趙龍妹，張玲

(河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，河南 洛陽 471000)

蛋白酶是一類能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)降解成小肽和氨基酸的水解酶，在飼料業(yè)、食品業(yè)、制藥業(yè)、皮革加工行業(yè)以及洗滌品行業(yè)廣泛應(yīng)用[1-2]。作為三大工業(yè)用酶之一的蛋白酶，在全球酶制劑市場份額中占60%[3-5]。自然界中的蛋白酶主要來源于動物、植物和微生物，與前兩者相比，來源于微生物的蛋白酶由于其能夠被大規(guī)模發(fā)酵制備、易于純化等特點而更受關(guān)注。來源于微生物的蛋白酶占全球商品蛋白酶的三分之二，與植物和動物源蛋白酶相比，微生物源蛋白酶更能滿足工業(yè)生產(chǎn)所需[6-8]。

根據(jù)酶最適反應(yīng)pH，微生物源蛋白酶可被分為酸性(pH 3.8～5.6)、中性(pH為5～8)和堿性(pH 9～11)三類[4]。能夠生產(chǎn)中性和堿性蛋白酶的微生物種類較多，如芽孢桿菌、假單胞菌、李斯特菌等細(xì)菌，青霉、毛霉和曲霉等真菌以及鏈霉菌、擬諾卡氏菌等放線菌[1]。其中，芽孢桿菌用途最廣，且最適合用于發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶類的飼料添加劑或者生物飼料。有研究表明，芽孢桿菌所產(chǎn)的蛋白酶在處理動物皮毛方面能夠表現(xiàn)出非常好的性能，如水解蛋白作用、彈性纖維溶解作用以及角蛋白的分解作用等[9-10]；芽孢桿菌所產(chǎn)的堿性蛋白酶除了能夠發(fā)揮降解大分子蛋白質(zhì)的作用以外，還能夠通過細(xì)胞溶解作用殺滅動物腸道中的大腸桿菌、單增李斯特菌、鼠疫桿菌等病原菌[11]。與其他產(chǎn)酶微生物相比，芽孢桿菌還具有非致病性、生長速度快[12]，抗逆性強(qiáng)，產(chǎn)多種活性次級代謝產(chǎn)物[13]，包括細(xì)菌素和脂肽等抗菌物質(zhì)[14]、各種水解酶如淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶等特點。此外，芽孢桿菌還廣泛應(yīng)用于植物病害的生物防治中，是一種重要的生防菌株，所產(chǎn)細(xì)菌素、酶類、活性蛋白質(zhì)以及一些未知蛋白，在抑制植物病原菌方面發(fā)揮巨大的作用[15]。

本試驗擬從自然生境中篩選產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌，通過分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)方法對菌種進(jìn)行鑒定，分析菌株所產(chǎn)蛋白酶的酶學(xué)特性，為蛋白酶以及芽孢桿菌在發(fā)酵飼料、生物飼料以及飼料添加劑的生產(chǎn)制備中提供材料并奠定理論基礎(chǔ)，也為其在植物病害生物防治中的應(yīng)用提供一些參考。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

腸道內(nèi)容物樣品取自健康昆明(KM)小鼠，飼養(yǎng)條件為溫度24 ℃，濕度45%左右，12 h光照黑暗間隔交替，全價顆粒飼料飼喂至10周齡后，進(jìn)行解剖，取腸道內(nèi)容物置于無菌離心管中，4 ℃保存。

1.2 主要儀器設(shè)備

生物顯微鏡(型號為CX31)購于奧林巴斯有限公司；酶標(biāo)儀(ReadMax 1000F)購于上海閃譜生物科技有限公司。

1.3 主要試劑和培養(yǎng)基

蛋白胨、酵母浸粉均購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；葡萄糖、可溶性淀粉、磷酸氫二鉀等均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；福林酚購于北京索萊寶科技有限公司。芽孢桿菌初篩固體培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g、酵母粉5.0 g、葡萄糖10.0 g、磷酸氫二鉀4.0 g、瓊脂20.0 g、蒸餾水1 000 mL、pH=7.0；產(chǎn)蛋白酶篩選固體培養(yǎng)基：芽孢桿菌初篩固體培養(yǎng)基加2%脫脂奶粉或酪蛋白；液體發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g、酵母粉5.0 g、葡萄糖10.0 g、磷酸氫二鉀4.0 g、蒸餾水1 000 mL、pH=7.0；按照以上配方準(zhǔn)確稱取藥品并完全溶解后，在121 ℃，0.11 MPa的條件下，滅菌25 min，冷卻到常溫或者倒平板后接種使用。

1.4 產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌的篩選

1.4.1 初篩

取1 g樣品置于無菌離心管，加入10 mL滅菌生理鹽水，于搖床中振蕩均勻，然后將其置于80 ℃水浴中處理15 min，殺死非芽孢菌體，再用滅菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，將適當(dāng)稀釋的樣品涂布在芽孢桿菌初篩固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24～48 h待平板上長出單菌落。

1.4.2 復(fù)篩

挑取初篩平板上生長情況良好的單菌落分離純化后接種于產(chǎn)蛋白酶篩選固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察長出的單菌落周圍是否產(chǎn)生透明圈。選取透明圈明顯的單菌落進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)24～48 h后取菌液12 000 r/min離心5 min，使用福林酚法測定上清液中蛋白酶活力，選取蛋白酶活力最高的菌進(jìn)行后續(xù)試驗分析。

1.5 產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌的鑒定

1.5.1 形態(tài)學(xué)鑒定

挑取單菌落接種于芽孢桿菌固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察固體平板上長出單菌落的形態(tài)特征，對其進(jìn)行革蘭染色，鏡檢觀察菌體形態(tài)特征。

1.5.2 分子生物學(xué)鑒定

將單菌落接種于芽孢桿菌液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12～24 h，提取新鮮菌液基因組，PCR 獲取16S rDNA后送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序，對獲取的測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST分析菌種信息。

1.6 蛋白酶酶學(xué)特性分析

1.6.1 蛋白酶活力的測定

將發(fā)酵菌液12 000 r/min離心5 min，上清液即為粗酶液。蛋白酶活力的測定方法參考中華人民共和國專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶活力測定法(SB/T 10317—1999)，使用福林酚法[16-17]進(jìn)行測定。酶活力定義：在一定pH和溫度下，每分鐘水解酪蛋白生成1 μg酪氨酸對應(yīng)的酶量為一個酶活單位(U)。

1.6.2 蛋白酶最適反應(yīng)溫度的測定

在一定pH 條件下，分別測定粗酶液在20、30、40、50、60、70及80 ℃條件下的蛋白酶活力，確定最適反應(yīng)溫度。

1.6.3 蛋白酶最適反應(yīng)pH的測定

在一定溫度下，分別測定粗酶液在pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0條件下的蛋白酶活力，確定最適反應(yīng)pH。

1.6.4 蛋白酶溫度穩(wěn)定性的測定

將粗酶液分別在20、30、40、50、60、70及80 ℃條件下，水浴處理30 min，然后在最適反應(yīng)條件下測定粗酶液的剩余蛋白酶活力，分析蛋白酶的熱穩(wěn)定性。

1.6.5 蛋白酶pH穩(wěn)定性的測定

將粗酶液分別在pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0條件下處理30 min，然后在最適反應(yīng)條件下測定粗酶液的剩余蛋白酶活力，分析蛋白酶的pH穩(wěn)定性。

1.6.6 金屬離子對蛋白酶活力的影響

將粗酶液分別加入到終濃度為5 mmol/L的各種金屬離子鹽溶液、EDTA和尿素溶液中，以未加金屬離子的粗酶液作為對照，測定蛋白酶活力，分析不同金屬離子和化學(xué)試劑對蛋白酶活力的影響。

1.7 菌株生長情況和產(chǎn)酶情況分析

挑取劃線平板上的芽孢桿菌單菌落，接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r/min過夜培養(yǎng)12～16 h，以此為種子液。將種子液以1%的接種量接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r/min條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每隔2 h取一次樣，分別測定樣品的菌液濃度(OD600)和蛋白酶活力，并分析該菌株的生長情況和產(chǎn)蛋白酶規(guī)律。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選與鑒定

2.1.1 菌株篩選

以小鼠腸道內(nèi)容物為樣品，將初篩獲得的菌株進(jìn)行產(chǎn)酶檢測，如圖1所示，篩選到兩株產(chǎn)蛋白酶菌，分別命名為SC-1和SC-2，測定其發(fā)酵液上清的蛋白酶活力，發(fā)現(xiàn)SC-2發(fā)酵上清液的蛋白酶活力(46.3 U/mL)高于SC-1發(fā)酵上清液的蛋白酶活力(6.9 U/mL)，因此選取SC-2作為目的菌株進(jìn)行后續(xù)分析。

圖1 產(chǎn)蛋白酶菌產(chǎn)生透明圈示意

2.1.2 菌株形態(tài)學(xué)鑒定

菌株SC-2在平板上的菌落形態(tài)如圖2A所示，菌落色暗呈乳白色，圓形，不透明，表面干燥呈褶皺狀；經(jīng)革蘭染色鏡檢后發(fā)現(xiàn)該菌為革蘭陽性菌，如圖2B所示，鏡檢可見單桿或雙桿菌，(1～2)μm×(15～20)μm，圓端。

2.1.3 分子生物學(xué)鑒定

測序后，將該菌16S rDNA序列信息在NCBI進(jìn)行BLAST比對后發(fā)現(xiàn)SC-2菌株與特基拉芽孢桿菌(Bacillustequilensis，GenBank登錄號：KC172005.1)具有99%的相似度，因此鑒定菌株SC-2為特基拉芽孢桿菌。

圖2 SC-2的菌落形態(tài)(A)和革蘭染色鏡檢(B)

2.2 蛋白酶酶學(xué)特性分析

2.2.1 最適反應(yīng)溫度

如圖3A所示，該菌所產(chǎn)蛋白酶的最適反應(yīng)溫度為50 ℃，在40～70 ℃能夠發(fā)揮80%以上的酶活，在30 ℃能夠發(fā)揮70%的酶活，說明該酶較適合作為飼料用酶。

2.2.2 最適反應(yīng)pH

如圖3B所示，該蛋白酶能夠在pH值為8.0條件下發(fā)揮最大酶活，在pH值為7.0～9.0之間能夠發(fā)揮90%以上的酶活，在pH值為6.0條件下能夠發(fā)揮接近80%的酶活力。

2.2.3 溫度穩(wěn)定性

為了研究蛋白酶在不同溫度下的耐受性，將粗酶液分別在20、30、40、50、60、70及80 ℃條件下處理30 min，然后在pH 8.0，50 ℃條件下測定剩余酶活，結(jié)果如圖4A所示，該蛋白酶在30 ℃下穩(wěn)定性最好，而在20 ℃處理30 min后，剩余酶活為74%，說明低溫對此蛋白酶的活性有一定影響，長期低溫處理可能會降低酶活。隨著處理溫度升高，剩余酶活下降，在70 ℃處理30 min后剩余酶活接近50%，而在80 ℃條件下處理30 min后剩余酶活僅為12%，說明此酶對高溫有一定的耐受性，但是超過70 ℃后穩(wěn)定性表現(xiàn)較差，因此若要進(jìn)行飼料制粒，則需對其進(jìn)行一定的保護(hù)。

2.2.4 pH穩(wěn)定性

為了研究蛋白酶對不同酸堿環(huán)境的耐受性，將蛋白酶分別在pH值3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0條件下處理30 min，然后在最適反應(yīng)條件下測定剩余酶活，結(jié)果如圖4B所示，該蛋白酶在pH為6.0條件下處理30 min，剩余酶活接近80%，穩(wěn)定性較好；在pH值5.0～9.0之間處理30 min后，剩余酶活達(dá)到60%以上，表現(xiàn)出一定的穩(wěn)定性；在pH值為10.0的條件下處理30 min仍能夠保持接近40%的酶活，說明該蛋白酶在中性和弱酸、弱堿條件下均有較好的穩(wěn)定性。

圖3 蛋白酶的最適反應(yīng)溫度(A)和pH(B)

圖4 蛋白酶的溫度(A)和pH(B)穩(wěn)定性分析

2.2.5 金屬離子對酶活的影響

如圖5所示，Ca2+和Mn2+能夠顯著提高酶活(P<0.05)，Zn2+、Mg2+、Cu2+和EDTA、尿素溶液對蛋白酶活力具有顯著抑制作用(P<0.05)。

注：不同大寫字母表示處理之間差異顯著(P<0.05)，字母相同表示差異不顯著(P>0.05)

2.3 菌株生長情況和產(chǎn)酶規(guī)律

該菌的生長情況和產(chǎn)酶規(guī)律如圖6所示，0～4 h為遲緩期，4～16 h為對數(shù)生長期，16 h菌體量達(dá)到最大，16～48 h為穩(wěn)定期，菌體量基本不再變化，若再延長時間進(jìn)行培養(yǎng)，則會進(jìn)入衰亡期，由于營養(yǎng)物質(zhì)不足以維持菌體生長代謝，導(dǎo)致菌體死亡、崩解，菌體量下降；0～8 h處于該菌生長的遲緩期和對數(shù)生長初期，因此蛋白酶分泌的量少，酶活上升速度較慢，8～22 h處于該菌的對數(shù)生長期和穩(wěn)定期初期，因此蛋白酶分泌量多，酶活上升速度較快，22 h蛋白酶活力達(dá)到最大值(57.77 U/mL)，在22～26 h蛋白酶活力略微有所下降，可能由于菌體量過多，營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快導(dǎo)致酶的分泌略微減少，隨后在26～48 h菌體生長穩(wěn)定期，蛋白酶活力基本保持不變。

圖6 菌株SC-2的生長曲線和產(chǎn)酶曲線

3 討論

3.1 產(chǎn)蛋白酶的特基拉芽孢桿菌

作為飼料酶制劑，酸性蛋白酶能夠在動物的胃部發(fā)揮水解作用，對動物攝入的飼料進(jìn)行初步降解，中性蛋白酶能夠在家禽的嗉囊和小腸中發(fā)揮作用，而堿性蛋白酶可在動物小腸中對蛋白質(zhì)進(jìn)行降解[4]。本研究中特基拉芽孢桿菌所產(chǎn)的蛋白酶是一種堿性蛋白酶，在pH為6.0～9.0之間發(fā)揮較高酶活，能夠在小腸中對蛋白質(zhì)進(jìn)行水解；此外，其具備一定的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性，可經(jīng)受動物胃腸道酸度和飼料加工過程中的熱處理，有利于其在飼料業(yè)、食品業(yè)、洗滌液、制革業(yè)以及醫(yī)藥環(huán)保等行業(yè)的應(yīng)用[4,18]。與酸性蛋白酶大多來源于真菌不同，堿性蛋白酶和中性蛋白酶大多數(shù)來源于芽孢桿菌，比如來源于短小芽孢桿菌的蛋白酶BPP-A分別能夠在pH 11.0和pH 13.0對酪蛋白和玉米膠蛋白發(fā)揮最大酶解活力[19]。與眾多產(chǎn)蛋白酶微生物相比而言，芽孢桿菌還表現(xiàn)出生長速度快、培養(yǎng)周期短、易于大規(guī)模發(fā)酵以及基因操作等優(yōu)點[4,20]。本研究篩選獲得的特基拉芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)親緣關(guān)系密切，Gatson于2006年首次從墨西哥哈利斯科州(鄰近特基拉鎮(zhèn))的大約有兩千年歷史的樣品中分離出的革蘭陽性產(chǎn)芽孢桿菌[21]。相對來說，關(guān)于特基拉芽孢桿菌的研究開發(fā)尚處于起步階段[22]。有研究從腐壞的干酪中篩選到產(chǎn)堿性蛋白酶的特基拉芽孢桿菌，所產(chǎn)蛋白酶的最適反應(yīng)條件為pH 9.0，30 ℃[23]；也有研究篩選獲得產(chǎn)抑菌物質(zhì)特基拉芽孢桿菌[22,24]、產(chǎn)葡聚糖酶特基拉芽孢桿菌[12]。上述研究表明，特基拉芽孢桿菌可通過其所產(chǎn)抑菌物質(zhì)抑制植物病原菌的生長而作為一種重要的生防菌，發(fā)揮抗菌、促生等作用[24]；也可通過其所產(chǎn)水解酶的作用對飼料原料中大分子物質(zhì)進(jìn)行降解，開發(fā)新型飼料添加劑。因此，本研究所篩選獲得的特基拉芽孢桿菌在畜牧業(yè)和農(nóng)業(yè)中具有重要的應(yīng)用潛力和價值。

3.2 產(chǎn)酶微生物的篩選

一般而言，對產(chǎn)酶微生物進(jìn)行篩選的方法，有兩種：一是平板法，在含有底物的固體平板培養(yǎng)基中接種待測微生物，觀察長出菌落周圍是否有透明圈來判定該菌是否產(chǎn)酶，操作較簡便；二是酶活檢測法，直接對待測菌株的發(fā)酵上清液進(jìn)行酶活測定，從而確定該菌的產(chǎn)酶情況，方法較繁瑣。本研究通過平板法篩選出兩株產(chǎn)蛋白酶菌株，僅根據(jù)透明圈與菌落大小比值難以判斷產(chǎn)酶水平的高低[25]，進(jìn)一步又通過酶活測定法精確測定菌株產(chǎn)酶水平的高低，最終使用平板法和酶活測定法相結(jié)合來確定目的菌株。

3.3 蛋白酶的應(yīng)用

在所有的蛋白酶來源中，微生物蛋白酶是最重要的一種，在各行各業(yè)中都有廣泛應(yīng)用。蛋白質(zhì)經(jīng)過蛋白酶水解后，除了氨基酸以外，還能夠生成多種活性肽，這些活性肽在食品和飼料行業(yè)中都有很重要的價值，能夠發(fā)揮多種功能，如抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗炎、降低膽固醇、降壓、增強(qiáng)免疫力以及調(diào)節(jié)機(jī)體鈣的吸收等[26]。本研究篩選獲得的特基拉芽孢桿菌所產(chǎn)蛋白酶的最適反應(yīng)條件為50 ℃，pH 8.0，具備一定的熱穩(wěn)定性，可應(yīng)用于飼料業(yè)和食品加工業(yè)，其降解蛋白質(zhì)生成的活性肽等小分子物質(zhì)，還能起到益生元的作用，維護(hù)腸道健康并提高動物免疫力，有助于推動綠色安全畜牧業(yè)的發(fā)展。

4 結(jié)論

本研究從小鼠腸道內(nèi)容物中分離篩選出一株產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定其為特基拉芽孢桿菌；對其所產(chǎn)蛋白酶的酶學(xué)特性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白酶的最適反應(yīng)條件為50 ℃，pH 8.0，該酶在高溫下具有一定的耐受性，在弱酸、中性和弱堿性條件下表現(xiàn)出一定的穩(wěn)定性，Ca2+和Mn2+能夠顯著提高酶活，Zn2+、Mg2+、Cu2+和EDTA、尿素溶液對蛋白酶活力具有顯著抑制作用；通過對其生長情況和產(chǎn)酶規(guī)律進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該酶在16 h菌體量達(dá)到最大值，在22 h上清液中的蛋白酶活力達(dá)到最高值(57.77 U/mL)。該產(chǎn)酶菌的成功篩選分離，為新型飼料添加劑以及生防菌的開發(fā)利用提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。