徐琳赟，古麗孜熱·曼合木提，韓 劍，2，蔣 萍，黃 偉，羅 明，2*

(1 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2 新疆維吾爾自治區(qū)高校農(nóng)林有害生物監(jiān)測(cè)與安全防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830052；3 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與園藝學(xué)院，烏魯木齊 830052；4 新疆巴州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，新疆庫(kù)爾勒 841003)

中國(guó)是全球栽培梨的三大起源中心之一，也是全球主要的梨生產(chǎn)區(qū)域，梨種植面積和產(chǎn)量占世界梨栽培面積和總產(chǎn)量的69.1%和68.4%，出口量居世界第一。庫(kù)爾勒香梨(簡(jiǎn)稱香梨，Pyrussinkiangensis)已有1400年栽培歷史，是一個(gè)地域性極強(qiáng)的地方特色品種。新疆得天獨(dú)厚的地理優(yōu)勢(shì)和氣候條件造就了香梨皮薄肉脆、香味濃郁和耐貯力強(qiáng)等優(yōu)良品質(zhì)而享譽(yù)國(guó)內(nèi)外。目前中國(guó)香梨種植面積達(dá)7.3萬(wàn)hm2，主要分布在新疆巴州庫(kù)爾勒、輪臺(tái)和阿克蘇地區(qū)，總產(chǎn)量104.6萬(wàn)噸，是新疆特色經(jīng)濟(jì)林果產(chǎn)業(yè)的重要支柱產(chǎn)業(yè)，在促進(jìn)農(nóng)業(yè)增效、農(nóng)民增收和區(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。

隨著香梨生產(chǎn)的發(fā)展，種植規(guī)模不斷擴(kuò)大，各種病害相繼發(fā)生，成為影響香梨生產(chǎn)的突出問(wèn)題。近年來(lái)梨樹(shù)腐爛病、褐斑病、果實(shí)黑斑病等常見(jiàn)病害逐年回升，危害愈加嚴(yán)重；同時(shí)一些潛在的重大病害發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)加大，如梨、蘋(píng)果等仁果類果樹(shù)最具毀滅性的、重大檢疫性細(xì)菌病害梨火疫病(Erwiniaamylovora)[1]。該病害目前已擴(kuò)散分布于世界近60個(gè)國(guó)家和地區(qū)，目前中國(guó)尚無(wú)發(fā)生的報(bào)道。最近十年內(nèi)與中國(guó)毗鄰的韓國(guó)[2]、日本[3]、哈薩克斯坦[4]、吉爾吉斯斯坦[5]和俄羅斯等國(guó)相繼有發(fā)現(xiàn)梨火疫病的報(bào)道。胡白石等[6]對(duì)“梨火疫病”的入境風(fēng)險(xiǎn)分析顯示該病害為中國(guó)特高風(fēng)險(xiǎn)有害生物。隨著林果品種引進(jìn)和種苗調(diào)運(yùn)，進(jìn)口水果貿(mào)易增加，加劇了梨火疫病等有害生物傳播的風(fēng)險(xiǎn)，是香梨產(chǎn)業(yè)安全生產(chǎn)的重大隱患，值得高度重視并及早采取預(yù)防措施。目前香梨病害的防治仍然主要依賴化學(xué)農(nóng)藥，由此引起的病菌抗藥性、環(huán)境污染及果實(shí)的農(nóng)藥殘留問(wèn)題愈加突出，尋求環(huán)境友好和安全有效的生物防治措施防控香梨病害日益受到人們的重視。

植物內(nèi)生細(xì)菌生活在健康植物的各種組織內(nèi)部，是植物微生態(tài)系統(tǒng)中的天然組成部分。內(nèi)生細(xì)菌在植株體內(nèi)具有穩(wěn)定的生存空間，在植物體內(nèi)定殖、傳導(dǎo)，通過(guò)產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)及位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)和誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性(induced systemic resistance，ISR)等作用機(jī)制抑制病原菌的侵染，提高宿主植物抗病性和促進(jìn)生長(zhǎng)；還可作為外源抗性基因載體，構(gòu)建基因工程菌等，在植物病害生物防治中是一類獨(dú)具優(yōu)勢(shì)、極具應(yīng)用潛能的新的資源菌[7]。國(guó)內(nèi)外已有內(nèi)生細(xì)菌用于棉花、馬鈴薯、水稻、玉米及甘藍(lán)、番茄、橡樹(shù)和水果產(chǎn)后病害防治的報(bào)道[8]。郭睿文[9]從獼猴桃中篩選出對(duì)獼猴桃潰瘍病病原菌有較強(qiáng)抑制作用的拮抗菌。劉慧芹等[10]從蘋(píng)果、梨、杏等果樹(shù)的木質(zhì)部中分離的內(nèi)生細(xì)菌中篩選出拮抗菌株X8，對(duì)番茄灰霉病和辣椒疫病的防效達(dá)到75.4%和79.3%，顯著高于50%腐霉利和25%甲霜靈的防效，具有作為生物農(nóng)藥開(kāi)發(fā)利用的價(jià)值。譚小艷等[11]從柑橘葉片中分離到對(duì)柑橘潰瘍病菌有拮抗作用的細(xì)菌菌株Bc51，并對(duì)其進(jìn)行了鑒定及抑菌活性的測(cè)定。而目前研究中對(duì)香梨內(nèi)生細(xì)菌及其生物防治作用的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究從香梨植株中分離內(nèi)生細(xì)菌，針對(duì)梨樹(shù)重要的3種病原菌——梨火疫病(Erwiniaamylovora)、梨梢枯病菌(Pseudomonassyringaepv.syringae)和梨樹(shù)腐爛病菌(Valsamalivar.pyri)，篩選出具有較強(qiáng)抑菌作用的拮抗菌株，測(cè)定拮抗菌株對(duì)梨火疫病生防作用的潛力，為發(fā)掘利用內(nèi)生細(xì)菌的生防資源，探索梨樹(shù)病害的生物防治途徑奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 培養(yǎng)基及緩沖液

內(nèi)生細(xì)菌分離和培養(yǎng)[12]：營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)；病原細(xì)菌的培養(yǎng)和拮抗試驗(yàn)：LB培養(yǎng)基；病原真菌培養(yǎng)和拮抗試驗(yàn)：馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)。

PBS緩沖液：0.2 mol/L KH2PO4溶液和0.2 mol/L K2HPO4溶液配制，pH7.2。

1.2 內(nèi)生細(xì)菌的分離材料

從新疆庫(kù)爾勒市哈爾巴克鄉(xiāng)、沙依東園藝場(chǎng)、尉犁縣和輪臺(tái)縣香梨種植園，采集健康香梨樹(shù)上的新鮮花器、當(dāng)年生新生枝條、葉片和果實(shí)樣品，樣品迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，采用4 ℃冰箱冷藏，備用。

1.3 供試病原菌

梨火疫病菌(Erwiniaamylovora)E.a0055 菌株來(lái)源于美國(guó)，梨分離物由新疆烏魯木齊海關(guān)技術(shù)中心提供。

梨梢枯病菌(Pseudomonassyringaepv.syringae)來(lái)源于新疆伊犁的梨分離物，由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

梨樹(shù)腐爛病菌(Valsamalivar.pyri)菌株來(lái)源于新疆庫(kù)爾勒的香梨分離物，由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院林木病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.4 香梨內(nèi)生細(xì)菌的分離和純化

將采集的健康梨樹(shù)的枝條、花、葉片和果實(shí)在自來(lái)水流水下沖洗1～2 h，再用無(wú)菌水沖洗，稱取花瓣、枝條(剪成0.5～1 cm的小段)、葉片和果實(shí)(剪成4 mm2的組織塊)各1 g，用75%酒精浸泡1 min，將用1%次氯酸鈉浸泡2～5 min，無(wú)菌水沖洗3～5次。取最后一次無(wú)菌水沖洗液0.l mL分別涂布于NA培養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)2～3 d，觀察有無(wú)菌落長(zhǎng)出檢測(cè)樣品表面滅菌是否徹底。取表面滅菌徹底的樣品放入滅菌的研缽中，每1 g樣品中加入10 mL PBS緩沖液將組織充分研磨，靜止10 min后，用移液槍吸取上清液加入試管無(wú)菌水中，充分混勻制成不同稀釋度的稀釋液。吸取100 μL樣品稀釋液注入到NA培養(yǎng)基平板上，均勻涂布后放入恒溫培養(yǎng)箱28 ℃培養(yǎng)2～3 d。根據(jù)平板上長(zhǎng)出菌落的不同形態(tài)、顏色、大小挑取單菌落，反復(fù)劃線純化后，轉(zhuǎn)接到NA培養(yǎng)基斜面，4 ℃保藏。

1.5 內(nèi)生細(xì)菌的抑菌作用測(cè)定及拮抗菌篩選

1.5.1 病原菌的準(zhǔn)備將梨火疫病原細(xì)菌和梨梢枯病菌活化，挑取單菌落接入LB培養(yǎng)液中，在28 ℃、150 r/min搖床上振蕩培養(yǎng)24～48 h至菌液OD600= 0.8～1.0，用無(wú)菌水稀釋至濃度為107cfu/mL菌懸液，備用。

將梨樹(shù)腐爛病菌活化，接種于PDA培養(yǎng)基平板上，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后，用滅菌打孔器沿菌落邊沿取直徑為6 mm的菌餅備用。

1.5.2 拮抗菌的初篩病原細(xì)菌拮抗菌的初篩采用同步培養(yǎng)法測(cè)定。分別取梨火疫病菌(濃度為107cfu/mL)和梨梢枯病菌(濃度為107cfu/mL)菌懸液0.1 mL在NA培養(yǎng)基平板上涂板。用接種環(huán)在待測(cè)內(nèi)生細(xì)菌菌株活化的菌落上蘸取一環(huán)菌體，在涂菌平板邊緣2 cm的圓周上等距離點(diǎn)接4個(gè)點(diǎn)，每菌株設(shè)3次重復(fù)。26～28 ℃培養(yǎng)2～3 d后，十字交叉法測(cè)量相對(duì)抑菌圈大小。

病原真菌采用異步培養(yǎng)法測(cè)定。將梨樹(shù)腐爛病菌菌餅分別置于PDA平板中央，在距培養(yǎng)皿邊緣2 cm的圓周上等距離4點(diǎn)接種待測(cè)內(nèi)生細(xì)菌，26～28 ℃培養(yǎng)。當(dāng)病原真菌長(zhǎng)至培養(yǎng)皿邊緣時(shí)，十字交叉法測(cè)量抑菌圈大小。每皿點(diǎn)接1株待測(cè)內(nèi)生細(xì)菌，每菌株設(shè)3次重復(fù)。

抑菌圈半徑(mm)=[抑菌圈直徑(mm)-測(cè)試菌直徑(mm)]/2

1.5.3 拮抗菌的復(fù)篩梨火疫病和梨梢枯病拮抗菌的復(fù)篩：將初篩的對(duì)梨火疫病菌和梨梢枯病菌具有拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌菌株在LB平板上活化后，用接種環(huán)移取一環(huán)放入裝有50 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24～48 h至菌液OD600= 0.8～1.0。分別吸取病原細(xì)菌梨火疫病菌和梨梢枯病菌的菌懸液0.1 mL均勻涂抹在NA平板上，在距涂菌平板邊緣2 cm的圓周上等距離位置放置4個(gè)滅菌濾紙片(直徑4 mm)的，用移液槍吸取5 μL初篩拮抗菌菌懸液滴加在濾紙片上，以加入等量滅菌的LB液體培養(yǎng)基為對(duì)照，28 ℃下培養(yǎng)2～3 d后，十字交叉法測(cè)量抑菌圈大小。每菌株設(shè)3皿重復(fù)。

腐爛病拮抗菌的復(fù)篩：將梨樹(shù)腐爛病菌菌餅置于PDA平板中央，在距培養(yǎng)皿邊緣2 cm的圓周上等距離插入4只牛津杯(直徑為8 mm)，加入40 μL初篩拮抗菌培養(yǎng)液(OD600= 0.8～1.0)，26～28 ℃培養(yǎng)5～7 d后，測(cè)量抑菌圈大小。每菌株設(shè)3次重復(fù)。

1.6 內(nèi)生拮抗菌對(duì)梨火疫病防效的生物測(cè)定

1.6.1 拮抗菌和病原菌接種液的制備將待測(cè)拮抗菌菌株活化后接種于NA培養(yǎng)液，150 r/min、28 ℃搖菌24 h至OD600= 0.8～1.0做為接種液。同1.5.1將梨火疫病菌0055新鮮培養(yǎng)液稀釋至濃度107cfu/mL作為接種液。

1.6.2 香梨離體花序接種在香梨果園初花期采集花枝，插入0.05% NaCl溶液中防腐保濕。用手持式壓力噴霧器將待測(cè)拮抗菌菌液噴霧接種梨花序，每朵花噴菌液約80 μL，每個(gè)拮抗菌株接種50花序，重復(fù)3次；同時(shí)設(shè)噴施農(nóng)用鏈霉素(華北制藥廠生產(chǎn)，有效成分72%)4 000倍液對(duì)照，及無(wú)菌水為空白對(duì)照，在25 ℃、70%空氣濕度的人工氣候箱中培養(yǎng)24 h后噴霧接種病原菌液，每朵花約80 μL。將接種后的花序置于人工氣候箱中25 ℃、70%空氣濕度培養(yǎng)，3、5和7 d后定時(shí)觀察記錄發(fā)病情況，統(tǒng)計(jì)花腐率并計(jì)算防效。試驗(yàn)結(jié)束后將發(fā)病植株材料干熱滅菌后銷毀。

花腐率(%)=(病花數(shù)/總花數(shù))×100%

花腐防效(%)=(對(duì)照花腐率-處理花腐率)/對(duì)照花腐率×100%

1.6.3 盆栽杜梨苗接種(1) 拮抗菌對(duì)梨火疫病的保護(hù)性防效。試驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)室人工氣候箱中進(jìn)行，以盆栽2年生杜梨苗為接種材料。用手持式壓力噴霧器將待測(cè)拮抗菌菌液噴霧至葉片與枝條完全濕潤(rùn)，每個(gè)菌株噴施5盆(約25個(gè)枝條)，重復(fù)3次。同時(shí)設(shè)噴施農(nóng)用鏈霉素(華北制藥廠生產(chǎn)，有效成分72%)4 000倍液為對(duì)照，以無(wú)菌水噴霧為空白對(duì)照。拮抗菌接種后的杜梨苗放入28.5 ℃、相對(duì)濕度75%、光照12 h的人工氣候箱中培養(yǎng)。72 h后再噴霧接種病原菌液，繼續(xù)在人工氣候箱中再培養(yǎng)。每天觀察發(fā)病情況，記錄發(fā)病枝條數(shù)、測(cè)定枝枯長(zhǎng)度、枝枯長(zhǎng)度占接種枝條長(zhǎng)度的比例及發(fā)病級(jí)別。根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)，統(tǒng)計(jì)防效。試驗(yàn)結(jié)束后將發(fā)病植株材料干熱滅菌后銷毀。

(2) 拮抗菌對(duì)梨火疫病的治療性防效。治療性試驗(yàn)病原菌和拮抗菌的接種順序與(1)的保護(hù)性試驗(yàn)相反，即先在杜梨苗上噴施接種病原菌液72 h后再噴施拮抗菌液，其他試驗(yàn)材料、培養(yǎng)條件及防效調(diào)查方法等均與保護(hù)性試驗(yàn)一致。

參考Paprstein等[13]的方法并改進(jìn)，制定梨火疫病原菌接種離體枝條的病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[14]：0級(jí)，枝條無(wú)病斑；Ⅰ級(jí)，枝條病斑長(zhǎng)度占接種枝條長(zhǎng)度的1%～5%；Ⅲ級(jí)，枝條病斑長(zhǎng)度占接種枝條長(zhǎng)度的6%～15%；Ⅴ級(jí)，枝條病斑長(zhǎng)度占接種枝條長(zhǎng)度的16%～30%；Ⅶ級(jí)，枝條病斑長(zhǎng)度占接種枝條長(zhǎng)度的31%～50%；Ⅸ級(jí)，枝條病斑長(zhǎng)度占接種枝條長(zhǎng)度>51%。依據(jù)離體枝條接種后相同時(shí)間的病情指數(shù)劃分病原菌的致病力。

發(fā)病率(%)=(發(fā)病枝條數(shù)/接種總枝條數(shù))×100%

病情指數(shù)=∑(各級(jí)發(fā)病枝條數(shù)×病級(jí)代表值)/(接種總枝條數(shù)×最高級(jí)值)×100

枝枯防效(%)=(對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對(duì)照病情指數(shù)×100%

1.7 拮抗菌株的鑒定

1.7.1 形態(tài)和培養(yǎng)特征將拮抗菌株劃線接種于LB培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并描述其菌落形態(tài)特征。同時(shí)進(jìn)行革蘭氏染色，觀察供試菌株的菌體大小、形態(tài)、芽孢的有無(wú)、形狀及著生位置等，主要參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》等[15]。

1.7.2 16S rDNA和rpoD基因序列測(cè)定及分析以采用熱裂解法提取的拮抗細(xì)菌菌株總DNA為模板，采用細(xì)菌通用引物進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增。正向引物27F(5′-GAGTTTGATCCTGGTCAG-3′)，反向引物1492R(5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)，目標(biāo)片段長(zhǎng)度約1 500 bp。擴(kuò)增體系25 μL：DNA模板2.0 μL，引物(10 μmol/L)各0.5 μL，Tap PcR MAster Mix(購(gòu)自上海生工生物工程有限公司) 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳儀電壓100 V條件下經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)30 min，檢測(cè)合格后由上海生工生物工程有限公司完成測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nlh.gov)網(wǎng)站中進(jìn)行Blast比對(duì)分析，與GenBank中已知菌株的16S rDNA進(jìn)行序列相似性比較，選取序列相似性高的菌株利用MEGA5.05軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 香梨植株內(nèi)生細(xì)菌的分離結(jié)果

對(duì)采集的健康香梨樹(shù)的花、葉、枝條和果實(shí)中定殖的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行數(shù)量測(cè)定和分離。結(jié)果表明，香梨樹(shù)的花、葉、枝條和果實(shí)中均存在內(nèi)生細(xì)菌，不同組織中內(nèi)生細(xì)菌的分布密度不同。枝條中的菌群密度最高(3.5×104～4.4×105cfu/g，平均3.9×105cfu/g)，其次是葉片(2.8×104～1.7×105cfu/g)，平均2.3×105cfu/g)，再次是花(1.0× 104～1.3×105cfu/g，平均1.1×104cfu/g)，果實(shí)中最少。

依據(jù)內(nèi)生細(xì)菌的菌落形態(tài)、大小、顏色、表面光滑程度及分布部位的不同，選取單菌落反復(fù)純化，共分離獲得內(nèi)生細(xì)菌菌株337株，包括枝條120株，葉片110株，花80株，果實(shí)27株。

2.2 內(nèi)生細(xì)菌的抑菌作用測(cè)定及拮抗菌篩選

以梨樹(shù)3種重要病害梨火疫病、梨梢枯病和梨樹(shù)腐爛病的病原菌為靶標(biāo)病原菌，測(cè)定分離內(nèi)生細(xì)菌的抑菌作用，從中篩選拮抗菌株。初篩結(jié)果顯示(表1)，337株內(nèi)生細(xì)菌菌株中，有14株具有明顯的抑菌作用，對(duì)初篩中表現(xiàn)出有抑菌作用的菌株進(jìn)一步復(fù)篩，結(jié)果與初篩結(jié)果基本一致。通過(guò)篩選分別獲得對(duì)梨火疫病梨、梨梢枯病菌和梨樹(shù)腐爛病菌的拮抗菌株有7株、8株和4株。其中對(duì)梨火疫病菌的抑菌作用較強(qiáng)(抑菌圈半徑>4 mm)的拮抗菌株有SN37、HN89和HN143；內(nèi)生菌TN50菌株雖然在平板抑菌作用測(cè)定中不產(chǎn)生抑菌圈，但該菌株在與病原菌共培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)速度快，競(jìng)爭(zhēng)能力強(qiáng)，能在24 h迅速覆蓋病原菌菌落，故也將其作為備選的生防潛力菌株。對(duì)梨梢枯病菌的抑菌作用較強(qiáng)(抑菌圈半徑>4 mm)的有SN16、HN89、ZN5和HN30，對(duì)梨樹(shù)腐爛病菌均有較強(qiáng)抑菌作用(抑菌圈半徑>5 mm)的菌株是HN89、ZN5、SN19和HN9菌株。ZN5、SN19和HN9菌株對(duì)梨梢枯病菌和梨樹(shù)腐爛病菌均有拮抗作用，HN89菌株對(duì)3種病原菌都具有較強(qiáng)的抑菌作用。

表1 香梨內(nèi)生細(xì)菌菌株對(duì)3種病原菌的抑菌作用測(cè)定結(jié)果

2.3 內(nèi)生拮抗細(xì)菌對(duì)梨火疫病的防效

將篩選出的對(duì)梨火疫病菌具有抑菌作用的7個(gè)菌株(SN37、HN89、HN98、HN143、HN126、TN68、TN16)和具有競(jìng)爭(zhēng)作用的TN50菌株，通過(guò)離體花序、杜梨苗接種，測(cè)定其對(duì)該病害的防治效果。

2.3.1 對(duì)香梨花腐的保護(hù)性防效在離體香梨花序上噴施拮抗菌株菌液，再接種病原菌，之后調(diào)查3、5和7 d各處理的花腐率，計(jì)算保護(hù)作用的效果。結(jié)果顯示(表2)，未噴施拮抗菌液的對(duì)照在病原菌接種后第2天香梨花序的花藥、柱頭、蜜腺、花萼、子房、花柄等處即陸續(xù)開(kāi)始出現(xiàn)花腐癥狀，而噴施拮抗菌的處理(HN143菌株除外)能在一定程度上延緩花腐癥狀出現(xiàn)的時(shí)間，降低花腐率，不同菌株之間差異。其中TN50的防效最高，7 d平均防效達(dá)52.36%，與農(nóng)用鏈霉素防效接近(60.67%)；其次是HN89(39.66%)，再次是HN98，防效達(dá)到30%以上；其余菌株的防效低于30%，防效不佳。

2.3.2 對(duì)杜梨苗梨火疫病的保護(hù)性和治療性的防治效果選擇對(duì)香梨花腐具有較好預(yù)防效果的拮抗菌株TN50、HN89和平板抑菌效果最優(yōu)的SN37在杜梨苗上進(jìn)行梨火疫病的保護(hù)性和治療性的防治試驗(yàn)。保護(hù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示(圖1，表3)，在杜梨苗上預(yù)先噴施TN50、HN89和SN37菌液能顯著降低嫩枝的枝枯率和病情指數(shù)(P<0.05)，7～15 d的平均保護(hù)性防效分別為67.20%、54.32%和45.91%。其中TN50在第10天的防效最高(71.13%)，至15 d時(shí)仍能穩(wěn)定在67.03%，顯著優(yōu)于HN89和SN37菌株。

治療性試驗(yàn)結(jié)果表明(圖2，表4)，噴施TN50、HN89和SN37菌液對(duì)杜梨苗的枝枯具有明顯的治療效果。防效最好的TN50菌株在7和10 d的防效都維持在65%以上，之后有所下降，7～15 d的平均治療防效為63.88%，略低于農(nóng)用鏈霉素的防效(79.25%)；其次是HN89菌株(52.10%)；SN37菌株防效較低(36.17%)。

2.4 內(nèi)生拮抗細(xì)菌的鑒定

對(duì)梨火疫病具有一定防效的TN50、HN89和SN37菌株進(jìn)行分類鑒定。TN50在NA培養(yǎng)基上菌落圓形，粘性有光澤，邊緣整齊，不透明，淡黃色，菌體桿狀，G-，無(wú)芽孢，無(wú)鞭毛。HN89菌株在NA培養(yǎng)基上菌落乳白色，圓形、邊緣整齊、不透明，粘性光滑，菌體短桿狀，單生，G+，中央位芽孢，芽孢囊不膨大，產(chǎn)莢膜。SN37菌株菌落淡黃色，隆起，不透明，粘性光滑，菌體桿狀，單生，G-，無(wú)芽孢，端生鞭毛。

圖1 拮抗菌株預(yù)處理(噴施)對(duì)杜梨苗梨火疫病的保護(hù)性防效Fig.1 The protective control efficacy of the antagonistic strains to the fire blight of birch pear seedling

表2 內(nèi)生拮抗菌株接種對(duì)梨花腐預(yù)防作用的室內(nèi)生測(cè)結(jié)果

表3 拮抗菌株對(duì)杜梨苗梨火疫病的保護(hù)性防治效果

表4 拮抗菌株對(duì)杜梨苗梨火疫病的治療性防效

圖2 拮抗菌株預(yù)處理(噴施)對(duì)杜梨苗梨火疫病的治療性防效Fig.2 The therapeutic control efficacy of the antagonistic strains to the fire blight of birch pear seedling

以提取的TN50、HN89和SN37菌株的總DNA為模板，采用16S DNA的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序，分別得到大小為1 435 bp、1 459 bp和1 347 bp DNA片段，GenBank登錄號(hào)分別為MN860164、MN86014和MN860183。將測(cè)序結(jié)果系統(tǒng)發(fā)育分支上，序列相似性達(dá)99.7%。由圖5可以看出，SN37菌株與Pseudomonasjaponicastrain CH-26(MH712955.1)聚在一個(gè)小的分支上，序列相似性達(dá)到了99.7%。綜合形態(tài)特征和16S DNA系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，將TN50菌株鑒定為克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)，HN89菌株鑒定為類芽孢桿菌(Paenibacillussp.)，SN37菌株鑒定為假單胞桿菌(Pseudomonassp.)。

圖3 基于16S r DNA序列構(gòu)建的拮抗細(xì)菌TN50菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of antagonistic strain TN50 constructed based on 16S r DNA sequence

序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行基因在線Blast，使用DNAMAN軟件進(jìn)行序列拼接及比對(duì)。使用MEGA5.05軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，從中找出相似度最高的菌株序列采用鄰接法構(gòu)建基于16S rDNA 基因序列為基礎(chǔ)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3～5)。由圖3可以看出，TN50菌株與模式菌株Klebsiellavariicolastrain YD8 (KY887765.1)位于同一個(gè)系統(tǒng)發(fā)育分支上，相似性最高達(dá)到了99.7%。由圖4可以看出，HN89菌株與模式菌株P(guān)aenibacilluspolymyxastrain DSM36T (NR_117733.2)聚在同一個(gè)

圖5 基于 16S r DNA 序列構(gòu)建的拮抗細(xì)菌SN37菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of antagonistic strain SN37 constructed based on 16S r DNA sequence

圖4 基于 16S rDNA 序列構(gòu)建的拮抗細(xì)菌HN89菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of the antagonistic strain HN89 constructed based on 16S rDNA sequence

3 討 論

植物內(nèi)生菌作為植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，是一個(gè)多樣性豐富的微生物類群。目前關(guān)于內(nèi)生細(xì)菌的分離篩選主要來(lái)自農(nóng)作物、蔬菜、藥用植物等，對(duì)果樹(shù)內(nèi)生細(xì)菌的研究較少，香梨內(nèi)生細(xì)菌及其抑菌作用的研究未見(jiàn)報(bào)道。有研究認(rèn)為內(nèi)生細(xì)菌在林木組織中的分布以根部最多，莖部次之，葉部較少[16]。在柑橘中內(nèi)生細(xì)菌的分布為根>主干樹(shù)皮>枝條>葉片>果實(shí)[17]，而在蘋(píng)果樹(shù)葉片中內(nèi)生細(xì)菌數(shù)最多(4.95×102cfu/g)，樹(shù)皮居中(4.4×102cfu/g)，莖中最少(1.83×102cfu/g)，從葉片上分離到的內(nèi)生細(xì)菌占所分離總數(shù)的75%[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，在香梨樹(shù)的枝條、葉片、花器和果實(shí)中不同組織中內(nèi)生細(xì)菌的分布豐度不同，其特點(diǎn)為枝條(3.9×105cfu/g)>葉片(2.3×105cfu/g)>花(1.1×104cfu/g)>果實(shí)，分離出的337株內(nèi)生細(xì)菌中，枝條中分離到的內(nèi)生細(xì)菌最多，占分離菌株總數(shù)的35.6%。不同植物和不同的組織中內(nèi)生菌的分布、數(shù)量和種類不同，反映了植株內(nèi)生環(huán)境的差異，與樹(shù)種、樹(shù)齡、生長(zhǎng)季節(jié)、地域分布和氣候環(huán)境等多因素有關(guān)[19]。

本研究通過(guò)初篩、復(fù)篩從分離的香梨內(nèi)生細(xì)菌菌株中篩選出對(duì)梨火疫病、梨梢枯病菌和梨樹(shù)腐爛病菌的14個(gè)拮抗菌株，均是從枝條中分離獲得的。其中有4個(gè)菌株兼具抗病原真菌和細(xì)菌的活性，ZN5、SN19和HN9菌株對(duì)梨梢枯病菌和梨樹(shù)腐爛病菌均有拮抗作用，HN89菌株對(duì)梨火疫病梨、梨梢枯病菌和梨樹(shù)腐爛病菌3種病原菌均有較強(qiáng)的抑菌作用，抑菌譜廣，具有一定的生防潛力。生防細(xì)菌防治植物病害的機(jī)制主要有拮抗、競(jìng)爭(zhēng)、重寄生和誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性等。拮抗作用是內(nèi)生細(xì)菌的重要生防機(jī)制，通常是采用平板對(duì)峙法測(cè)定待測(cè)菌株對(duì)靶標(biāo)病原菌的拮抗作用，比較抑菌圈大小篩選生防菌株。但該法存在一定的局限性，如供試菌株的生長(zhǎng)速度或是所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)的擴(kuò)散能力等會(huì)影響測(cè)定結(jié)果[20]，尤其是對(duì)僅具備競(jìng)爭(zhēng)作用的菌株難以直觀地檢測(cè)出來(lái)。本研究中發(fā)現(xiàn)，在篩選梨火疫病菌拮抗菌時(shí)，TN50菌株雖不產(chǎn)生抑菌圈，但該菌株生長(zhǎng)速度極快，能在24 h迅速覆蓋病原菌，故將其作為備選的菌株。因此，在生防菌株篩選時(shí)，不能僅以抑菌圈作為依據(jù)，還應(yīng)考慮對(duì)營(yíng)養(yǎng)和空間的競(jìng)爭(zhēng)能力強(qiáng)及其他抗菌機(jī)制的菌株，篩選出不同類型、不同作用機(jī)制、不同環(huán)境要求的生防潛力菌株，發(fā)揮其互補(bǔ)、協(xié)同作用以提高病害防效，在病害生物防治中更具應(yīng)用價(jià)值。

梨火疫病是危害梨、蘋(píng)果、山楂等仁果類果樹(shù)的重大細(xì)菌病害之一。國(guó)外對(duì)防治技術(shù)包括檢疫、修剪和鏟除發(fā)病植株、藥劑防治、生物防治及選育抗病品種性等措施[21]。但該病害防治難度大，無(wú)特效藥劑和單一的防控措施，至今仍未得到很好的控制，安全有效的防控依然是世界性的難題。在20世紀(jì)70年代初期使用農(nóng)用鏈霉素噴霧，保護(hù)花器免受侵染非常有效，但長(zhǎng)期、大量使用農(nóng)用鏈霉素已導(dǎo)致抗藥性的產(chǎn)生。目前農(nóng)用鏈霉素已經(jīng)停止生產(chǎn)并退出了農(nóng)藥市場(chǎng)，迄今尚無(wú)防效相當(dāng)?shù)奶娲巹?。近年?lái)隨著對(duì)梨火疫病原菌的微生態(tài)學(xué)和侵染生物學(xué)的深入研究，推動(dòng)了一些新的防治策略取得進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，花器是梨火疫病菌最初、也是最重要的初侵染源。生防菌在花器的柱頭、花梗表面定殖占領(lǐng)病原菌的侵染位點(diǎn)并抑制其生長(zhǎng)繁殖是病害生物防治的關(guān)鍵[22]。如利用熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)和草生歐文氏菌(Erwiniaherbicola)等多次噴布開(kāi)花期的梨樹(shù)，在柱頭定殖生長(zhǎng)能有效減少病菌對(duì)花的侵染和花間傳播[23]。美國(guó)研發(fā)的熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)A506商品菌劑得到了實(shí)際應(yīng)用，使梨火疫病的花器發(fā)病率平均下降40～60%，達(dá)到了農(nóng)用鏈霉素的防效，或與其他化學(xué)藥劑的防效相當(dāng)[24]。另一種生防菌劑ErwiniaherbicolaC9-1也通過(guò)美國(guó)環(huán)保局的生產(chǎn)許可并在生產(chǎn)中使用。Zeller and B. Wolf等[25]從花和葉分離出39株內(nèi)生細(xì)菌，最有效的E.herbicola89菌株對(duì)花腐控制率接近70%，明顯優(yōu)于鏈霉素。本研究首先通過(guò)噴施拮抗菌菌液接種香梨離體花序，測(cè)定對(duì)花腐的保護(hù)性防效。試驗(yàn)結(jié)果表明，TN50菌株的防效最高(52.36%)，與農(nóng)用鏈霉素相近。進(jìn)一步通過(guò)杜梨苗接種，明確菌株TN50、HN89、SN37對(duì)梨火疫病的保護(hù)性和治療性防效。TN50菌株盡管在室內(nèi)平板抑菌作用測(cè)定中并不產(chǎn)生抑菌圈，但具有生長(zhǎng)速度快的特點(diǎn)，搶占病原菌的作用位點(diǎn)，競(jìng)爭(zhēng)有限的生長(zhǎng)資源可能是其對(duì)香梨花腐和杜梨苗枝枯具有防效較好的重要機(jī)制。而HN89、SN37菌株雖然具有較好的抑菌效果，但競(jìng)爭(zhēng)力不強(qiáng)影響其防效。

通過(guò)梨幼果接種來(lái)評(píng)價(jià)梨火疫病生防菌株防效是一種常用方法[26]，但有時(shí)果實(shí)接種試驗(yàn)與實(shí)際防效并不相關(guān)，大多數(shù)研究者更傾向于采用對(duì)病原菌最敏感的花器接種作為生防菌防效鑒定的方法[27]。本研究在實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)格隔離的條件下采用香梨花器結(jié)合對(duì)梨火疫病高度感病的杜梨苗接種二種方法測(cè)定菌株的防病效果，力求更客觀、準(zhǔn)確地篩選出生防潛力菌株。本研究中篩選出的生防潛力菌株還要在后續(xù)工作中進(jìn)一步研究其抗逆性能和在環(huán)境中的定殖性能，明確其抑菌機(jī)制，為制定病害的安全防控措施，嚴(yán)防病害入侵提供科學(xué)基礎(chǔ)和技術(shù)儲(chǔ)備。