李子全，耿墨釗，趙 森，吳志宏，仉建國(guó)，3，吳 南，3，王以朋，3

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 1骨科 2北京市骨骼畸形遺傳學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 3脊柱畸形大數(shù)據(jù)研究與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730

Klippel-Feil綜合征(Klippel-Feil syndrome，KFS)是一組以頸椎形成及分節(jié)障礙導(dǎo)致2個(gè)或以上椎體和/或椎體附件融合為特征的先天性畸形，其發(fā)病率約為1/40 000～1/42 000[1- 3]。KFS的典型臨床特征可表現(xiàn)為短頸畸形、后發(fā)際線低和頸椎活動(dòng)受限三聯(lián)征[4- 5]，在臨床上既可作為單獨(dú)畸形出現(xiàn)，也可合并其他系統(tǒng)畸形，包括脊髓、泌尿系統(tǒng)、心臟、胃腸道、眼、耳等[6- 8]。

頸椎的先天性融合畸形可導(dǎo)致頸椎活動(dòng)節(jié)段減少，進(jìn)而造成相鄰節(jié)段的過(guò)度活動(dòng)或不穩(wěn)定，加速頸椎退行性改變，甚至可能導(dǎo)致脊髓損傷的發(fā)生。然而，因?yàn)镵FS的罕見(jiàn)性及臨床表現(xiàn)的異質(zhì)性，既往針對(duì)該疾病的研究多為個(gè)案報(bào)道或文獻(xiàn)回顧。本研究總結(jié)了25例KFS患者的臨床資料，并基于多基因panel二代測(cè)序，對(duì)KFS可能的致病基因進(jìn)行檢測(cè)，以期為探索KFS的早期診斷和有效病因?qū)W治療靶點(diǎn)提供參考。

對(duì)象和方法

對(duì)象2015年1月至2018年12月在北京協(xié)和醫(yī)院就診并通過(guò)頸椎正側(cè)位X線片及頸椎CT+三維重建檢查確診的KFS患者25例，其中，男15例，女10例，平均年齡(12.9±7.3)歲(5～45歲)。本研究經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，患者本人和/或患者家長(zhǎng)簽署知情同意書。

資料收集整理入組患者病歷資料，包括病史、流行病學(xué)、家族史、臨床癥狀、體格檢查結(jié)果等。入組患者均無(wú)家族遺傳史，否認(rèn)母親孕期有明確藥物史、毒物接觸史及高溫暴露史，并除外產(chǎn)時(shí)明確產(chǎn)鉗使用史、脊柱外傷史者；影像學(xué)評(píng)估包括頸椎正側(cè)位及前屈后伸位X線片、全脊柱正側(cè)位X線片、CT+三維重建及MRI檢查。根據(jù)頸椎正側(cè)位X線片和CT+三維重建結(jié)果，記錄每位患者頸椎融合節(jié)段及椎體畸形，并根據(jù)Samartzis分型將患者分為KFS Ⅰ型(頸椎單一節(jié)段融合)、Ⅱ型(頸椎非連續(xù)、多節(jié)段融合)及Ⅲ型(頸椎連續(xù)、多節(jié)段融合)[9]。所有患者均通過(guò)肺功能檢查、超聲心動(dòng)圖、腹部及泌尿系統(tǒng)超聲評(píng)估是否伴發(fā)其他系統(tǒng)畸形，并通過(guò)MRI檢查結(jié)果篩查是否合并脊髓畸形。

樣本采集及保存抽取每例患者外周血標(biāo)本(乙二胺四乙酸抗凝)2～4 ml，采用QIAamp DNA Blood Mini Kit(QIAGEN，德國(guó))從外周血中提取全基因組DNA。通過(guò)NanoDrop ND8000(Thermo，美國(guó))對(duì)提取的DNA濃度和純度進(jìn)行測(cè)量。濃度≥50 ng/μl、A260/A280介于1.7～1.9、OD260/230介于1～3的DNA樣本視為合格，并于-20 ℃或-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

Panel設(shè)計(jì)為了建立多基因二代測(cè)序panel，最大程度覆蓋與KFS表型相關(guān)的候選基因，通過(guò)Human Phenotype Ontology(HPO；https：//hpo.jax.org/)、NCBI Gene(https：//ncbi.nlm.nih.gov/gene/)和Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM；http：//omim.org/)等數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，結(jié)合近年來(lái)國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究，從KFS的相關(guān)疾病或表型中篩選出與之關(guān)聯(lián)的基因564種，其中包含已報(bào)道的5種KFS致病基因：GDF6(MIM：601147)、MEOX1(MIM：600147)、GDF3(MIM：606522)、MYO18B(MIM：607295)和RIPPLY2(MIM：609891)[10- 17]。隨后，使用在線工具NimbleGen(Roche，瑞士)(https：//design.nimblegen.com/nimbledesign/app)設(shè)計(jì)并購(gòu)買了用于靶標(biāo)捕獲的DNA探針，最終的DNA探針可覆蓋目標(biāo)外顯子+/-30 bp區(qū)域的99.7%。

高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建及上機(jī)測(cè)序?qū)? μg基因組DNA打斷，每個(gè)基因組DNA片段大小約為200～250 bp，通過(guò)PCR擴(kuò)增基因組DNA的目標(biāo)區(qū)域、添加接頭到擴(kuò)增片段、進(jìn)行文庫(kù)擴(kuò)增。然后通過(guò)Bioanalyzer分析(Agilent，美國(guó))檢測(cè)文庫(kù)完整性。采用美國(guó)Illumina公司的Hiseq 2500測(cè)序平臺(tái)將文庫(kù)上機(jī)測(cè)序，模式為PE100。

測(cè)序數(shù)據(jù)分析原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)質(zhì)控過(guò)濾等處理，首先去除測(cè)序數(shù)據(jù)中的接頭和低質(zhì)量的堿基以及讀長(zhǎng)數(shù)據(jù)，再應(yīng)用BWA軟件與人類基因組參考序列進(jìn)行比對(duì)(UCSC hg19，http：//genome.ucsc.edu/)，GATK軟件對(duì)單核苷酸變異(single-nucleotide variants，SNV)和內(nèi)部重復(fù)/缺失突變進(jìn)行分析，最后通過(guò)測(cè)序公司內(nèi)部注釋進(jìn)行標(biāo)注和解釋。為了篩查疾病密切相關(guān)的致病基因突變，首先在公共數(shù)據(jù)庫(kù)：千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(1000 Genome Project，URL：http：//www.1000genomes.org/)、ESP6500數(shù)據(jù)庫(kù)(Exome variant server，URL：http：//evs.gs.washington.edu/EVS/)和ExAC數(shù)據(jù)庫(kù)(Exome Aggregation Consortium，URL：http：//exac.broadinstitute.org)中對(duì)高頻突變位點(diǎn)(等位基因頻率≥1%)進(jìn)行濾過(guò)，并利用Mutation Taster、SIFT、Polyphen2軟件評(píng)估突變位點(diǎn)致病性，篩選出3個(gè)軟件均為高致病性的突變基因。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)數(shù)資料以百分率(%)表示，多組間比較采用Fisher確切概率法，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

臨床特征25例KFS患者中，C1- 2頸椎融合3例(12%)，C2- 3頸椎融合10例(40%)，C3- 4頸椎融合8例(32%)，C4- 5頸椎融合6例(24%)，C5- 6頸椎融合5例(20%)，C6- 7頸椎融合15例(60%)，C7-T1融合9例(36%)；3例(12%)患者表現(xiàn)為寰枕融合、顱底凹陷和先天性寰樞關(guān)節(jié)半脫位等上頸椎畸形；9例(36%)患者合并有椎管內(nèi)畸形，包括脊髓空洞、脊髓縱裂和脊髓栓系等；4例(16%)患者合并泌尿系統(tǒng)畸形(先天性腎缺如、多囊腎等)；2例(8%)患者合并心臟畸形(肥厚性心肌病、二尖瓣脫垂)；2例(8%)患者合并耳部畸形；合并胃腸道及眼部畸形各1例。

25例KFS患者中，3例(12%)表現(xiàn)為臨床三聯(lián)征，12例(48%)表現(xiàn)為頸椎活動(dòng)受限，8例(32%)表現(xiàn)為短頸畸形，4例(16%)表現(xiàn)為后發(fā)際線低。11例(44%)患者沒(méi)有任何典型的臨床三聯(lián)征表現(xiàn)，其中3例以斜頸為主要臨床特征就診。根據(jù)KFS的Samartzis分型，11例患者為KFS Ⅰ型，表現(xiàn)為單節(jié)段的頸椎椎體融合；5例為KFS Ⅱ型，表現(xiàn)為多個(gè)非連續(xù)節(jié)段的頸椎椎體融合；9例為KFS Ⅲ型，表現(xiàn)為多個(gè)連續(xù)節(jié)段的頸椎椎體融合。KFS Ⅲ型患者出現(xiàn)短頸(P=0.031)和頸椎活動(dòng)受限(P=0.026)的比例明顯高于KFS Ⅱ型和KFS Ⅰ型，且3例表現(xiàn)為臨床三聯(lián)征的患者均為KFS Ⅲ型(表1)。

KFS的panel測(cè)序分析本研究對(duì)多基因panel二代測(cè)序的結(jié)果進(jìn)行突變數(shù)量和質(zhì)量控制，96.7%的靶區(qū)域具有高質(zhì)量的檢測(cè)靈敏度。每個(gè)樣本在靶區(qū)域上的平均測(cè)序深度約為210X，覆蓋度為99.1%，平均數(shù)據(jù)量大小約為0.7G。

表1 KFS分型與臨床三聯(lián)征的相關(guān)性分析

通過(guò)突變頻率的篩選，并采用生物信息學(xué)軟件對(duì)獲得的突變位點(diǎn)進(jìn)行致病性預(yù)測(cè)，結(jié)果共在8例患者中檢測(cè)到11種基因突變，包括COL6A1、COL6A2、CDAN1、GLI3、FLNB、CHRNG、MYH3、POR、TNXB，突變類型均為錯(cuò)義突變(表2)。未檢測(cè)到已知的5種與KFS密切相關(guān)的致病基因突變位點(diǎn)。

在3例患者的CDAN1基因中發(fā)現(xiàn)2種罕見(jiàn)的雜合錯(cuò)義突變c.2482A>C(p.Thr828Pro)和c.1401A>C(p.Glu467Asp)，其中c.2482A>C突變導(dǎo)致密碼子蘇氨酸(ACC)轉(zhuǎn)變?yōu)槊艽a子脯氨酸(CCC)，c.1401A>C突變導(dǎo)致密碼子谷氨酸(GAA)轉(zhuǎn)變?yōu)槊艽a子天冬氨酸(GAC)，兩者在ExAC數(shù)據(jù)庫(kù)的等位基因頻率分別為0.008 798和0.000 041，均為罕見(jiàn)突變，且功能預(yù)測(cè)軟件SIFT、Polyphen- 2和MutationTaster均提示為致病性突變；3例患者的臨床特點(diǎn)均表現(xiàn)為以下多個(gè)連續(xù)節(jié)段的頸椎融合：C6-T1、C4-T1和C6-T1。2例患者表現(xiàn)為COL6A基因的致病突變，其中1例在COL6A2基因第2外顯子檢測(cè)到c.188C>T(p.Thr63Met)雜合錯(cuò)義突變，該突變導(dǎo)致第63位氨基酸的密碼子蘇氨酸(ACG)被甲硫氨酸(ATG)取代，該例患者為6歲男性，影像學(xué)及輔助檢查提示C6- 7椎體融合、脊髓縱裂、脊髓空洞癥和左腎缺如；1例患者為13歲男性，表現(xiàn)為COL6A1基因的c.2926C>T(p.Arg976Cys)雜合錯(cuò)義突變，檢索NCBI的dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)顯示該突變?cè)谇嘶蚪M計(jì)劃和ExAC數(shù)據(jù)庫(kù)中無(wú)相關(guān)報(bào)道，該患者影像學(xué)及輔助檢查提示C6- 7椎體融合、髓內(nèi)占位和雙耳發(fā)育異常。

討 論

KFS也稱頸椎分節(jié)不良，患者多在出生后即出現(xiàn)畸形，但往往因表現(xiàn)出頸背痛、外觀畸形或神經(jīng)壓迫癥狀時(shí)才得以就診[1]。雖然該疾病具有短頸畸形、后發(fā)際線低和頸部活動(dòng)受限的典型臨床三聯(lián)征表現(xiàn)，但文獻(xiàn)報(bào)道約50%的KFS患者未表現(xiàn)出這些典型臨床特征，因此KFS的診斷主要根據(jù)影像學(xué)[4]。

Samartzis等[5]研究發(fā)現(xiàn)，35.5%的KFS患者未表現(xiàn)出三聯(lián)征的任意一種典型表現(xiàn)，38.7%、16.1%、9.7%的患者表現(xiàn)出1種、2種和全部三聯(lián)征的臨床特征。本研究25例KFS患者中，僅3例(12%)表現(xiàn)出全部三聯(lián)征的臨床特征，且有11例患者(44%)沒(méi)有任何三聯(lián)征的表現(xiàn)，與以往文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。此外，我們通過(guò)KFS的Samartzis分型進(jìn)行分組比較，結(jié)果顯示KFS Ⅲ型更容易表現(xiàn)出短頸、頸椎活動(dòng)受限及臨床三聯(lián)征的特征。因此我們認(rèn)為，長(zhǎng)節(jié)段頸椎融合的KFS患者在臨床中更需要引起關(guān)注，密切隨訪。對(duì)于無(wú)癥狀患者，應(yīng)建議其避免或減少頸椎的過(guò)度屈伸和接觸性體育運(yùn)動(dòng)；在癥狀較輕時(shí)，采用適度康復(fù)訓(xùn)練、支具支撐和牽引可一定程度改善癥狀，延緩手術(shù)并預(yù)防脊髓神經(jīng)損害；進(jìn)行性癥狀性頸椎節(jié)段不穩(wěn)定、合并有顱頸交界區(qū)畸形、出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)損害等均可為手術(shù)指征，對(duì)于手術(shù)方式前后路選擇或經(jīng)口寰樞椎復(fù)位內(nèi)固定術(shù)等，尚缺乏大樣本研究隨訪[18- 20]。

表2 KFS的多基因panel測(cè)序結(jié)果分析

本研究發(fā)現(xiàn)KFS患者在合并脊柱側(cè)凸、胸腰椎脊柱畸形的同時(shí)，常伴發(fā)泌尿系統(tǒng)、心臟、胃腸道等其他系統(tǒng)畸形，本組中共有10例(40%)KFS患者合并骨骼肌肉系統(tǒng)以外的畸形[1，21]。因此，對(duì)所有KFS患者我們建議在初診時(shí)應(yīng)常規(guī)進(jìn)行全脊柱正側(cè)位X線片及全脊柱MRI檢查；此外，完善超聲心動(dòng)圖、腹部超聲、泌尿系統(tǒng)超聲等檢查有助于全面系統(tǒng)地評(píng)估KFS患者伴發(fā)畸形情況，盡早進(jìn)行臨床干預(yù)，改善患者生活質(zhì)量。

流行病學(xué)資料顯示，KFS病例主要以散發(fā)出現(xiàn)，也有家族聚集現(xiàn)象，其發(fā)病與遺傳因素高度相關(guān)。近年來(lái)，已有研究者報(bào)道與先天性頸椎融合畸形發(fā)病相關(guān)的致病基因，以上證據(jù)充分說(shuō)明了遺傳因素，尤其是基因突變?cè)贙FS患病中是不可忽略的。有研究發(fā)現(xiàn)在1個(gè)KFS家系中每個(gè)患者均攜帶GDF6基因的雜合錯(cuò)義突變(pA249E)，在散發(fā)病例中則發(fā)現(xiàn)2例無(wú)親緣關(guān)系患者均攜帶雜合pL289P突變[10，22- 23]。因此，GDF6突變導(dǎo)致的常染色體顯性遺傳KFS被定義為KFS Ⅰ型(OMIM：118100)。Mohamed等[12]對(duì)1個(gè)阿拉伯裔KFS家系進(jìn)行連鎖分析后發(fā)現(xiàn)，該家系中所有患者的MEOX1均存在純合缺失(c94delG)，這個(gè)突變導(dǎo)致讀碼框的改變，進(jìn)而造成蛋白翻譯的提前終止。并在另一個(gè)KFS家系中對(duì)這一基因進(jìn)行了驗(yàn)證[12]。因此，MEOX1突變導(dǎo)致的常染色體隱性遺傳KFS被定義為KFS Ⅱ 型(OMIM：214300)。Ye等[14]對(duì)1個(gè)北美KFS家系的研究發(fā)現(xiàn)，2例患者均攜帶GDF3雜合突變 c796C->T，該突變使氨基酸編碼改變?yōu)閜R226C。因此，GDF3突變導(dǎo)致的常染色體顯性遺傳KFS被定義為KFS Ⅲ型(OMIM：613702)。Alazami等[15]對(duì)2個(gè)有近親結(jié)婚現(xiàn)象的家系進(jìn)行研究，通過(guò)全外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn)2例患者均有22號(hào)染色體MYO18B基因的純合無(wú)義突變c.6905C>A。MYO18B突變導(dǎo)致的常染色體隱性遺傳KFS被定義為KFS Ⅳ型(OMIM：617295)。最新研究中，Karaca等[16]描述了近親家庭中患者具有典型KFS臨床表現(xiàn)及完全性內(nèi)臟轉(zhuǎn)位，并證實(shí)先證者中RIPPLY2基因存在純合移碼突變(c.299delT，p.L100fs)，因此提出RIPPLY2的純合移碼突變是新型常染色體隱性遺傳KFS的原因。

雖然已有上述5個(gè)KFS致病基因的報(bào)道，但僅能解釋極少的KFS病例。Chacon-Camacho等[24]對(duì)墨西哥KFS患者的GDF3、GDF6基因進(jìn)行測(cè)序，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何已知致病突變。本研究中全部患者均未檢出KFS已知的致病基因突變，因此我們推斷KFS在遺傳學(xué)基礎(chǔ)上除了上述已報(bào)道致病基因外，可能存在其他的遺傳學(xué)病因。

通過(guò)二代測(cè)序技術(shù)，本研究采用定制化基因構(gòu)成的panel對(duì)25例KFS患者進(jìn)行測(cè)序，擴(kuò)大了與KFS相關(guān)聯(lián)的候選基因列表。其中，CDAN1基因編碼蛋白codanin- 1，已有充分研究證實(shí)該基因突變與先天性紅細(xì)胞生成異常性貧血Ⅰ型(congenital dyserythropoietic anemia type Ⅰ，CDA Ⅰ)相關(guān)[25]，而Goede等[26]通過(guò)CDA Ⅰ的病例合并骨骼發(fā)育異常，包括并趾畸形、足趾發(fā)育不全等，提出骨骼畸形可能與CDA Ⅰ相關(guān)聯(lián)，并因此推斷codanin- 1可能在骨骼發(fā)育中起重要作用。Ru等[27]報(bào)道首例中國(guó)家系的CDA Ⅰ 合并第4、5跖骨的并趾畸形，測(cè)序結(jié)果顯示該家系患者均存在CDAN1基因的復(fù)合雜合突變，但目前該基因在脊柱發(fā)育過(guò)程中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究在3例患者中均檢測(cè)到該基因雜合錯(cuò)義的致病突變，且3例患者均表現(xiàn)為KFS Ⅲ型并否認(rèn)貧血相關(guān)的病史，因此提示CDAN1的突變可能與連續(xù)多節(jié)段頸椎先天性融合存在顯著關(guān)聯(lián)，在一定程度上擴(kuò)展了對(duì)該基因已知表型的認(rèn)識(shí)。COL6A基因的突變?cè)鴪?bào)道于先天性肌營(yíng)養(yǎng)不良疾病，進(jìn)行加重的脊柱側(cè)凸和呼吸功能惡化是該疾病的典型特征，而COL6A基因負(fù)責(zé)編碼 Ⅵ 型膠原蛋白的多肽鏈，膠原蛋白是骨骼有機(jī)質(zhì)的主要組成部分，已有研究證實(shí)膠原蛋白與脊柱融合之間存在相關(guān)性[28]。目前尚沒(méi)有研究證實(shí)COL6A基因與KFS存在關(guān)聯(lián)，但我們推斷COL6A可能通過(guò)影響膠原蛋白結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致椎體融合畸形的發(fā)生，這一推測(cè)尚待進(jìn)一步的驗(yàn)證與深入研究。同時(shí)，本研究測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1例患者同時(shí)表現(xiàn)出POR c.1858T>G(p.Trp620Gly)、MYH3 c.5263A>G(p.Lys1755Glu)和TNXB c.5103C>A(p.Phe1701Leu)的罕見(jiàn)錯(cuò)義突變，因此推測(cè)POR、MYH3和TNXB的低頻突變?cè)谕换颊吖餐l(fā)生可能是導(dǎo)致頸椎融合畸形產(chǎn)生的機(jī)制，這些突變基因作用的共同通路或基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)將為KFS的寡基因致病模式提供依據(jù)。此外CHRNG c.440G>A(p.Arg147His)、FLNB c.6625G>A(p.Gly2209Ser)和GLI3 c.2844G>A(p.Met948Ile)經(jīng)檢索均為目前尚未報(bào)道過(guò)的突變位點(diǎn)，通過(guò)公共數(shù)據(jù)庫(kù)篩選(突變頻率遠(yuǎn)小于1%)，且基于生物信息學(xué)理論的預(yù)測(cè)結(jié)果，可以推斷突變會(huì)對(duì)基因產(chǎn)物產(chǎn)生重要影響，因此豐富了KFS的致病基因譜。

本研究對(duì)KFS患者臨床特征及panel測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，但因樣本量有限，未能進(jìn)行基因型-表型的關(guān)聯(lián)性分析及進(jìn)一步功能驗(yàn)證，是研究的不足之處。以后將進(jìn)行更大樣本量、基于全外顯子測(cè)序的分析研究。

綜上，本研究結(jié)果顯示，長(zhǎng)節(jié)段先天性頸椎融合患者更易表現(xiàn)出短頸、頸椎活動(dòng)受限及臨床三聯(lián)征的特征，如未及時(shí)干預(yù)治療，可能會(huì)嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。因此在臨床中更應(yīng)引起關(guān)注、密切隨訪。此外，本研究篩選出COL6A、CDAN1等與KFS相關(guān)的候選致病突變，擴(kuò)展了KFS的已知突變譜，為進(jìn)一步闡明疾病的發(fā)病機(jī)制提供參考。