膜發(fā)紺、呼吸極度困難，常在數(shù)小時(shí)內(nèi)突然死亡，發(fā)病率50%～100%，死亡率60%～100%。腸炎型1～6月齡幼犬最為易感，占CPV感染犬總數(shù)比例可高達(dá)75%，發(fā)病率20%～100%，死亡率50%～100%。該病50%以上感染表現(xiàn)為心肌炎腸炎混合型，感染率可達(dá)100%，死亡率80%～100%。大于1歲成年犬發(fā)病率相對(duì)較低[3]。

CPV最早發(fā)現(xiàn)于美國(guó)[4]，Kelly[5]和Thomson等[6]同時(shí)從病犬糞便中用犬腎MDCK細(xì)胞分離獲得該病毒，并將該病毒命名為CPV-2。研究表明，CPV-2與貓瘟熱病毒(feline panleukopenia virus，F(xiàn)PV)、貂腸炎病毒(mink enteritis virus，MEV)非常相似，家犬和野生犬均可感染，但不會(huì)感染貓。Parrish等[7]報(bào)道，CPV-2自1978年發(fā)現(xiàn)以來，不斷進(jìn)化變異產(chǎn)生出新毒株，1979—1982年之間，原始CPV-2型毒株進(jìn)化變異為CPV-2a基因型，1984年又進(jìn)化變異為CPV-2b基因型。Nakamura等[8]報(bào)道，1984—2000年間又相繼產(chǎn)生了2種新型變異毒株New -CPV-2a和New -CPV-2b基因型。Martella等[9]報(bào)道，2001年，在意大利又發(fā)現(xiàn)新的進(jìn)化變異毒株CPV-2c基因型。目前，CPV-2a、CPV-2b、New-CPV-2a、New-CPV-2b和CPV-2c 5種變異基因型已經(jīng)取代了原始CPV-2基因型，在世界范圍內(nèi)廣泛流行和傳播。本試驗(yàn)收集2012—2019年南京市某寵物醫(yī)院43份犬細(xì)小病毒糞便病料，通過測(cè)定VP2基因進(jìn)行了基因型分析，以期為南京地區(qū)預(yù)防和治療犬細(xì)小病毒病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料

南京市某寵物醫(yī)院2012—2019年臨床癥狀表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉或排出番茄醬樣有特殊腥臭味的血便，并經(jīng)過韓國(guó)百易奧生物公司安捷犬細(xì)小病毒抗原膠體金快速檢測(cè)試紙板檢測(cè)CPV為陽(yáng)性的病犬糞便樣品43份。43份病料每次收集后保存在-20 ℃冰箱冷凍室備用。43份病料患犬信息見表1。

表1 43份犬細(xì)小病毒病病例患犬信息

1.2 CPV VP2基因片段PCR檢測(cè)試驗(yàn)試劑

2×TaqPCR Master Mix、Goldview、Agarose、超純水、DL2000 DNA Marker，購(gòu)自南京擎科生物有限公司。

1.3 CPV VP2基因片段序列測(cè)定

引物設(shè)計(jì)：根據(jù)GenBank中的一株基因型為CPV-2a(登錄號(hào)為KT382542)的VP2基因序列，設(shè)計(jì)1對(duì)引物，序列如下：上游引物CPV-F：5′-GATTTCTACGGGTACTTT-3′，下游引物CPV-R：5′-TAGGTGCTAGTTGAGATTTT-3′，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小為1 625 bp。引物由南京擎科生物有限公司合成。

DNA模板制備：取43份CPV糞便病料用生理鹽水稀釋100倍，然后用Thermo冷凍離心機(jī)4 ℃ 12 000 r/min離心5 min，取上清液 4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

目的基因片段的擴(kuò)增：采用25 μL體系:2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板0.5 μL，雙蒸水10 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物用加入Goldview 5 μL/100 mL 1.2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳(電壓為140 V，電流為200 mA，電泳時(shí)間為45 min)，紫外檢測(cè)儀下觀察擴(kuò)增條帶并拍照。

測(cè)序分析：取30 μL PCR產(chǎn)物送南京擎科生物有限公司測(cè)序。得到測(cè)序結(jié)果后，使用Lasergene軟件將43份測(cè)序結(jié)果與GenBank中已知CPV基因型VP2蛋白基因進(jìn)行比較，分析43份樣品CPV基因型。同時(shí)將獲得的43份測(cè)序結(jié)果向NCBI申請(qǐng)GenBank登錄號(hào)。

2 結(jié)果與分析

2.1 VP2基因檢測(cè)

43份CPV患犬糞便病料經(jīng)過PCR擴(kuò)增均擴(kuò)增出1 625 bp的目的片段。部分檢測(cè)結(jié)果見圖1。

M. DL2000 DNA Marker；1～21. 部分樣品

2.2 VP2基因測(cè)序及分型

將43份PCR產(chǎn)物送南京擎科生物有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)ContigExpress基因拼接軟件拼接均獲得1 548 bp核苷酸序列片段，經(jīng)過向NCBI申請(qǐng)獲得43個(gè)GenBank登錄號(hào)，為MW242345～MW242387。使用MegAlign軟件將43份核苷酸序列片段編碼的變異VP2蛋白氨基酸與GenBank中已知CPV基因型(FPV、CPV-2、CPV-2a、CPV-2b、New-CPV-2a、New-CPV-2b、CPV-2c，每個(gè)基因型各選取2個(gè))VP2變異蛋白氨基酸進(jìn)行比較，CPV基因型結(jié)果見表2。

從表2可以看出，F(xiàn)PV基因型VP2蛋白關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)依次為80K、87M、93K、103V、267F、297S、300A、323D、324Y、370Q、375D、426N、440T、564N、568A；CPV-2基因型VP2蛋白關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)依次為80R、87M、93N、103A、267F、297S、300A、323N、324Y、370Q、375N、426N、440T、564S、568G；由FPV變異為CPV-2主要是VP2蛋白中7個(gè)氨基酸位點(diǎn)80K→R、93K→N、103V→A、323D→N、375D→N、564N→S、568A→G發(fā)生了變異。

CPV-2a基因型VP2蛋白關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)依次為80R、87L、93N、103A、267F、297S、300G、323N、324Y、370Q、375D、426N、440T、564S、568G；由CPV-2變異為CPV-2a主要是VP2蛋白中3個(gè)氨基酸位點(diǎn)87M→L、300A→G、375N→D發(fā)生了變異，其中375N→D是發(fā)生了回復(fù)突變的變異。

表2 CPV VP2蛋白氨基酸序列變異和基因型分析

續(xù)表2

CPV-2b基因型VP2蛋白關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)依次為80R、87L、93N、103A、267F、297S、300G、323N、324Y、370Q、375D、426D、440T、564S、568G；由CPV-2a變異為CPV-2b主要是VP2蛋白中1個(gè)氨基酸位點(diǎn)426N→D發(fā)生了變異，其中意大利FJ005263毒株還發(fā)生了297S→A的關(guān)鍵變異，但由于沒有發(fā)生267F→Y 、324Y→I、440T→A的關(guān)鍵變異，該毒株應(yīng)屬于介于CPV-2b與New-CPV-2b之間類型，因此本文仍將該毒株歸屬于CPV-2b基因型。

New-CPV-2a基因型VP2蛋白關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)依次為80R、87L、93N、103A、267Y、297A、300G、323N、324I、370Q、375D、426N、440A、564S、568G；由CPV-2a變異為New-CPV-2a主要是VP2蛋白中3個(gè)氨基酸位點(diǎn)267F→Y、324Y→I、440T→A發(fā)生了變異。

New-CPV-2b基因型VP2蛋白關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)依次為80R、87L、93N、103A、267Y、297A、300G、323N、324I、370Q、375D、426D、440A、564S、568G；由CPV-2b變異為New-CPV-2b主要是VP2蛋白中3個(gè)氨基酸位點(diǎn)267F→Y、324Y→I、440T→A發(fā)生了變異。

CPV-2c基因型VP2蛋白關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)依次為80R、87L、93N、103A、267Y、297A、300G、323N、324I、370R、375D、426E、440T、564S、568G；由New-CPV-2b變異為CPV-2c主要是VP2蛋白中3個(gè)氨基酸位點(diǎn)370Q→R、426D→E、440A→T發(fā)生了變異，其中440A→T是發(fā)生了回復(fù)突變的變異。

基于上述標(biāo)準(zhǔn)，本試驗(yàn)中所檢測(cè)的43份VP2蛋白氨基酸序列，可確定26株CPV為New-CPV-2a基因型，占比60.5%；其中67號(hào)毒株VP2蛋白關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)依次為80R、87L、93N、103A、267F、297A、300G、323N、324I、370R、375D、426N、440T、564S、568G，該毒株VP2蛋白關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)發(fā)生了324Y→I的關(guān)鍵變異，但由于沒有發(fā)生267F→Y、440T→A的關(guān)鍵變異，該毒株應(yīng)屬于介于CPV-2a與New-CPV-2a之間類型，本文暫定該毒株歸屬于New-CPV-2a基因型；9株CPV為New-CPV-2b基因型，占比20.9%；8株為CPV-2c基因型，占比18.6%。

2.3 VP2基因遺傳演化分析

應(yīng)用MEGA5軟件將 43份樣品的VP2基因氨基酸序列與國(guó)內(nèi)外部分參考毒株進(jìn)行比較并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖2。

圖2 VP2蛋白氨基酸序列遺傳演化分析

從圖2可以看出，25株CPV毒株與GenBank中MH476590、MK518017兩株New-CPV-2a基因型毒株在同一分支；67號(hào)毒株既不與GenBank中M24003、MN451670兩株CPV-2a基因型在同一分支，也不與GenBank中MH476590、MK518017兩株New-CPV-2a基因型毒株在同一分支，經(jīng)VP2蛋白關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分析應(yīng)屬于介于CPV-2a與New-CPV-2a之間類型，本文暫將該毒株歸屬于New-CPV-2a基因型。9株CPV毒株與GenBank中KT162028、MH476588兩株New-CPV-2b基因型毒株在同一分支；8株CPV毒株與GenBank中MH660525、MK806284兩株CPV-2c基因型毒株在同一分支。

3 討論

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，南京市某寵物醫(yī)院2012—2019年43份犬細(xì)小病毒病患犬的CPV基因型中，New-CPV-2a占比最高，為60.5%；其次為New-CPV-2b(20.9%)和CPV-2c(18.6%)。從采樣時(shí)間來看，2012—2015年35份樣品CPV基因型為New-CPV-2a和New-CPV-2b，其中New-CPV-2a占比74.3%，New-CPV-2b占比25.7%；沒有檢測(cè)出CPV-2、CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c基因型。2016—2017年沒有采集到犬細(xì)小病毒病病料，因此這兩年發(fā)病情況和基因型分布情況無(wú)法得知。2018—2019年8份病料CPV基因型全部為CPV-2c基因型，主要原因可能由于2016—2017年南京市采取全市犬只基本免疫接種荷蘭英特威犬細(xì)小病毒、犬瘟熱病毒、犬傳染性肝炎病毒、犬副流感四聯(lián)弱毒疫苗，這樣可能對(duì)CPV形成一種免疫壓力，導(dǎo)致2018年后CPV基因發(fā)生突變，從而使CPV-2c基因型大幅度增加。經(jīng)調(diào)查，本試驗(yàn)中43只犬細(xì)小病毒病患犬發(fā)病前均沒有注射過犬細(xì)小病毒疫苗。

邱薇等[10]在長(zhǎng)春、沈陽(yáng)等地區(qū)2005年檢測(cè)發(fā)現(xiàn)6 株CPV-2a基因型和3 株CPV-2b基因型毒株，但病料采集年份未交代；繆勤等[11]2005年檢測(cè)發(fā)現(xiàn)南京1982—2004年5株毒株為CPV-2b基因型；2009年郭偉等[12]在上海鑒定到New-CPV-2a基因型CPV-SH毒株；2010年劉志強(qiáng)等[13]在新疆鑒定到New-CPV-2a 基因型CPV-SHZ毒株；2016年王建科等[14]從長(zhǎng)春檢測(cè)到一株New-CPV-2b基因型 毒株CPV-JL13-1。CPV-2c基因型國(guó)內(nèi)最早于2010年由張仁舟等[15]報(bào)道，通過檢測(cè)2009年收集的12份CPV陽(yáng)性患犬糞便樣品，鑒定到2株CPV-2c基因型。近年來CPV-2c基因型陸續(xù)被報(bào)道，根據(jù)徐閏等[16]2018年報(bào)道，2016—2017年從廣西南寧地區(qū)寵物醫(yī)院采集的12份CPV陽(yáng)性患犬糞便中，檢測(cè)到3株New-CPV-2a、3株New-CPV-2b和6株CPV-2c基因型毒株。施鵬飛等[17]報(bào)道，從2019年武漢某寵物醫(yī)院CPV陽(yáng)性患犬糞便中檢測(cè)到1株CPV-2c基因型毒株。上述報(bào)道與本文檢測(cè)的43份南京犬細(xì)小病毒基因型發(fā)生年份基本相符合。但根據(jù)張淮瑜等[18]報(bào)道，2018年5月至2019年5月從銀川市某寵物醫(yī)院收集的14份CPV 陽(yáng)性病犬糞便樣品中，檢測(cè)到3株New-CPV-2a和2株New-CPV-2b毒株，沒有檢測(cè)到CPV-2c毒株，此結(jié)果與本人檢測(cè)的南京地區(qū)2018—2019年8株CPV毒株全部是CPV-2c基因型不相符合，可能是地區(qū)差異所導(dǎo)致。

綜上，我國(guó)在2010年前患犬感染的CPV基因型主要為CPV-2a、CPV-2b，2010—2016年主要為New-CPV-2a、New-CPV-2b基因型，2017年以后則以CPV-2c基因型為主。本研究結(jié)果豐富了CPV的流行病學(xué)資料，也為南京地區(qū)犬細(xì)小病毒病的防控提供了科學(xué)依據(jù)。