孫 宇，劉志鑫，葉 子，羅睿雄，蒲金基，張 賀*

(1 海南大學 植物保護學院，?？?570228；2 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物有害生物綜合治理重點實驗室，海口 571101；3 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所，?？?71101)

Whirly蛋白是一類植物特異的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于植物細胞內(nèi)，主要定位于葉綠體和線粒體中，具有既能與單鏈DNA結合，也能與RNA結合的功能[1]。Desveaux等[2]于2000年從馬鈴薯中分離出第一個Whirly家族成員PBF-2，后來又稱為StWHY1[3]，它可以和cDNA編碼的蛋白質(zhì)都以序列特異性的方式與病原響應基因PR-10a啟動子上的順式應答元件ERE(elicitor response element)以單鏈形式結合，進而誘導該基因的表達并調(diào)節(jié)由病原菌引起的信號轉(zhuǎn)導途徑[2]。Whirly蛋白家族一般包含3個結構域:N端結構域，是葉綠體或線粒體信號肽和轉(zhuǎn)錄激活結構域；非常保守的Whirly結構域，是與單鏈DNA結合的區(qū)域，其中還包含一段細胞核定位信號；C端多變區(qū)，是具有自我調(diào)節(jié)的結構域，可調(diào)節(jié)單鏈DNA和Whirly蛋白的結合活性[3-4]。隨后，在擬南芥[1]、玉米[5-6]和番茄[7]等植物中[8-11]陸續(xù)鑒定到Whirly基因家族成員的存在，廣泛的分布表明它們可能在植物的生長發(fā)育與生理過程中起著非常重要的作用。

Whirly蛋白功能發(fā)揮通過依賴于單鏈DNA的堿基及堿基與疏水氨基酸殘基的堆疊和疏水鍵作用進行結合，還依賴其四倍體結構[4,11]。目前已知Whirly蛋白能與4種核酸序列相結合：端粒末端序列[12]、ERE元件[2,13-14]、AtKP1基因啟動子上的KPRE元件[15]、WRKY53基因啟動子上的ERE-like基序與AT富集區(qū)序列[16]。除了ERE-like和AT富集區(qū)的序列以外，其余3種核酸序列之間無明顯的相似性。近年來的研究表明，擬南芥和馬鈴薯中的Whirly蛋白家族具有調(diào)節(jié)防御基因表達的功能[3]，其可能在防御反應之外的過程中發(fā)揮作用，也可能在葉綠體與細胞核中發(fā)揮作用。Whirly蛋白不僅在細胞核內(nèi)參與水楊酸依賴的抗病信號轉(zhuǎn)導[2,12]、調(diào)節(jié)端粒結構穩(wěn)定[14]和調(diào)節(jié)葉片衰老[16-18]，而且在質(zhì)體和線粒體內(nèi)能夠維持其基因組穩(wěn)定[19]、DNA損傷修復[20]、調(diào)節(jié)質(zhì)體基因的表達[5,19-22]和控制角果的發(fā)育[18]，另外在胚胎發(fā)育和種子萌發(fā)[6,23]等方面也發(fā)揮著重要的功能。Whirly基因不僅在非生物脅迫中發(fā)揮作用，在生物脅迫中也起著積極調(diào)節(jié)作用，比如番茄SlWHY2在轉(zhuǎn)基因煙草中過表達可對青枯病菌侵染表現(xiàn)出較強的抗性[7]，辣椒中CaWHY2的表達受疫病的誘導，在2 h時其表達量達到最高值，為對照的2.3倍[10]。

杧果(Mangiferaindica)，是世界著名的熱帶水果之一，在熱帶和亞熱帶地區(qū)的100多個國家和地區(qū)中分布，包括中國的華南熱區(qū)[24]，是熱區(qū)重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟作物，也是農(nóng)民脫貧致富的“金杧果”和“致富樹”。隨著2020年杧果全基因組測序的完成[25]，杧果基因功能的研究進程明顯加快，然而目前國內(nèi)外對杧果Whirly基因家族的研究還未見報道。為此，本研究對杧果Whirly基因家族成員的序列特征及其表達特性進行分析，以期為進一步研究Whirly家族成員在杧果生長發(fā)育中的功能和作用機制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 杧果病害脅迫處理

杧果嫁接苗由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海南儋州杧果種質(zhì)資源圃提供(品種為‘貴妃杧’)。將株高約60 cm均勻一致的杧果嫁接苗移栽到花盆內(nèi)，以室溫25 ℃、相對濕度70%～90%、光/暗周期為12 h/12 h條件下進行病害脅迫處理。設置Cg與Xcm 2個處理，每個處理3株苗，0 h處理作為對照組。以分生孢子濃度為2×106個/mL的膠孢炭疽菌分生孢子懸浮液、濃度為2×107cfu 的細菌性黑斑病菌懸浮液分別對杧果嫁接苗葉片均勻噴霧，取樣時間分別為處理后0、3、6、12、24、48、72 h，將杧果葉片剪碎，液氮速凍，保存在-80 ℃下待用。

1.2 方 法

1.2.1 杧果全基因組數(shù)據(jù)的來源杧果全基因組數(shù)據(jù)由NCBI(PRJNA487154)公布得知，玉米(Zeamays)、煙草(Nicotianatabacum)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、蘋果(Malusdomestica)、番茄(Solanumlycopersicum)、菠蘿(Ananascomosus)、水稻(Oryzasativa)、木薯(Manihotesculenta)、毛果楊(Populustrichocarpa)9個物種的基因組和Whirly基因家族信息分別來源于NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和PlantTFDB(http://planttfdb.gao-lab.org/)數(shù)據(jù)庫。

1.2.2 杧果Whirly基因家族成員的鑒定從擬南芥數(shù)據(jù)庫獲取AtWHY1、AtWHY2和AtWHY3氨基酸序列，并將其作為查詢對象在杧果基因組數(shù)據(jù)庫中執(zhí)行Blastp比較，將E值設置為10-5。使用Pfam工具 (http://pfam.xfam.org/)檢測得到的杧果蛋白序列結構域，進一步去除沒有典型Whirly結構域的蛋白序列，最終得到所有杧果Whirly基因家族成員[26]。其他9個代表物種中的Whirly基因家族成員采用類似的方法進行篩選。

1.2.3 杧果Whirly基因家族的生物信息學分析通過使用ProtParam在線分析工具(http//web.Expasy.org/protpasam/)預測氨基酸數(shù)、蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量、等電點、穩(wěn)定性指數(shù)、脂肪系數(shù)、總平均親水性等理化性質(zhì)[27]。利用在線軟件MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)對杧果基因家族的蛋白質(zhì)保守基序進行分析[28]，再通過DNAMAN 6.0軟件進行高同源蛋白的氨基酸序列比對。通過在線工具SOPMA(https://www.expasy.org/)預測蛋白質(zhì)的二級結構，利用NCBI Conserved Domain Search預測基因的保守結構域，SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)對蛋白質(zhì)保守域的四聚體結構進行預測。

1.2.4 系統(tǒng)進化樹分析利用ClustalW程序?qū)x果和9個物種中的Whirly基因家族成員的氨基酸序列進行多序列比對。獲得Whirly蛋白序列后使用MEGA 7.0軟件，通過鄰近法構建進化樹，其中校驗參數(shù)Bootstrap值設置為1 000次重復[29]。

1.2.5 RNA提取及cDNA合成對杧果葉片總RNA進行提取，采用了RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)中的方法提取，使用超微量紫外分光光度計(Nano-drop2000C型)測定總RNA的濃度，-80 ℃保存?zhèn)溆?。利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄成第1鏈cDNA[30]。

1.2.6 杧果Whirly基因家族表達分析為研究兩種病原菌脅迫下杧果Whirly家族基因的差異表達情況，利用Quant Studio 6 Flex的實時熒光定量PCR檢測系統(tǒng)，采用UltraSYBR Mixture 試劑盒(北京康為世紀)作為熒光試劑進行實時熒光定量PCR操作。建立20 μL的反應體系，每個處理樣本設置3個重復。qRT-PCR反應程序為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸1 min，45個循環(huán)；在60 ℃時收集熒光信號。根據(jù)MiWHY1、MiWHY2和MiWHY3基因序列設計實時熒光定量PCR引物MiWHY1-F / MiWHY1-R、MiWHY2-F / MiWHY2-R和MiWHY3-F / MiWHY3-R，以杧果Mi18S作為內(nèi)參基因，設計引物Mi18S-F / Mi18S-R(表1)。通過實時熒光定量PCR儀軟件(Quant StudioTM 6 Flex)獲得各個樣品的Ct值，以0 hpi的表達量為對照，運用2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，確定MiWHY1、MiWHY2和MiWHY3的相對表達量[31]。最后，將qRT-PCR產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠進行電泳，分析兩種病原菌脅迫下不同時間點的基因表達差異。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結果與分析

2.1 全基因組水平鑒定杧果Whirly基因家族成員

在杧果基因組數(shù)據(jù)庫中進行Blastp檢索，去除無典型Whirly結構域的冗余序列和同一基因的非主要轉(zhuǎn)錄形式以后，發(fā)現(xiàn)杧果Whirly基因家族有3個成員，分別命名為MiWHY1、MiWHY2和MiWHY3。通過生物學在線分析工具ProtParam (http:web.sxpasy.org/protparam/)對杧果Whirly基因家族3個成員MiWHY1、MiWHY2和MiWHY3氨基酸序列的理化性質(zhì)進行了分析，結果表明(表2)，MiWHY1氨基酸數(shù)為180個，蛋白分子量為20 294.28 Da，蛋白等電點為9.32，外顯子數(shù)為6，親水性平均數(shù)為-0.19，脂溶指數(shù)為92.06，不穩(wěn)定指數(shù)為45.32；MiWHY2氨基酸數(shù)為217個，蛋白分子量為24 512.89 Da，蛋白等電點為9.18，親水性平均數(shù)為-0.447，脂溶指數(shù)為68.66，不穩(wěn)定指數(shù)為55.66；MiWHY3氨基酸數(shù)為236個，蛋白分子量為26 260.89 Da，蛋白等電點為9.54，外顯子數(shù)為8，親水性平均數(shù)為-0.285，脂肪系數(shù)為75.64，不穩(wěn)定指數(shù)為42.44。因此，預測這3個蛋白均為不穩(wěn)定親水堿性蛋白。

2.2 杧果Whirly蛋白系統(tǒng)進化樹分析

為了更好地了解杧果Whirly基因家族的系統(tǒng)發(fā)育關系，將杧果(3個)、玉米(6個)、煙草(19個)、擬南芥(4個)、蘋果(3個)、番茄(2個)、菠蘿(1個)、水稻(2個)、木薯(3個)、毛果楊(6個)Whirly基因的蛋白序列通過BLAST工具進行蛋白質(zhì)序列分析，利用ClustalW程序和MEGA 7.0軟件構建3個杧果Whirly基因與其他物種(共9種)植物Whirly基因的蛋白序列系統(tǒng)進化樹(圖1)，基于蛋白序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，Whirly家族蛋白具有多樣性，MiWHY1與木薯(Manes.01G189300.1)親緣關系最近，MiWHY2與毛果楊(Potri.010G092500.1)親緣關系最近，MiWHY3與番茄(Solyc11g044750.1.1)親緣關系最近，對于親緣關系較近的蛋白質(zhì)，推測它們具有相似或相近的生物學功能。

2.3 杧果Whirly蛋白保守基序分析

基于在線軟件MEME對杧果MiWHY1(GWHPABLA011035)、MiWHY2(GWHPABLA032351)、MiWHY3(GWHPABLA034174)；番茄PtWHY1(Solyc05g007100.2.1)、PtWHY2(Solyc11g044750.1.1)；毛果楊PtWHY1(Potri.003G048700.1)、PtWHY2(Potri.003G048700.2)、PtWHY3(Potri.008G149100.1)、PtWHY4(Potri.008G149100.2)、PtWHY5(Potri.008G149100.3)、PtWHY6(Potri.010G092500.1)；木薯MeWHY1(Manes.01G189300.1)、MeWHY2(Manes.02G200100.1)、MeWHY3(Manes.18G108600.1)基因家族的蛋白質(zhì)保守基序進行分析，發(fā)現(xiàn)MiWHY1、MiWHY2和MiWHY3與番茄、毛果楊、木薯的Whirly基因家族中鑒定出3個保守基序，其中共有1個高度保守的基序Motif1，Motif1再通過DNAMAN進行多序列比對(圖2)。保守基序Motif1含有49個氨基酸，包含20個百分之百保守的序列，杧果MiWHY1的保守基序位置為34～82；MiWHY2的保守基序位置為125～173；MiWHY3的保守基序位置為91～139。通過基序分析發(fā)現(xiàn)，Whirly基因家族在進化上結構具有保守性。

圖1 10個Whirly蛋白的系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree constructed from 10 Whirly proteins

表2 杧果Whirly基因家族成員的基本信息

2.4 杧果Whirly蛋白二級結構預測

通過生物學在線分析工具SOPMA對MiWHY1、MiWHY2和MiWHY3蛋白的二級結構預測分析結果表明(圖3)，無規(guī)則卷曲(45.00%)和α-螺旋(30.00%)是MiWHY1蛋白二級結構主要元件，其次是延伸鏈(19.44%)和β-轉(zhuǎn)角(5.56%)；無規(guī)則卷曲(47.47%)和延伸鏈(26.27%)是MiWHY2蛋白二級結構主要元件，其次是α-螺旋(20.28%)和β-轉(zhuǎn)角(5.99%)；無規(guī)則卷曲(42.37%)和α-螺旋(29.66%)是MiWHY3蛋白二級結構主要元件，其次是延伸鏈(22.03%)和β-轉(zhuǎn)角(5.93%)。

MiWHY1～MiWHY3. 杧果；SlWHY1、SlWHY2. 番茄；PtWHY1～PtWHY6. 毛果楊；MeWHY1～MeWHY3. 木薯圖2 杧果與其他物種Whirly家族保守基序的多重序列比對MiWHY1-MiWHY3. Mangifera indica；SlWHY1，SlWHY2. Solanum lycopersicum；PtWHY1-PtWHY6. Populus trichocarpa；MeWHY1-MeWHY3. Manihot esculentaFig.2 Multiple sequence alignment of conserved motifs of Whirly family in mango and others

A. MiWHY1；B. MiWHY2；C. MiWHY3；橫坐標表示氨基酸位點圖3 杧果Whirly家族的二級結構預測The abscissa indicates the position of the amino acid sequenceFig.3 Secondary structure prediction of Whirly family in mango

2.5 杧果Whirly蛋白保守結構域分析

通過NCBI Conserved Domain Search對杧果Whirly家族和馬鈴薯StWHY1蛋白質(zhì)序列進行保守結構域分析，發(fā)現(xiàn)杧果Whirly家族成員與馬鈴薯StWHY1含有的保守結構域相同，均含有Whirly超家族保守域(圖4)。其中MiWHY1蛋白的Whirly超家族保守域位置為24～139(圖4，A)；MiWHY2蛋白的Whirly超家族保守域位置為95～212(圖4，B)；MiWHY3蛋白的Whirly超家族保守域位置為61～196(圖4，C)； StWHY1蛋白的Whirly超家族保守域位置為98～233(圖4，D)。

基于同源建模原理，通過SWISS-MODEL軟件對杧果MiWHY1、MiWHY2和MiWHY3蛋白保守結構域的四聚體結構進行預測(圖5，A～C)，預測結果顯示，它們?nèi)叩慕Y構基本一致。其中，MiWHY1、MiWHY2和MiWHY3四聚體結構與馬鈴薯(圖5，D)Whirly蛋白的四聚體結構類似，根據(jù)結構決定功能的原理，推測MiWHY1、MiWHY2和MiWHY3四聚體在功能上也與馬鈴薯Whirly蛋白的四聚體具有相似性。

2.6 杧果Whirly基因家族脅迫響應表達分析

以杧果Mi18S作為內(nèi)參基因，0 h處理作為對照組。利用qRT-PCR檢測并分析了兩種病原菌侵染過程中杧果Whirly家族基因的表達程度。其中，杧果膠孢炭疽菌(Cg)侵染過程中(圖6，A1)，MiWHY1、MiWHY2和MiWHY3的相對表達量均顯著上調(diào)，并在24 h時達到最大值，其中MiWHY1的相對表達量達到對照的74.9倍，MiWHY2的相對表達量達到對照的15.5倍，MiWHY3的相對表達量達到對照的6.8倍，整個侵染過程中MiWHY1的相對表達量均高于MiWHY2和MiWHY3；杧果細菌性黑斑病菌(Xcm)侵染過程中(圖6，B1)，MiWHY1、MiWHY2和MiWHY3的相對表達量在處理12 h前明顯下調(diào)，MiWHY1、MiWHY3相對表達量在12 h后顯著上調(diào)，隨后下調(diào)。將qRT-PCR產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠進行電泳(圖6，A2、B2)，結果表明，在不同病原菌侵染過程中，MiWHY1、MiWHY2和MiWHY3的相對表達量與對照差異性顯著。

A. MiWHY1； B. MiWHY2； C. MiWHY3；D. StWHY1；Query seq.查詢序列；Specific hits.特異位點；Superfamilies.超家族圖4 杧果Whirly蛋白保守結構域分析Fig.4 Conserved domain analysis of Whirly proteins in mango

A. MiWHY1；B.MiWHY2；C. MiWHY3；D. 馬鈴薯 Potato圖5 杧果Whirly蛋白保守域四聚體結構預測與馬鈴薯[4,11]Whirly蛋白四聚體結構比較Fig.5 Comparison of the conserved domain tetramer structure of mango Whirly proteins with the structure of potato Whirly protein tetramer

A. 膠孢炭疽菌(Cg)；B. 細菌性黑斑病菌(Xcm)；*表示處理與對照在0.05水平上差異顯著圖6 杧果Whirly基因家族在不同病原菌脅迫下的表達與PCR產(chǎn)物電泳圖A. Cg；B. Xcm；* Indicates significant difference between treatments and control (CK) at 0.05 levelFig.6 Expression analysis of Whirly gene family in mango under different pathogen stress treatments and PCR product electrophoresis

3 討 論

基因組測序技術的提高和分子生物學研究的深入，為植物基因家族的鑒定、功能基因的挖掘提供了基礎，已經(jīng)成功對大量植物全基因組進行測序。Whirly家族是一類植物特異的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于植物細胞內(nèi)。葉綠體、線粒體與細胞核是植物3個具有遺傳信息DNA的細胞器，保護DNA與維持遺傳信息的有序表達是植物生存與發(fā)育的關鍵，Whirly蛋白既定位于質(zhì)體又定位于細胞核，在質(zhì)體與細胞核中發(fā)揮著重要作用[4]。Whirly蛋白的結構與生理功能十分復雜，盡管Whirly基因在雙子葉草本十字花科的模式植物擬南芥中的分子機制已經(jīng)得到了闡明[4,11]，但對豐富多彩的植物而言，仍很局限，僅僅是家族成員的數(shù)量上就差異很大，如CAM植物菠蘿有1個成員、茄科煙草有19個成員，家族成員的多樣性也暗示著其功能多種多樣。本研究的杧果是一種典型的漆樹科果樹，參照首次報道的馬鈴薯PBF-2(StWHY1)Whirly蛋白的四聚體結構特點[2-3]和最為保守的Whirly結構域序列，通過全基因組鑒定確定杧果有3個Whirly基因家族成員，均含有1個公認的最為保守的Whirly結構域[3-4]，四聚體結構與馬鈴薯Whirly蛋白四聚體結構具有高度相似性，推測它們在功能上具有一致性。Desveaux等[2]研究發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯PBF-2四聚體由4個p24蛋白通過中心的螺旋-環(huán)-螺旋連接在一起，C4對稱分布形成，形態(tài)呈螺旋狀。此外，Whirly蛋白四聚體的β-片層結構輻射向外，β-片層的邊緣及之間起到與單鏈DNA結合的作用，而β-片層上部則沒有單鏈DNA的結合，每個蛋白單體只可以結合9個核苷酸；3個α-螺旋向四聚體中心匯聚，從而形成一個直徑為0.8 nm且具有疏水功能的中心空穴在蛋白質(zhì)表面，有害物質(zhì)有可能被Whirly蛋白利用中心空穴進行儲存，最終保護DNA免受脅迫的傷害[4]。

中國杧果病害危害嚴重，常見的病害有炭疽病、細菌性黑斑病、白粉病、蒂腐病、瘡痂病等[27]，其中，杧果膠孢炭疽病與細菌性黑斑病危害杧果最為嚴重[28-29]。為了研究杧果Whirly基因是否受膠孢炭疽菌與細菌性黑斑病菌侵染的誘導表達，本研究分別噴霧接種兩種病原菌于杧果葉片上，并通過qRT-PCR技術揭示膠孢炭疽菌與細菌性黑斑病菌侵染過程中杧果Whirly家族基因的相對表達量。發(fā)現(xiàn)在不同病原菌侵染過程中，MiWHY1、MiWHY2和MiWHY3的相對表達量與對照差異性顯著，如MiWHY1、MiWHY2和MiWHY3在膠孢炭疽菌侵染后的3～72 h內(nèi)均顯著性上調(diào)表達，表明杧果Whirly基因響應了病菌的侵染。Whirly基因的研究大多集中在模式植物擬南芥Whirly蛋白的結構和功能上[1]以及干旱[7]、低溫[10]、鹽[11]等非生物脅迫對基因表達水平的影響方面，也有前人在研究中提到Whirly基因參與轉(zhuǎn)基因煙草青枯病菌[7]、辣椒疫霉菌[10]等生物脅迫的調(diào)控。本研究所用的兩種病原菌分別屬于刺盤孢屬真菌、黃單胞菌屬細菌，這兩個屬是生產(chǎn)中較為重要的病原菌，且Whirly基因響應疫霉菌的侵染[10]，這暗示著Whirly基因?qū)Χ喾N病原菌的侵染均有響應，可作為研究植物抗病機制的候選基因。