石永泉，劉煒，王柯

（1.大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116044；2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科，遼寧 大連 116011；3.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院臨床營(yíng)養(yǎng)科，遼寧 大連 116023）

肝切除術(shù)術(shù)后肝衰（post hepatectomy liver failure，PHLF）發(fā)生率約為28%，死亡率約為27%，遠(yuǎn)高于非PHLF患者的死亡率[1]。良好的肝再生是PHLF恢復(fù)的重要因素，穩(wěn)定的能量供應(yīng)對(duì)肝再生至關(guān)重要，線粒體嵴膜（cristae membrane，CM）錨定的呼吸鏈復(fù)合體是能量（ATP）生成的主要裝置。CM形態(tài)可決定ATP合成效率[2]。Mic60和OPA1是主要的CM形態(tài)調(diào)控蛋白[3]，其表達(dá)水平的變化與多種病理生理狀態(tài)相關(guān)[4-6]。目前，關(guān)于肝再生中Mic60和OPA1與ATP供應(yīng)的關(guān)系的研究較少。本研究旨在觀察殘余肝組織Mic60 和OPA1水平與ATP含量的關(guān)系，為改善PHLF預(yù)后提供新思路，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 C57/6J SPF雄性10周齡WT小鼠購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)SPF中心。體視顯微鏡（wf10/20，寧波永新）；七氟烷（上海恒瑞）；Mic60（ab110329，Abcam）；OPA1（ab157457，Abcam）；HRP 標(biāo)記山羊抗兔 IgG（#31460，thermoFisher）；COX IV（WL01794）、PCNA（WL02208）、兔抗小鼠IgG-HRP（WLA024）、羊抗兔IgG-HRP（WLA023）、線粒體蛋白提取試劑盒（WLA034a）、BCA 試劑盒（WLA004）購(gòu)自萬(wàn)類(lèi)生物；DAB 顯色液（DA1010，Solarbio）；增強(qiáng)型ATP檢測(cè)試劑盒（S0027，碧云天）。

1.2 方法

1.2.1 PH模型 PH模型制作在體視顯微鏡下完成。課題組前期發(fā)現(xiàn)70%PH小鼠7 d生存率可達(dá)100%，85%PH組的生存率也很高，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇85%PH作為起始切除比例。將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（Sham）、85%PH 和 90%PH 組，每組 18 只，每組10只用于生存分析。術(shù)前過(guò)夜不禁食水。七氟烷持續(xù)性吸入式麻醉。手術(shù)方法：腹部正中縱行切口，長(zhǎng)約2～2.5 cm，暴露整個(gè)上腹部。顯微剪離斷鐮狀韌帶、肝胃韌帶、左外葉與右側(cè)膈肌韌帶，游離肝左外葉和肝中葉，5-0 慕絲線結(jié)扎中葉、左外葉和右下葉后切除。離斷肝周韌帶游離整個(gè)尾葉。若制作85%PH 模型，則結(jié)扎并切除尾葉；若制作90%PH 模型，則結(jié)扎右上葉并切除。切除后觀察肝切面無(wú)滲血且殘余肝無(wú)變暗后，4-0 帶針線逐層關(guān)腹，消毒切口。Sham 組小鼠開(kāi)腹放置25min 后直接關(guān)腹。術(shù)畢小鼠背部皮下注射0.9%氯化鈉溶液0.5 mL 后置于復(fù)溫盒。每組10 只用于統(tǒng)計(jì)7 d 生存率，其他小鼠術(shù)后24 h取殘余肝組織用于后續(xù)指標(biāo)分析。前期發(fā)現(xiàn)術(shù)后24 h 85%PH小鼠肝組織再生開(kāi)始明顯增強(qiáng)，因此，本研究選擇術(shù)后24 h作為時(shí)間研究點(diǎn)。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 PCNA一抗?jié)舛?∶300。每只小鼠的切片在光鏡400 倍視野下隨機(jī)挑選2 個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（n1）和總細(xì)胞數(shù)（n）的比值均數(shù)，即為PCNA陽(yáng)性百分率。

1.2.3 Western blot 線粒體蛋白的提取嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作：稱取肝組織50～100 mg，加入1 mL 試劑A，轉(zhuǎn)入1 mL 玻璃勻漿器中抽拉20 次，4 ℃，1 000 g 離心10 min。上清移至新EP管中，4 ℃，10 000 g離心20 min。將沉淀重懸于試劑B中，4 ℃，10 000 g 離心 10 min，重復(fù) 3 次，所得沉淀于試劑 C中裂解即得線粒體蛋白。全程冰上操作。BCA 法測(cè)定蛋白濃度。

一抗稀釋比例：Mic60和COX IV為1∶500，OPA1為1∶2 500。二抗稀釋比例均為1∶5 000。ECL法曝光顯影，凝膠圖象處理系統(tǒng)（Gel-Pro-Analyzer軟件）分析條帶光密度值。

1.2.4 ATP 含量測(cè)定 按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作：每組取3 只小鼠肝組織，冰上分別加入150 μL 裂解液，玻璃勻漿器勻漿 20 次，4 ℃，12 000 g 離心 5 min，留上清。利用 ATP 標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，96 孔板加入100 μL ATP 檢測(cè)工作液，放置5 min，每孔加入40 μL 樣品，每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，化學(xué)發(fā)光儀測(cè)定RLU值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以“±s”表示，生存率比較采用one-way ANOVA，其余指標(biāo)比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 7 d生存率 Sham組小鼠術(shù)后7 d全部存活。85%PH組術(shù)后第2、3天死亡3只，生存率為70%。90%PH小鼠術(shù)后24 h內(nèi)全部死亡。死亡小鼠解剖均未發(fā)現(xiàn)明顯出血現(xiàn)象，見(jiàn)圖1。

圖1 PH小鼠術(shù)后7 d生存率

2.2 85 %PH組肝再生水平明顯升高 HE染色顯示兩組肝組織均無(wú)壞死，85%PH 組脂肪化明顯（見(jiàn)圖2A），符合再生肝特點(diǎn)。85%PH組PCNA陽(yáng)性率為0.043，高于Sham組的0.029（見(jiàn)圖2A和2B），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 PH小鼠術(shù)后24 h肝組織HE染色和PCNA表達(dá)情況（400×）

2.3 85%PH肝組織ATP含量明顯升高 85%PH肝組織ATP含量為9.74 nM/mg，高于Sham 組的5.48 nM/mg，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=4，P＜0.05），見(jiàn)圖3。

2.4 85 %PH 肝組織Mic60 表達(dá)水平明顯降低 85%PH 組Mic60 水平為0.58，低于Sham 組的1.03，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=6，P＜0.05），見(jiàn)圖4B；85%PH 組 OPA1 水平為 1.02，低于Sham 組的1.51，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=6，P=0.0502），見(jiàn)圖4C。

圖3 術(shù)后24 h肝組織ATP含量

圖4 術(shù)后24 h肝組織Mic60和OPA1表達(dá)水平

3 討論

本研究結(jié)果顯示，85%PH生存率為70%，顯著高于既往研究[7]，術(shù)后24 h 85%PH 殘余肝再生水平顯著升高。85%PH 肝組織ATP含量與肝再生程度呈正相關(guān)，高能量供應(yīng)的機(jī)制值得探討，若能找到干預(yù)靶點(diǎn)應(yīng)用于90%PH 組，或可提高其生存率。

線粒體為細(xì)胞增殖和功能維持提供主要所需能量，且與PH術(shù)后肝功能恢復(fù)相關(guān)[8]。線粒體CM在不同生理狀態(tài)下呈現(xiàn)不同形態(tài)。細(xì)胞呼吸時(shí)CM 變長(zhǎng)，凋亡時(shí)CM 變寬[9]。CM 形態(tài)在不同病理狀態(tài)下的作用機(jī)制及其調(diào)控屬于較新研究領(lǐng)域，其變化可以改變線粒體超微結(jié)構(gòu)中的酶活性，影響細(xì)胞能量代謝[2]。CM形態(tài)受多種蛋白調(diào)控，Mic60和OPA1是重要成員。降低和過(guò)度表達(dá)Mic60 能夠?qū)е箩者B接點(diǎn)數(shù)量變化[10-11]。缺乏OPA1 的線粒體缺少嵴結(jié)構(gòu)[12]。本研究結(jié)果顯示，85%PH 肝再生能力強(qiáng)、ATP 含量高，而 Mic60 和 OPA1 的表達(dá)明顯下降。

有研究顯示，Mic60 并非其保護(hù)性因素，肥厚性心肌病患者心臟的Mic60 表達(dá)水平升高近4 倍，在心肌中特定過(guò)表達(dá)Mic60 的小鼠心肌肥厚程度更高，ROS 生成量更多而氧化磷酸化活性降低[13]。因此，不排除85%PH 組Mic60 降低是促進(jìn)能量供應(yīng)的因素，這或可作為PHLF 的干預(yù)靶點(diǎn)。之后可在細(xì)胞水平改變其表達(dá)量，觀察細(xì)胞能量代謝的變化，結(jié)合電鏡觀察CM形態(tài)變化，進(jìn)一步探索其中的機(jī)制。