鄧 勇，劉 聰，田 野，劉聰美，劉選明，林建中

(湖南大學(xué) 生物學(xué)院 植物功能基因組學(xué)和發(fā)育調(diào)控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410082)

土壤鹽堿化是一個(gè)日益嚴(yán)重的全球性問題，目前全世界約20%的耕地已受到鹽堿化的影響[1]。土壤鹽堿化阻礙了植物的生長(zhǎng)和發(fā)育，降低了作物產(chǎn)量，成為世界農(nóng)業(yè)的一個(gè)主要環(huán)境限制因素[2-4]。高濃度的鹽脅迫引起植物的離子失衡和高滲透脅迫，同時(shí)使植物產(chǎn)生并積累過量活性氧(reactive oxygen species, ROS)，導(dǎo)致氧化損傷[5]。正常條件下，植物體內(nèi)的ROS分子在各種抗氧化防御機(jī)制下維持在相對(duì)平衡狀態(tài)，并作為信號(hào)分子參與多種細(xì)胞生理過程[6]。植物受到生物脅迫和非生物脅迫因素的干擾時(shí)，ROS的產(chǎn)生和清除之間的平衡會(huì)遭到破壞，細(xì)胞內(nèi)ROS水平會(huì)突然增加，從而對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成重大損害[7]。如在鹽脅迫下，ROS的增加可引起脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)氧化、核酸損傷、酶抑制、程序性細(xì)胞死亡(PCD)等，從而對(duì)植物細(xì)胞構(gòu)成威脅并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[8-9]。

ROS主要包括過氧化氫(H2O2)、超氧自由基

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

參試粳稻品種 Kitaake (OryzasativaL. cv. Kitaake)由植物基因組學(xué)與發(fā)育調(diào)控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，用于水稻愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化、克隆、RNA提取等實(shí)驗(yàn)。

1.2 引物合成

按照引物設(shè)計(jì)原則，利用軟件Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性引物。本研究所用引物序列信息見表1。

1.3 OsCatC基因過表達(dá)載體構(gòu)建

用同源重組法進(jìn)行載體構(gòu)建。根據(jù)OsCatC的CDS序列和pCUbi1390-Flag載體序列設(shè)計(jì)引物OsCatC-Flag-F和OsCatC-Flag-R，以Kitaake的cDNA為模板，用高保真Prime STAR酶(R050A；TaKaRa)擴(kuò)增該基因的CDS序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后回收純化，然后pCUbi1390-Flag載體以PstⅠ進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳回收后進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α (本實(shí)驗(yàn)室保存)，篩選陽性克隆后進(jìn)行PCR檢測(cè)及測(cè)序，鑒定最終表達(dá)載體pCUbi1390-OsCatC-Flag(圖1,A)。在pCUbi1390-OsCatC-Flag載體中，目標(biāo)基因OsCatC由玉米Ubiquitin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)，其3′端連接有2×Flag的編碼序列。植物中的篩選標(biāo)記基因?yàn)槌泵顾乜剐曰騂PT，由35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)。

1.4 水稻轉(zhuǎn)化及分子檢測(cè)

將重組質(zhì)粒pCUbi1390-OsCatC-Flag經(jīng)電擊法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌 EHA105 (本實(shí)驗(yàn)室保存)，利用Toki 等[19]的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的愈傷組織轉(zhuǎn)化方法獲得轉(zhuǎn)化植株。提取轉(zhuǎn)化植株的總蛋白，參照Zhou等[20]免疫印跡法，采用抗Flag的單克隆抗體(No.314059；Abmart)進(jìn)行Western blot分析。采用Trizol試劑(No.9109；TaKaRa)提取轉(zhuǎn)基因植株的總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后參照文獻(xiàn)[21]采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)分析OsCatC的轉(zhuǎn)錄水平，具體引物序列見表1。

1.5 OsCatC過表達(dá)水稻的耐鹽性分析

將生長(zhǎng)20 d的OsCatC過表達(dá)和野生型水稻幼苗移至200 mmol·L-1的NaCl水培營(yíng)養(yǎng)液中[18]，鹽脅迫處理7 d，然后再用正常水培營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)恢復(fù)10 d，拍照其鹽脅迫表型并統(tǒng)計(jì)存活率。

1.6 OsCatC過表達(dá)水稻的鹽脅迫響應(yīng)生理指標(biāo)檢測(cè)

生長(zhǎng)20 d的OsCatC過表達(dá)株系和野生型水稻幼苗用140 mmol·L-1的NaCl分別處理0、1、2、3和4 d，取幼苗地上部分用于后續(xù)檢測(cè)。參照Cao等[22]的電導(dǎo)儀法測(cè)定水稻葉片相對(duì)電導(dǎo)率；采用丙二醛(MDA)含量檢測(cè)試劑盒(BC0025；Solarbio)、H2O2含量檢測(cè)試劑盒 (BC3590；Solarbio)和過氧化氫酶檢測(cè)試劑盒(S0051；Beyotime)分別測(cè)定鹽脅迫處理幼苗中的MDA和H2O2的含量，以及過氧化氫酶的活性。

1.7 OsCatC過表達(dá)水稻的氧化脅迫耐受性分析

參考You等[23]的方法，使用甲基紫精(MV) (Sigma公司)處理水稻發(fā)芽種子。具體方法為：將催芽3 d后的水稻種子轉(zhuǎn)移到不含或含有4 μmol·L-1MV的1/2 MS 培養(yǎng)基中處理7 d，然后拍照其氧化脅迫表型并統(tǒng)計(jì)幼苗長(zhǎng)度。

1.8 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)分析采用 SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，顯著性水平為0.05。采用Sigma Plot計(jì)算機(jī)軟件做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsCatC過表達(dá)水稻植株的獲得及鑒定

以水稻粳稻品種Kitaake的cDNA為模板，以特異性引物擴(kuò)增得到OsCatC，其CDS序列為1 479bp，編碼的CatC由492個(gè)氨基酸殘基組成。然后將克隆所得的OsCatC用于構(gòu)建過表達(dá)載體pCUbi1390-OsCatC-Flag(圖1，A)，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的愈傷組織轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化Kitaake，共獲得了30個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因株系(T0)。隨后，采用抗Flag的抗體對(duì)各株系的T1代幼苗進(jìn)行了Western blot鑒定，并從中鑒定到2個(gè)OsCatC過表達(dá)株系(OE-10、OE-18)，其中融合蛋白CatC-Flag積累非常顯著，而未轉(zhuǎn)化的野生型(WT)則沒有檢測(cè)到相應(yīng)信號(hào)(圖1，B)。隨后，采用qRT-PCR 分析了OsCatC的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)OE-10和OE-18株系的OsCatC轉(zhuǎn)錄水平顯著高于野生型(圖1，C)。這些結(jié)果說明，OsCatC已成功過表達(dá)于轉(zhuǎn)基因株系中，并且能正常翻譯為融合蛋白CatC-Flag。

表1 PCR引物序列

A.pCUbi1390-OsCatC-Flag過表達(dá)載體T-DNA區(qū)段圖譜; B.Western blot檢測(cè)野生型(WT)和OsCatC過表達(dá)株系(OE-10和OE-18)中CatC-FLAG蛋白的表達(dá)水平; C.qRT-PCR 檢測(cè)在野生型和OsCatC過表達(dá)株系(OE-10和OE-18)中OsCatC基因的表達(dá)情況圖1 水稻OsCatC過表達(dá)植株的鑒定A. Schematic diagram of T-DNA of the overexpression vector pCUbi1390-OsCatC-Flag. B. Western blot analysis of CatC-FLAG in wild-type (WT) and OsCatC overexpressing lines (OE-10 and OE-18); C. Expression analysis of OsCatC in wild-type (WT) and OsCatC overexpressing lines (OE-10 and OE-18) by qRT-PCRFig.1 Identification of OsCatC overexpressing plants

A.水稻野生型和OsCatC過表達(dá)株系(OE-10和OE-18)幼苗用200 mmol·L-1 NaCl 處理0和7 d及恢復(fù)10 d的表型；B. 鹽脅迫恢復(fù)10 d后的幼苗(A)存活率。B中數(shù)值代表平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差(n=3，t檢驗(yàn)，* P < 0.05，** P < 0.01)，下同圖2 OsCatC過表達(dá)植株鹽脅迫條件下的表型分析A. Phenotypic comparison of seedlings of wild-type and OsCatC overexpressing lines (OE-10 and OE-18) were treated with 200 mmol·L-1 NaCl for 0 d,7 d and then recovered for 10 d. B. Survival rates of seedlings grown salt stress conditions after 10 d of recovery(A). Data in B is presented as mean ± SD (n=3，Student’s t-test，* P < 0.05, ** P < 0.01), the same as belowFig.2 Phenotypic analysis of OsCatC overexpressing plants under salt stress conditions

2.2 OsCatC過表達(dá)水稻植株在鹽脅迫下的表型比較

圖2，A顯示，在正常水培條件下，OsCatC過表達(dá)株系OE-10和OE-18與野生型的水稻幼苗長(zhǎng)勢(shì)無明顯差異；鹽脅迫(200 mmol·L-1NaCl)處理7 d后，OE-10和OE-18株系幼苗與野生型相比綠葉更多，生長(zhǎng)狀態(tài)更好；經(jīng)過正常水培恢復(fù)10 d 后，部分OE-10和OE-18的幼苗仍能恢復(fù)正常生長(zhǎng)，葉片呈綠色，而野生型幼苗只有極少數(shù)能恢復(fù)生長(zhǎng)，絕大部分幼苗則干枯死亡。同時(shí)，各處理幼苗存活率統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，野生型幼苗在鹽脅迫下的存活率僅為5%左右，而OsCatC過表達(dá)株系(OE-10和OE-18)幼苗的存活率仍能維持在20% ～ 25% (圖2， B)。這些結(jié)果說明，過表達(dá)OsCatC能顯著提高水稻對(duì)鹽脅迫的耐受性。

2.3 OsCatC過表達(dá)水稻植株在鹽脅迫下的生理指標(biāo)比較

丙二醛(MDA)是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物之一，其積累能加劇細(xì)胞膜的損傷，且受損傷程度與相對(duì)電導(dǎo)率正相關(guān)[24]。由于200 mmol/L NaCl的脅迫處理導(dǎo)致水稻幼苗死亡率太高，所以我們用140 mmol·L-1NaCl的水培溶液對(duì)OsCatC過表達(dá)株系和野生型的幼苗進(jìn)行脅迫處理，然后取材測(cè)定其MDA含量、相對(duì)電導(dǎo)率、CAT活性和H2O2含量。結(jié)果表明，在正常條件下，OsCatC過表達(dá)植株OE-10、OE-18和野生型幼苗間的MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率無明顯差異；鹽脅迫處理后，所有水稻幼苗的MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率均升高，但是OE-10和OE-18幼苗的MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率均顯著低于野生型(圖 3，A、B)。同時(shí)，在正常條件下，OsCatC過表達(dá)植株OE-10和OE-18的CAT活性和H2O2含量與野生型沒有明顯差別；在鹽脅迫條件下，OE-10和OE-18幼苗的CAT活性均高于同期的野生型幼苗，尤其OE-10幼苗的CAT活性顯著高于野生型(圖3，C)，而OE-10和OE-18幼苗的H2O2含量均顯著低于同期野生型(圖3，D)。這些結(jié)果說明，過表達(dá)OsCatC顯著提高了鹽脅迫條件下水稻體內(nèi)的CAT活性，并顯著降低體內(nèi)H2O2的積累量，從而能夠降低鹽脅迫導(dǎo)致的膜脂質(zhì)過氧化作用，減輕水稻細(xì)胞膜受到的損傷，提高了水稻對(duì)鹽脅迫的耐受性。

2.4 OsCatC過表達(dá)植株在氧化脅迫下的表型

為了驗(yàn)證過表達(dá)OsCatC能消除或減緩水稻氧化脅迫的猜想，我們使用甲基紫精(MV)模擬氧化脅迫來處理發(fā)芽3 d的水稻幼苗，然后分析OsCatC過表達(dá)植株和野生型幼苗對(duì)氧化脅迫的響應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用水培養(yǎng)7 d后，野生型和OsCatC過表達(dá)植株的幼苗均生長(zhǎng)正常(圖4，A)，且各類苗長(zhǎng)無明顯差異(圖4，B)；而當(dāng)用4 μmol·L-1MV處理7 d后，OE-10、OE-18和野生型幼苗的生長(zhǎng)均受到顯著抑制，但是OE-10和OE-18生長(zhǎng)受抑制程度顯著小于野生型(圖4，A)，且幼苗的長(zhǎng)度均顯著大于野生型(圖4，B)。這些結(jié)果說明，過表達(dá)OsCatC顯著提高了水稻的氧化脅迫耐受性，并進(jìn)一步證實(shí)該耐受性的提高也有助于改良水稻的耐鹽性。

圖3 OsCatC過表達(dá)幼苗在140 mmol/L NaCl鹽脅迫條件下的生理指標(biāo)變化Fig.3 Physiological indices of OsCatC overexpressing seedlings under 140 mmol/L NaCl stress condition

A.催芽3 d的水稻種子用正常的1/2 MS培養(yǎng)液或用含有4 μmol·L-1 MV的1/2 MS培養(yǎng)液處理7 d；B.各類材料用MV處理7 d后幼苗的長(zhǎng)度，其中的數(shù)值代表平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差(n=20，t 檢驗(yàn)，* P < 0.05，** P < 0.01)圖4 OsCatC過表達(dá)水稻幼苗在甲基紫精(MV)處理下的表型A. Three-day-old seedlings were transplanted into 1/2 MS medium with or without 4 μmol·L-1 MV for 7 d; B. Seedling heights of wild-type and OsCatC overexpressing lines (OE-10 and OE-18) treated with mock or 4 μmol·L-1 MV for 7 d. Data in B are presented as mean ± SD (n=20, Student’s t-test, * P < 0.05, ** P < 0.01)Fig.4 Phenotypic analysis of OsCatC overexpressing seedlings treated with methylviologen (MV) at seedling stage

3 討 論

在植物的生長(zhǎng)和發(fā)育過程中，H2O2作為信號(hào)分子參與了許多發(fā)育過程和應(yīng)激反應(yīng)[25-28]。在不利的環(huán)境條件下，如極端溫度、重金屬、干旱、空氣污染、營(yíng)養(yǎng)缺乏或鹽脅迫等，植物會(huì)增加H2O2的產(chǎn)生和積累[29]，而高濃度的H2O2對(duì)植物細(xì)胞具有細(xì)胞毒害作用[30-31]。過氧化氫酶(CAT)是含有四聚血紅素的酶，能將H2O2直接分解為H2O和O2，是脅迫條件下清除ROS的主要抗氧化酶之一[32]。降低H2O2的累積是植物提高逆境脅迫耐受性的重要策略之一，因此CATs的表達(dá)量與植物的耐逆性息息相關(guān)。H2O2預(yù)處理水稻幼苗可以增加CAT活性，保護(hù)水稻幼苗免受鎘(Cd)脅迫傷害[33]。干旱脅迫下，小麥CAT活性的增加，其耐旱性也隨之增強(qiáng)[34]。在藍(lán)藻細(xì)菌中引入大腸桿菌的CAT基因katE，鹽脅迫下會(huì)減少其H2O2的產(chǎn)生并提高耐鹽性[35]。擬南芥CAT1被AtMEK1激活，可以降低H2O2濃度來消除或減緩鹽脅迫導(dǎo)致的氧化損傷[36]。本研究結(jié)果表明，水稻幼苗受到鹽脅迫后促使H2O2積累，而過表達(dá)OsCatC可提高其CAT活性，降低體內(nèi)H2O2的含量，從而提高其鹽和氧化脅迫的耐受性。同時(shí)，本研究結(jié)果也再次證明，提高植物的抗氧化能力有助于增強(qiáng)植物對(duì)逆境的耐受性。

植物中CAT家族成員間的酶活性和功能有所不同。擬南芥CAT家族有CAT1、CAT2和CAT3，其中CAT2是過氧化氫酶活性的主要來源[14]，且在非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。Mhamdi等[37]發(fā)現(xiàn)敲除CAT3僅輕微降低過氧化氫酶活性；CAT2的缺失使過氧化氫酶活性降低80%；而CAT1的缺失對(duì)過氧化氫酶活性沒有影響。Du等[38]也發(fā)現(xiàn)CAT2對(duì)過氧化氫酶活性具有重要的組成性貢獻(xiàn)，且在干旱和寒冷脅迫反應(yīng)中也發(fā)揮重要作用。盡管Chen等[14]發(fā)現(xiàn)擬南芥CAT3主要為轉(zhuǎn)亞硝基化酶活性，而其過氧化氫酶活性很低，但是Zou等[39]發(fā)現(xiàn)CAT3的Ser-261可被激酶CPK8磷酸化，激活其過氧化氫酶活性，提高了植株的耐旱性。在水稻CAT家族成員CatA、CatB和CatC中，CatC與擬南芥CAT2同源，也是水稻中過氧化氫酶活性的主要來源。Lin等[15]發(fā)現(xiàn)水稻CatC的功能缺失突變體noe1的體內(nèi)過度積累H2O2和NO，呈現(xiàn)出明顯的氧化脅迫損傷，并誘導(dǎo)葉片細(xì)胞死亡。Zhou等[18]發(fā)現(xiàn)CatC的Tyr-210被類受體胞質(zhì)激酶STRK1磷酸化和激活，可以消除或減緩鹽脅迫導(dǎo)致的氧化損傷，顯著提高水稻的耐鹽性。劉珊等[40]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)敲除水稻OsCatB時(shí)，其突變體對(duì)高溫和氧化脅迫更敏感，但是對(duì)鹽脅迫響應(yīng)并無明顯差異。至于水稻中CatA參與脅迫響應(yīng)的具體機(jī)制仍不太清楚。這些前人的研究結(jié)果表明，水稻中CAT家族成員間的酶活性和參與的生理功能均有差異，其中CatC主要參與ROS的清除，在鹽脅迫響應(yīng)中起主要作用。在本研究中，過表達(dá)OsCatC能顯著提高水稻耐鹽性的結(jié)果直接證明，CatC是水稻CAT家族中參與鹽脅迫響應(yīng)的主要成員，OsCatC在水稻等作物的耐鹽育種中具有很好的應(yīng)用前景。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)在水稻幼苗中過表達(dá)OsCatC能顯著提高其鹽脅迫條件下的CAT活性，同時(shí)顯著降低H2O2的積累和氧化損傷，從而顯著提高水稻的耐鹽性。OsCatC是一個(gè)可用于水稻耐鹽性遺傳改良的優(yōu)質(zhì)基因。