黃祚建,張瑞昊,王軍，陳明銀，陶利文，任竹青

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2. 十堰市畜牧技術(shù)推廣站，湖北 十堰 442000；3. 武漢市江夏區(qū)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化服務(wù)中心，湖北 武漢 430200；4. 武漢市動物疫病預(yù)防控制中心，湖北 武漢 430016)

目前傳統(tǒng)的生物脫氮技術(shù)A/O、SBR、氧化溝等對生活污水和工業(yè)污水有比較好的效果。對于豬場污水而言雖然其效果較好但在運行成本和處理價格的壓力之下難以在中小型養(yǎng)殖場進行推廣應(yīng)用。傳統(tǒng)生物脫氮工藝在整個脫氮流程中必須要經(jīng)歷完整的從氨氮到正硝酸鹽之后，從正硝酸鹽返回亞硝酸鹽，最后經(jīng)反硝化作用完成脫氮[1]。在這一流程中，制約脫氮效果的主要因素一方面是硝化菌群硝化能力是能否讓水中有充足的硝酸鹽及衍生物的積累，另一方面就是在反硝化過程中是否能夠獲得充足的有效碳源供給[2]。硝化菌群繁殖速度慢、代際間隔較長，因此選擇較長的污泥齡是處理工藝中側(cè)重脫氮方向的策略之一[3]。然而為了保證達標(biāo)排放，豬場廢水也有較高的除磷要求。磷代謝中，需要通過去除污泥的方式將已經(jīng)吸收磷鹽的聚磷菌去除，因此除磷的壓力迫使反應(yīng)器難以維持較長的污泥齡[4]。因此在有限污泥齡內(nèi)提高反應(yīng)器的脫氮效率是工藝改進的重要方向。

另一方面來看豬場廢水的實際可生化性并沒有達到傳統(tǒng)印象中的易于生化廢水。在實際應(yīng)用中，生物反應(yīng)器處理的廢水大多是以沼液的形式作為進水。實際上經(jīng)過厭氧處理后沼液的可生化性已經(jīng)變得十分有限，在經(jīng)過好氧處理后對于脫氮而言碳源也可能成為其限制因素之一[5]。

異養(yǎng)硝化-好氧反硝化(HN-AD)菌的作為一種同時具有能進行硝化反應(yīng)和反硝化反應(yīng)能力的細菌，可以為傳統(tǒng)生物脫氮工藝降成本改造提供新的思路，也可以為新的脫氮工藝-同步硝化反硝化工藝(SND)提供相應(yīng)菌株。

自Skerman研究團隊在1951年首次發(fā)現(xiàn)了好氧反硝化現(xiàn)象，認識到反硝化反應(yīng)也可以在好氧條件下進行，到Robertson等1985年分離出第1株菌異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌(Thiosphaerapantotropha)。隨著人們對異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌的研究在逐漸深入，通過各種材料先后篩選出多種異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株[6]，主要集中在假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenessp.)、副球菌屬(Pracoccussp.)、芽孢桿菌屬(Bacillussp.)等[7]，但是目前仍還有新的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌未被發(fā)現(xiàn)和認知[8]。

1 材料與方法

1.1 材料選擇及試驗設(shè)計

以豬場污水處理系統(tǒng)中污泥為原材料曝氣培養(yǎng)馴化，采用BTB培養(yǎng)基篩選好氧反硝化菌株，再檢測是否有異養(yǎng)硝化能力；挑選具有高效能的HN-AD菌株進行形態(tài)特征和16S rDNA序列分析，鑒定種屬；探討不同的生態(tài)因子(溫度、pH、溶氧量)和水體氨氮濃度對篩選HN-AD菌的生長及脫氮性能影響；將篩選的HN-AD菌投入豬場污水中，觀察菌株在豬場污水中實際應(yīng)用效果。

1.1.1 菌株的篩選鑒定

將采集的污泥、污水在硝化富集培養(yǎng)基中進行好氧曝氣富集培養(yǎng)2個月后，取反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)后的活性污泥制成細菌懸液，采用倍比稀釋法稀釋成 10-1～ 10-7梯度的菌懸液；再用滅菌接種環(huán)蘸取菌液在 BTB 固體培養(yǎng)基上進行多輪劃線培養(yǎng)純化，直至每次得到的菌落形態(tài)特征一致，不會出現(xiàn)其他的雜菌菌落；運用菌株形態(tài)學(xué)鑒定和16S rDNA序列分析技術(shù)，鑒定所篩選的菌株。

1.1.2 探究各生長因子對菌株生長性能的影響

考慮到各類環(huán)境因素在菌株實際應(yīng)用中可能會影響，因此設(shè)計以下3組單一變量試驗測試菌的最佳生長條件。所有試驗所使用的培養(yǎng)基均為異養(yǎng)氨氧化培養(yǎng)基。由于篩選過程中的溫度為30 ℃、pH=7、轉(zhuǎn)速為120 r/min等條件，因此在控制單一變量時，其他條件均采用篩選條件進行設(shè)定。所得試驗組如下：①研究溫度對HN-AD菌的生長及脫氮性能的影響，設(shè)定3組單因素控制試驗反應(yīng)條件為：分別置于溫度為20 ℃、30 ℃、40 ℃、pH=7，轉(zhuǎn)速頻率為120 r/min 的搖床中培養(yǎng)；②研究轉(zhuǎn)速對HN-AD菌的生長及脫氮性能的影響，設(shè)定試驗反應(yīng)條件為：分別置于溫度為30 ℃、pH=7，轉(zhuǎn)速為60、120、240 r/min 的搖床中培養(yǎng)；③研究pH對HN-AD菌的生長及脫氮性能的影響，設(shè)定試驗反應(yīng)條件為：分別置于溫度為30 ℃、pH=5、6、7、8、9，轉(zhuǎn)速頻率為120 r/min 的搖床中培養(yǎng)。

1.1.3 菌株耐氨氮能力測定

1910年夏，俄國派以波波夫為首的考察隊前往唐努烏梁海進行詳細考察，在途中成員奧古斯圖斯焚毀了唐努烏梁海西南邊境察布齊雅勒達壩的界牌⑥ 樊明方.唐努烏梁海歷史研究〔M〕.北京:中國社會科學(xué)出版社,2007.第215頁。，然后俄國政府開始公然提出烏梁海是“有爭議地區(qū)”，無視歷史上中俄條約的規(guī)定，為以后侵占唐努烏梁海制造根據(jù)。1911年初，俄國出現(xiàn)大量有關(guān)唐努烏梁海的書籍和報刊，歪曲事實，鼓吹侵占唐努烏梁海。

1.1.4 菌株對豬場污水實際處理效果

1.2 試驗藥品和測定指標(biāo)方法

1.2.1 試驗中所用到的培養(yǎng)基及成分配比

硝化富集培養(yǎng)基:(NH4)2SO40.5 g；檸檬酸三鈉 4.08 g；KH2PO41.0 g；氯化亞鐵0.5 g；硫酸鎂1.0 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

溴百里酚藍(BTB)篩選培養(yǎng)基：KNO31.0 g；L-天冬酰胺1.0 g；檸檬酸三鈉8.5 g；KH2PO41.0 g；氯化亞鐵0.05 g；硫酸鎂1.0 g；氯化鈣0.2 g；瓊脂20 g；0.1%溴百里酚藍酒精溶液(BTB)5 mL，蒸餾水定容至1 000 mL。

異養(yǎng)氨氧化培養(yǎng)基：(NH4)2SO40.472 g；檸檬酸三鈉4.902 g；K2HPO40.2 g；硫酸鎂0.05 g；硫酸亞鐵 0.01 g；硫酸錳 0.01 g；NaCl 0.12 g蒸餾水定容至1 000 mL。

以上3種培養(yǎng)基滅菌前均需調(diào)節(jié)pH 7.0～7.5，滅菌條件為 121 ℃，20 min。

1.2.2 試驗中測定指標(biāo)方法

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2007和SPSS 18.0進行統(tǒng)計分析，主要進行t檢驗來判斷組間數(shù)據(jù)差異顯著性，所有結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選和鑒定

通過對富集到的菌株提取DNA并進行16 s測序比對，結(jié)果與開塞利節(jié)桿菌(ArthrobacterKeyseri)相似度達99%。革蘭染色顯示該菌為革蘭陽性菌，明場觀察該菌呈現(xiàn)短桿棒狀，菌落呈淡黃色不透明點狀分布，具有產(chǎn)堿能力。根據(jù)細菌生長形態(tài)特征參照《伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》確證與測序結(jié)果一致，該菌為開塞利節(jié)桿菌。在明場下的菌落形態(tài)和革蘭染色結(jié)果分別為圖1(A)和圖1(B)，圖1(C)為系統(tǒng)進化樹Target為本試驗中篩到的菌株。

2.2 常見因素對菌生長及除氮性能影響

為探究該菌最佳生長條件而設(shè)置的溫度、pH值、轉(zhuǎn)速三組單因素試驗。結(jié)果如表1所示，開塞利節(jié)桿菌除氮性能最佳生長條件分別為溫度為30 ℃，轉(zhuǎn)速120 r/min，pH為7，最適生長條件下經(jīng)過36 h處理后，培養(yǎng)基中氨氮濃度由110.0下降至6.4 mg/L，去除率可達94.2%。

2.3 高氨氮濃度廢水對菌生長性能影響

為探究開塞利節(jié)桿菌對氨氮濃度的耐受能力而設(shè)計5組試驗。結(jié)果如表2所示，開塞利節(jié)桿菌具有很強的耐高氨氮濃度能力，可以在氨氮濃度達2 000 mg/L的環(huán)境中生長，且有一定氨氮出去率，在氨氮濃度為200～800 mg/L 的環(huán)境條件下，氨氮去除率均超過70%。

2.4 菌株對豬場廢水實際處理效果測定

圖1 開塞利節(jié)桿菌的形態(tài)與系統(tǒng)進化樹

表1 溫度、轉(zhuǎn)速、pH對菌株生長及性能影響

表2 不同濃度的氨氮含量對菌生長及性能影響

3 討論

本試驗利用控制變量法分別測定溫度、轉(zhuǎn)速、pH及氨氮濃度4種生長影響因子對開塞利節(jié)桿菌的生長發(fā)育及氨氮去除率影響，數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，開塞利節(jié)桿菌在溫度為30 ℃，pH=7和轉(zhuǎn)速為120 r/min時生長最佳，36 h氨氮去除率可達94.28%；在較低的溫度(t=20 ℃)、低轉(zhuǎn)速(r=60 r/min)、酸性條件(pH=5)條件下，開塞利節(jié)桿菌生長較慢，甚至在36 h振蕩培養(yǎng)后還未進入平臺期，氨氮去除率也大幅度下降?？梢娫诘蜏?、低溶氧量和pH過低的條件下開塞利節(jié)桿菌的生長發(fā)育都會受到一定程度的抑制，影響處理系統(tǒng)的脫氮效率。一方面低溫、過酸條件的環(huán)境可能會降低影響HN-AD菌體內(nèi)相關(guān)酶的活性，從而影響系統(tǒng)的脫氮性能；另一方面溫度還會影響該過程中作為基質(zhì)的游離氨濃度。4種HN-AD菌株在生長發(fā)育和脫氮的過程中，pH會有一定程度的上升，其中開塞利節(jié)桿菌在30 ℃條件下36 h振蕩培養(yǎng)后pH從6.07增長至8.02，可見HN-AD 過程產(chǎn)堿進而導(dǎo)致體系pH值升高,與潘丹研究P9菌(申氏桿菌屬Shinellasp.)在脫氮的同時pH值從6.8迅速升至8.9，最后趨于穩(wěn)定的結(jié)果相一致[9]。本次試驗篩選的開塞利節(jié)桿菌耐受pH能力在6～9，與廖小紅等[10]研究的BacilluscereusWXZ-8和嚴(yán)新杰等[11]研究Delftiasp. pH 耐受范圍在5～9一致。

豬場污水作為一種含高濃度氨氮有機物廢水，利用生物脫氮技術(shù)來處理含高濃度氨氮污水，不僅考慮到微生物自身的脫氮能力的強弱，還應(yīng)該考慮豬場廢水的水質(zhì)條件是否會因其毒性作用而對處理菌群產(chǎn)生不利影響。眾所周知豬場廢水中的污染物濃度偏高，即使是經(jīng)過一輪厭氧處理后殘留的沼液，其中的氨氮、總磷、COD等污染物濃度較高且生物毒性較強，嚴(yán)重影響污泥反應(yīng)器去除效果。本研究中的菌株初始篩選的環(huán)境就是直接收納豬場廢水的兼性塘，在篩選過程中分別對低氨氮水平(200 mg/L、400 mg/L)、中氨氮水平(800 mg/L)與高氨氮水平(1 600 mg/L、2 000 mg/L)進行了不同的耐受性驗證。結(jié)果顯示在低氨氮濃度組中開塞利節(jié)桿菌完全能夠正常生長發(fā)育，并在36 h前到達平臺生長狀態(tài)，氨氮處理去除率在80%以上；中等氨氮水平下開塞利節(jié)桿菌生長受到一定抑制，盡管相比低氨氮組氨氮去除率降低，但其去除率仍能維持在75%以上；高氨氮濃度組開塞利節(jié)桿菌生長繁殖受到顯著抑制，當(dāng)氨氮負荷為1 600 mg/L時，開塞利節(jié)桿菌仍維持 52.07% 的氨氮去除率；當(dāng)氨氮負荷增加至2 000 mg/L時，由于本身試驗組的生物毒性較強，此時開塞利節(jié)桿菌的氨氮去除率僅為33.64%。但是通過對氨氮去除的絕對量進行計算，我們認為在高氨氮試驗組中處理能力的下降不僅是因為高氨氮帶來的生物毒性對生長的抑制，同時還可能是試驗條件中C/N比值的改變迫使菌群調(diào)整了生長代謝的主要途徑，碳源供給不足對開塞利節(jié)桿菌的脫氮效果產(chǎn)生了影響。在氨氮耐受試驗中，氨氮的濃度作為該試驗中唯一變量，導(dǎo)致隨著氨氮水平的升高C/N比值不斷降低，針對試驗中氨氮去除絕對量進行分析，可以認為本菌在高氨氮水平下仍有較好的耐受能力和處理效率。

通過添加外源菌群提高活性污泥法處理效果的過程當(dāng)中，外源菌群定植并成為優(yōu)勢菌群僅是一種情況；另一類則是在各類因素(外源菌群、處理藥劑等添加或工藝調(diào)整等)綜合作用下優(yōu)化了菌群的組成結(jié)構(gòu)，從而獲得處理效果的提升。本試驗以豬場廢水兼行塘中污泥為原材料，篩選獲得的菌株并進行了相應(yīng)的氨氮耐受試驗，證明了其在豬場廢水中能夠有效的適應(yīng)生長。實效試驗中，通過在豬場廢水處理系統(tǒng)中添加菌液，對前后進出水狀況和處理效果進行綜合評判，最終證明了其確實能夠在一定程度上提高該系統(tǒng)的氨氮和總氮去除效果。

4 結(jié)論