李 欣 黃旭東 楊成梓，▲

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州 350122；2.福建省級(jí)中藥原料藥質(zhì)量鑒定技術(shù)服務(wù)中心，福建福州 350122

天南星為天南星科天南星屬植物，性溫，味苦辛[1]。用于頑痰咳嗽，風(fēng)癱眩暈等[2]。據(jù)報(bào)道，天南星中含多類(lèi)活性物質(zhì)，包括黃酮苷類(lèi)[3-5]、多糖[6-7]、氨基酸[8]及毒針晶[9]等其他成分[10-11]。研究表明，天南星富含黃酮類(lèi)成分，其中夏佛塔苷與異夏佛塔苷兩種黃酮苷的含量相對(duì)較高[12]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，天南星總黃酮提取物具有一定的鎮(zhèn)痛作用[13]，并對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖具有抑制作用[14]。目前有關(guān)天南星黃酮類(lèi)成分的報(bào)道主要為總黃酮提取分離及藥理活性研究[3，15-17]，其物質(zhì)基礎(chǔ)相關(guān)研究較少，且不同產(chǎn)地的天南星藥材可能因地域環(huán)境、條件的不同而導(dǎo)致其質(zhì)量上存在差異性，故本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法測(cè)定天南星中夏佛塔苷和異夏佛塔苷的含量，對(duì)比不同產(chǎn)地天南星藥材中兩種成分的含量差異，為其質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜分析儀（日本島津公司），Syncronis aQ C18色譜柱（4.6 mm ×250 mm，5μm），HH-2型水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠(chǎng)），KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑

無(wú)水乙醇（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20190704），甲醇（色譜純，默克股份兩合公司，批號(hào)：L1003207913），乙腈（色譜純，默克股份兩合公司，批號(hào)JA081230），甲酸（色譜級(jí)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)：F1627027），水為超純水。

1.3 藥材與樣品

天南星（經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)楊成梓教授鑒定為天南星科植物天南星的正品，樣品烘干，粉碎，過(guò)4號(hào)篩備用）。夏佛塔苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111912-201703，純度≥93%）；異夏佛塔苷對(duì)照品（成都普斯生物科技股份有限公司，批號(hào)：PS0479-0020，純度≥98%）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Syncronis aQ C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇（A）乙腈（B）-0.4%甲酸水溶液（D）為流動(dòng)相（7 ：13 ：80），等度洗脫，流速 0.9 ml/min，柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為 334 nm，進(jìn)樣量 10 μl。見(jiàn)圖1。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)定夏佛塔苷、異夏佛塔苷對(duì)照品適量，置5 ml量瓶中，加適量甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，制成夏佛塔苷、異夏佛塔苷對(duì)照品溶液母液，加適量甲醇稀釋夏佛塔苷及異夏佛塔苷混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱(chēng)取供試品粉末1 g，量取10 ml 60%乙醇，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲（功率：600 W，頻率：45 kHz）60 min，放冷，在稱(chēng)定其質(zhì)量，用60%乙醇補(bǔ)足減失重量，以4000 r/min離心5 min，過(guò)0.45 μm的有機(jī)微孔濾膜即得。

圖1 供試品色譜圖（A），對(duì)照品色譜圖（B）

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密量取混合對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml至 10 ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取10 μl，注入高效液相色譜儀，觀(guān)察并記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標(biāo)，以混合對(duì)照品的濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程為Y夏佛塔苷=24 293X- 14 891（r=0.9999），Y異夏佛塔苷=21 027X- 28 253（r=0.9999），結(jié)果說(shuō)明夏佛塔苷、異夏佛塔苷分別在18.11～108.62 μg/ml，6.14～36.84 μg/ml內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.4.2 精密度考察 分別精密吸取同一份混合對(duì)照品溶液5次，各10 μl，分別注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，計(jì)算RSD，得到夏佛塔苷含量RSD值為0.73%及異夏佛塔苷為0.69%，表明精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性考察 取同一份混合對(duì)照品溶液，分別于 0、4、8、12、24 h 等時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣，精密吸取 10 μl注入高效液相色譜儀，得到夏佛塔苷含量RSD值為1.33%及異夏佛塔苷為0.91%，表明樣品的穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性考察 稱(chēng)取天南星粉末5份，精密吸取10 μl注入高效液相色譜儀，得到夏佛塔苷含量RSD值為2.03%及異夏佛塔苷為1.78%，說(shuō)明樣品重復(fù)性好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取天南星粉末6份（批號(hào)為20190507），分別精密加入夏佛塔苷及異夏佛塔苷對(duì)照品溶液，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 天南星中夏佛塔苷、異夏佛塔苷的回收率

2.5 樣品測(cè)定

精密稱(chēng)取不同產(chǎn)地，不同批次的天南星藥材37批，按照條件2.3項(xiàng)下方法制備天南星供試品溶液，按照條件2.1項(xiàng)下進(jìn)行含量測(cè)定。天南星藥材中夏佛塔苷、異夏佛塔苷的含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。不同產(chǎn)地天南星中夏佛塔苷、異夏佛塔苷的含量差異較大，夏佛塔苷的含量以四川最高、浙江最低，分別為55.346、0.006 μg/ml，異夏佛塔苷的含量以四川最高、東北最低，分別為 19.068、0.000 μg/ml。

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

針對(duì)流動(dòng)相體系，本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)乙腈體系和甲醇體系進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)前期在乙腈體系下，后期在甲醇體系下洗脫，樣品色譜峰分離度高，基線(xiàn)平穩(wěn)。通過(guò)不同濃度的乙酸及甲酸水溶液作為流動(dòng)相得出0.4%的甲酸水溶液作為流動(dòng)相時(shí)樣品及對(duì)照品的色譜峰分離度及保留時(shí)間相對(duì)較好。

3.2 提取條件的選擇

本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)提取溶劑、提取方法、提取時(shí)間進(jìn)行了考察，結(jié)果表明樣品用60%乙醇超聲（功率：600 W，頻率：45 kHz），提取60 min為最佳條件，其提取率最高。

3.3 色譜柱的選擇

本實(shí)驗(yàn)首次采用Syncronis aQ C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），進(jìn)行考察，利用三項(xiàng)流動(dòng)相進(jìn)行色譜考察與調(diào)整，得出良好的分離結(jié)果及保留時(shí)間，簡(jiǎn)單高速并節(jié)省成本。

本研究建立了一種利用HPLC同時(shí)測(cè)定天南星藥材中夏佛塔苷和異夏佛塔苷的方法，具有快速準(zhǔn)確、穩(wěn)定性高的特點(diǎn)，可快速實(shí)現(xiàn)對(duì)夏佛塔苷和異夏佛塔苷的含量測(cè)定，有利于其質(zhì)控的進(jìn)一步研究。其分析結(jié)果表明，四川地區(qū)的天南星夏佛塔苷、異夏佛塔苷含量最高，在東北、浙江等地區(qū)的含量較低，不同產(chǎn)地間的差異性顯著。反映出目前天南星在品種上存在質(zhì)量參差不齊的問(wèn)題，僅野生品種可能無(wú)法滿(mǎn)足臨床的應(yīng)用需求，宜在四川、福建等地區(qū)有選擇地建立規(guī)范化的種植基地，生產(chǎn)出質(zhì)量穩(wěn)定的藥材或飲片供臨床藥用，保證臨床用藥的安全性、有效性。

表2 天南星中夏佛塔苷、異夏佛塔苷的含量測(cè)定（±s，μg / ml）

表2 天南星中夏佛塔苷、異夏佛塔苷的含量測(cè)定（±s，μg / ml）

編號(hào) 藥材編號(hào) 產(chǎn)地 夏佛塔苷 異夏佛塔苷1 JN01 福建 3.176±0.005 0.433±0.003 2 FZ01 福建 4.969±0.006 0.299±0.006 3 SX01 福建 22.179±0.003 4.389±0.024 4 SX02 福建 19.351±0.005 3.828±0.002 5 SN01 福建 17.157±0.007 7.754±0.012 6 YTO1 福建 4.652±0.011 0.395±0.002 7 GZ01 貴州 25.274±0.012 2.590±0.006 8 GZ02 貴州 23.442±0.015 8.240±0.008 9 SCO2 四川 55.346±0.015 19.068±0.066 10 SC01 四川 54.164±0.001 13.904±0.033 11 HB01 湖北 16.195±0.003 2.537±0.005 12 HN02 湖南 11.288±0.004 1.008±0.002 13 HN01 湖南 10.220±0.003 2.010±0.063 14 AH02 安徽 13.628±0.004 1.661±0.001 15 AH04 安徽 12.574±0.006 2.247±0.003 16 JX01 江西 0.186±0.003 0.000±0.000 17 ZJ01 浙江 0.006±0.005 0.000±0.008 18 ZJ02 浙江 5.483±0.007 0.000±0.000 19 AG03 東北 1.465±0.008 0.000±0.000 20 AG04 東北 2.007±0.002 0.000±0.000 21 JL01 東北 1.421±0.005 0.351±0.005 22 JL02 東北 4.524±0.002 0.546±0.001 23 LN01 東北 0.547±0.001 0.000±0.000 24 YN01 云南 13.903±0.007 4.679±0.043 25 YN02 云南 14.419±0.006 1.354±0.017 26 CD01 四川 49.748±0.007 17.097±0.001 27 PC03 福建 0.208±0.004 0.000±0.000 28 WYS06 福建 9.504±0.014 0.655±0.001 29 PC04 福建 19.635±0.004 7.000±0.008 30 PC06 福建 19.351±0.004 3.828±0.006 31 WYS08 福建 11.286±0.009 10.192±0.006 32 PC08 福建 6.534±0.002 5.284±0.009 33 WYS05 福建 28.913±0.002 10.240±0.001 34 WYS07 福建 23.215±0.014 4.569±0.003 35 PC05 福建 1.730±0.003 4.187±0.004 36 PC07 福建 33.031±0.004 12.254±0.012 37 WYS09 福建 22.815±0.006 5.302±0.001 38 對(duì)照藥材 - 1.040±0.005 0.000±0.000