段滇寧，陳超，楊潤澤，洪麒翔，陳洪博，2*，唐姝，張曉輝

(1. 龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建 龍巖 364012；2. 福建省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，福建 龍巖 364012；3. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

熱應(yīng)激影響動物精神狀態(tài)、生產(chǎn)性能、健康狀況，造成多種器官的損傷，甚至導(dǎo)致動物猝死，熱應(yīng)激造成的經(jīng)濟(jì)損失已在世界范圍內(nèi)廣泛報道[1]。與哺乳動物相比，家禽由于代謝旺盛、生長速度快，羽毛豐厚、皮膚沒有汗腺等特點而更容易受到熱應(yīng)激的損傷[2]。作為一種非特異性應(yīng)激源，熱應(yīng)激導(dǎo)致多器官受損。前期研究證實，熱應(yīng)激對雞心臟組織造成嚴(yán)重的傷害[3-4]。肺臟是機(jī)體進(jìn)行氣體交換的場所，熱應(yīng)激后雞的呼吸次數(shù)明顯增多。然而，目前對熱應(yīng)激后雞肺臟組織損傷研究缺乏。

熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)是細(xì)胞內(nèi)一類高度保守的蛋白質(zhì)，保護(hù)細(xì)胞免受應(yīng)激原刺激，在許多生理過程中起著至關(guān)重要的作用，如蛋白質(zhì)折疊、運(yùn)輸和組裝。根據(jù)分子量不同，將HSPs分為幾個家族，如小熱休克蛋白家族、HSP47、HSP60、HSP70、HSP90和HSP110[5]。前期研究表明，HSPs能保護(hù)心肌細(xì)胞免受熱應(yīng)激的影響，HSPs過量表達(dá)后可降低熱應(yīng)激對心肌細(xì)胞的損傷[6-7]。肺臟作為機(jī)體重要生命器官，在氣體交換、參與代謝等方面具有重要作用，然而熱應(yīng)激對呼吸系統(tǒng)的損傷及肺臟組織內(nèi)HSPs的表達(dá)變化規(guī)律仍不清楚。本試驗旨在通過急性熱應(yīng)激處理，觀察熱應(yīng)激后肉雞肺臟組織形態(tài)學(xué)變化，在組織和細(xì)胞水平探討肺臟組織HSPs的表達(dá)與組織損傷的關(guān)系，闡明熱應(yīng)激誘發(fā)呼吸系統(tǒng)機(jī)能障礙的發(fā)生機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

人工氣候培養(yǎng)箱(隔離器，RXZ-500D)為浙江寧波新江南機(jī)械有限公司產(chǎn)品；鼠抗HSP27、HSP60、HSC70、HSP72和HSP90單克隆抗體購自Enzo Biochem Inc.；山羊抗鼠IgG-HRP、BCA 蛋白檢測試劑盒和化學(xué)發(fā)光底物檢測試劑盒均購自上海碧云天生物公司；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、血鉀檢測試劑盒和血鈣檢測試劑盒購自南京建成生物技術(shù)公司；1日齡SPF雛雞購自南京乾元浩生物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實驗動物中心。

1.2 試驗設(shè)計

將60只1日齡SPF雛雞飼養(yǎng)于溫度(25±1)℃，相對濕度(45±5)%人工氣候室環(huán)境中，自由采食和飲水，常規(guī)免疫。飼養(yǎng)至35日齡時，將SPF雞隨機(jī)分為對照組和熱應(yīng)激1、2、3、5和10 h組，每組10只，共6組。將熱應(yīng)激組雞轉(zhuǎn)移至(35±2)℃，相對濕度(70±10)%的人工氣候室，試驗開始后觀察雞的臨床癥狀，分別按照試驗設(shè)定的時間進(jìn)行處理。試驗結(jié)束后翅靜脈采血取樣，分離血清；頸靜脈快速放血致死，迅速剖殺取材，采集試驗雞肺臟組織，一部分固定于10% 中性福爾馬林溶液(24 h后換新的中性福爾馬林溶液)，另一部分經(jīng)液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 呼吸頻率的統(tǒng)計

觀察雞腹部羽毛起伏次數(shù)，統(tǒng)計1 min腹部羽毛起伏的次數(shù)，即為呼吸頻率。

1.4 血液生化、血?dú)庵笜?biāo)檢測

取對照組和熱應(yīng)激組血清，用pH計測定血清pH值，血清中LDH、鉀和鈣濃度測定按照試劑盒說明書進(jìn)行測定。

1.5 病理組織學(xué)檢測

常規(guī)制作石蠟切片，然后切成5 μm的連續(xù)切片，HE染色，鏡檢。具體步驟參考文獻(xiàn)[8]。

1.6 肺臟組織蛋白提取

取雞肺臟組織100 mg，置于2 mL離心管中，加200 μL預(yù)冷的RIPA裂解液(含1% PMSF)，4 ℃條件下將組織用手持式研磨器快速研磨均勻，-20 ℃冰箱反復(fù)凍融3次后12 000 r/min離心5 min，用移液槍吸取上清至新的離心管中，即得到組織總蛋白，BCA法測定樣品蛋白濃度，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 Western blot檢測HSPs表達(dá)

將樣品與6×蛋白變性緩沖液混合后煮沸變性5 min，冷卻備用取25 μg樣品進(jìn)行檢測，一抗1∶1 000,稀釋，4 ℃孵育過夜，二抗1∶10 000稀釋，室溫孵育2 h，顯影后進(jìn)行灰度掃描，Quantity One軟件進(jìn)行分析。具體實驗步驟參考文獻(xiàn)[9]。

1.8 統(tǒng)計分析

用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件提供的多重比較的單因素分析對熱應(yīng)激組與試驗中的差異進(jìn)行統(tǒng)計分析。每個試驗重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。*表示差異顯著，P<0.05；**表示差異極顯著，P<0.01。

2 結(jié)果

2.1 急性熱應(yīng)激對雞行為指標(biāo)影響

急性熱應(yīng)激對雞呼吸頻率影響如圖1所示，試驗開始前雞呼吸頻率為25次/min，熱應(yīng)激1～10 h呼吸頻率極顯著升高(P<0.01)，臨床表現(xiàn)為熱應(yīng)激后雞采食次數(shù)減少，飲水次數(shù)增加，站立雞數(shù)量減少，俯伏休息雞數(shù)量增多，雞翅膀垂下、張口呼吸。熱應(yīng)激3 h后試驗組雞呼吸頻率開始降低，但仍極顯著高于正常對照組。

2.2 急性熱應(yīng)激對雞血液生化、血?dú)庵笜?biāo)的影響

與對照組相比，熱應(yīng)激3 h后血清pH顯著升高(P<0.05)，熱應(yīng)激1 h后血清pH呈升高趨勢，但與對照組無顯著差異，整個熱應(yīng)激過程中血清pH值都呈升高狀態(tài)(圖2A)。血清LDH水平均在熱應(yīng)激后呈極顯著升高的變化(P<0.01)，LDH變化總趨勢呈升高趨勢，在熱應(yīng)激5 h組達(dá)到最高點，隨后LDH濃度開始降低(圖2B)。與對照組相比，熱應(yīng)激1 h后血鉀濃度有升高趨勢，但差異不顯著(P>0.05)；隨著熱應(yīng)激時間增加，血鉀濃度開始降低，熱應(yīng)激5、10 h后血鉀濃度顯著減低(P<0.05)；熱應(yīng)激10 h 組血鉀濃度高于熱應(yīng)激5 h組，但二者之間差異不顯著(P>0.05)，見圖2C。熱應(yīng)激后血鈣濃度呈降低趨勢，熱應(yīng)激5、10 h后血鈣濃度顯著減低(P<0.05)，熱應(yīng)激10 h組血鈣濃度高于熱應(yīng)激5 h組，但二者之間差異不顯著(P>0.05)，見圖2D。

注：各組不同時間點與對照組相比，*：P<0.05差異顯著，**：P<0.01差異極顯著。下同

圖2 熱應(yīng)激對雞血清pH(A)、LDH(B)、鈣濃度(C)及鉀濃度(D)的影響

2.3 急性熱應(yīng)激雞肺臟組織學(xué)變化

對照組雞肺臟組織可見肺房內(nèi)無異物出現(xiàn)(圖3A)。熱應(yīng)激前1～3 h后，肺組織內(nèi)血管尤其是肺泡壁毛細(xì)血管顯著充血，肺房結(jié)構(gòu)基本完整(圖3B、圖3D)。熱應(yīng)激5 h后肺房內(nèi)充血性變化明顯，肺房內(nèi)有大量的紅細(xì)胞存在(圖3E)。熱應(yīng)激10 h肺房內(nèi)的異物減少，但肺上皮細(xì)胞大量脫落，組織結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重(圖3F)，氣管黏膜高度水腫，黏膜的完整性受到嚴(yán)重的損傷，氣管黏膜上皮細(xì)胞大面積脫落。

A,B,C,D,E和F分別為熱應(yīng)激0,1,2,3,5和10 h時的肺臟組織

2.4 肺臟組織中HSPs的表達(dá)

由圖4可知，HSP27和HSP72在正常肺臟組織中含量較低，熱應(yīng)激后表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)。HSP27在熱應(yīng)激1 h后表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)，在熱應(yīng)激過程中一直維持較高水平。HSP72在熱應(yīng)激1 h后表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，熱應(yīng)激5 h后表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)，隨著熱應(yīng)激時間延長，HSP72含量開始降低，但仍顯著高于對照組(P<0.05)。與對照組相比，HSP60的表達(dá)量在熱應(yīng)激1 h后顯著升高(P<0.05)，而隨著熱應(yīng)激時間增加HSP60表達(dá)量降低，與對照組無顯著差異。HSC70作為結(jié)構(gòu)型HSPs在熱應(yīng)激雞肺臟組織表達(dá)變化無明顯差異，始終維持在較高水平。熱應(yīng)激后雞肺臟組織內(nèi)HSP90表達(dá)量呈下降趨勢，熱應(yīng)激50 h后表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，隨著熱應(yīng)激時間延長，HSP90含量開始降低，但與對照組相比無顯著差異(P>0.05)。

3 討論

熱應(yīng)激是一種非特異性的應(yīng)激原，它會影響家畜的健康甚至導(dǎo)致死亡。課題組前期研究揭示了熱應(yīng)激可對雞心臟、肝臟和腎臟造成嚴(yán)重?fù)p傷[8,10-11]，對肺臟損傷研究報道較少。熱應(yīng)激發(fā)生時，動物會出現(xiàn)喘息、頻繁呼吸，導(dǎo)致機(jī)體CO2排出過多、血液pH值升高等現(xiàn)象。為了保持機(jī)體電解質(zhì)和酸堿平衡，腎上腺皮質(zhì)分泌醛固酮增加，血液中Na+、K+排出量升高，引起血中鈉、鉀離子水平下降，導(dǎo)致血漿滲透壓降低[12]。本試驗中隨著熱應(yīng)激時間增加，雞飲水增加，俯臥休息增多，翅膀伸展頻次增加，呼吸頻率的明顯升高，肺臟通氣過度，熱應(yīng)激1～2 h維持在較高頻率，隨著熱應(yīng)激時間延長，呼吸頻率降低，但仍極顯著高于對照組。呼吸加快導(dǎo)致大量CO2排出，使血液pH值升高，在熱應(yīng)激試驗過程中一直維持較高的狀態(tài)，表明機(jī)體發(fā)生呼吸性堿中毒，機(jī)體CO2濃度降低可引起腦血管收縮和血流量減少，導(dǎo)致腦組織缺氧，使雞由開始煩躁不安狀態(tài)轉(zhuǎn)化為精神沉郁、萎靡不振，甚至昏迷。與對照組相比，熱應(yīng)激后3 h后pH與對照組差異顯著，但熱應(yīng)激后5 h pH與對照組無顯著差異，可能原因是熱應(yīng)激3 h以后雞群慢慢適應(yīng)所處的環(huán)境，呼吸頻率開始降低，通過大量飲水、體內(nèi)某些蛋白大量表達(dá)來發(fā)揮保護(hù)作用(如熱休克蛋白等)，緩解機(jī)體呼吸性堿中毒。本研究中發(fā)現(xiàn)血鉀濃度在熱應(yīng)激后降低，原因可能是為了維持機(jī)體的酸堿平衡，腎小管上皮細(xì)胞代償性排出H+減少(保酸)，相應(yīng)的排出K+增多，細(xì)胞外液K+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)交換H+，因此使血鉀濃度降低。另外，由于血液pH值升高，機(jī)體分泌有機(jī)酸增多，有機(jī)酸與鈣離子大量結(jié)合，導(dǎo)致血鈣濃度下降，血鈣濃度降低，引起神經(jīng)肌肉細(xì)胞閾電位下降，肌肉組織興奮性升高，使雞出現(xiàn)肌肉抽搐，甚至發(fā)生痙攣。LDH被廣泛用作細(xì)胞損傷的標(biāo)志物，本研究中熱應(yīng)激后雞血清LDH水平明顯高于對照組，表明熱應(yīng)激對雞組織細(xì)胞可造成一定的損傷。另外，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在熱應(yīng)激2 ～ 3 h時雞有死亡現(xiàn)象，但隨后死亡率反而降低，熱應(yīng)激10 h以后雞群又開始出現(xiàn)死亡[4，13]，而本試驗中則沒有出現(xiàn)雞因急性應(yīng)激所致的應(yīng)激性猝死現(xiàn)象，這可能與飼養(yǎng)環(huán)境中空氣流通、濕度和溫度控制較好有關(guān)[1]。

同一指標(biāo)在熱應(yīng)激不同時間進(jìn)行比較，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)

病理組織學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激雞肺臟呈現(xiàn)明顯的動態(tài)病理變化，主要表現(xiàn)為支氣管擴(kuò)張充血，肺小葉毛細(xì)血管擴(kuò)張，肺房內(nèi)有水腫液和紅細(xì)胞，氣管黏膜的完整性受到嚴(yán)重的破壞，肺房上皮細(xì)胞脫落、破裂會嚴(yán)重影響肺臟的呼吸功能，可能是造成熱應(yīng)激缺氧及呼吸性堿中毒的主要原因。目前熱應(yīng)激引起肺臟細(xì)胞損傷的機(jī)制尚不明確，但是通過本試驗的觀察與綜合分析可以認(rèn)為，熱應(yīng)激對組織的損傷機(jī)理與組織的氧化損傷以及細(xì)胞內(nèi)有毒物質(zhì)的積累有著密切的聯(lián)系。在正常生理情況下，體內(nèi)自由基產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)動物受到熱應(yīng)激時，會使得自由基的產(chǎn)生急劇增加，而自由基清除的能力不足，造成體內(nèi)自由基蓄積，導(dǎo)致動物的組織氧化受損。

熱應(yīng)激反應(yīng)是自然界存在的應(yīng)激類型中最普遍的一種，從原核生物(如細(xì)菌)到人類在高溫環(huán)境下均可選擇性合成一類蛋白質(zhì)，即熱休克蛋白，這類蛋白質(zhì)參與機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)，具有多種功能，包括賦予細(xì)胞耐熱性以抵抗高溫，作為分子伴侶以防止蛋白聚集，對抗正常的細(xì)胞死亡，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生存和死亡的平衡，現(xiàn)已成為研究應(yīng)激領(lǐng)域中的熱點方向[4，13]。當(dāng)動物機(jī)體受到外界多種應(yīng)激刺激時，細(xì)胞內(nèi)的HSPs會被大量合成和消耗，以抵抗外界刺激對機(jī)體的損傷，從而維護(hù)細(xì)胞的正常功能和代謝。大量研究表明，HSPs在抗應(yīng)激損傷過程中起重要作用，對心臟、肝臟、腎臟等組織器官起保護(hù)作用[5，14-15]，而HSPs在肺臟內(nèi)的表達(dá)變化規(guī)律尚不清楚。HSP27的主要功能是在體內(nèi)提供耐熱性、細(xì)胞保護(hù)以及在應(yīng)激條件下維持細(xì)胞存活，它通過不依賴于ATP的伴侶作用抑制蛋白質(zhì)聚集和穩(wěn)定部分變性蛋白質(zhì)，從而確保HSP70復(fù)合物的再折疊[15]。HSP60在線粒體蛋白質(zhì)的運(yùn)輸和維護(hù)以及線粒體DNA的傳遞和復(fù)制中起著重要作用[16]。在熱應(yīng)激條件下，HSC70被動員來保護(hù)細(xì)胞，并通過修復(fù)因應(yīng)激改變其構(gòu)象的蛋白質(zhì)來幫助HSP70發(fā)揮其保護(hù)功能[17]。HSP72可與其他蛋白結(jié)合，從而穩(wěn)定現(xiàn)有蛋白的聚集，并介導(dǎo)在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器中新翻譯蛋白的正確折疊[14,18]。細(xì)胞受到應(yīng)激刺激后HSP90在細(xì)胞中起到防止蛋白非特異性聚集的作用，保證蛋白質(zhì)進(jìn)行正確折疊，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[5]。本研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激導(dǎo)致雞肺臟組織內(nèi)HSPs表達(dá)量出現(xiàn)明顯變化，其中HSP27和HSP72兩種熱休克蛋白升高最顯著，以HSP72表達(dá)變化最大。HSP72在正常肺臟組織中表達(dá)量較低，在熱應(yīng)激后表達(dá)量開始顯著升高，在熱應(yīng)激5 h表達(dá)量達(dá)到最高，隨后開始降低。HSP27在熱應(yīng)激1 h后呈現(xiàn)極顯著升高狀態(tài)，在整個熱應(yīng)激過程中表達(dá)量一直維持在較高水平。HSP60、HSC70和HSP90在雞肺臟組織中均有較高的表達(dá)量，熱應(yīng)激1 h后HSP60表達(dá)量顯著升高，隨著熱應(yīng)激時間延長表達(dá)量開始降低，但仍維持在較高水平，HSC70作為結(jié)構(gòu)型HSPs，熱應(yīng)激后表達(dá)量無明顯變化，HSP90在熱應(yīng)激后表達(dá)量有先降低后升高的趨勢，與對照組相比無顯著差異。研究結(jié)果表明熱應(yīng)激后肺臟組織中HSPs表達(dá)量發(fā)生明顯變化，HSPs表達(dá)量的提高可能與提高組織細(xì)胞抗熱應(yīng)激能力相關(guān)。

綜上所述，熱應(yīng)激能引起雞血清pH值和LDH含量升高，血鈣和血鉀濃度降低，造成肺臟組織嚴(yán)重?fù)p傷，多種HSPs在熱應(yīng)激的雞肺臟組織中表達(dá)量升高。HSPs在熱應(yīng)激后高表達(dá)可能與機(jī)體損傷修復(fù)中的保護(hù)作用有關(guān)。然而，HSPs的確切作用需要進(jìn)一步研究闡明。