王宜運(yùn), 呂曉芳, 徐豪杰, 孟子暉*, 李加榮, 徐志斌, 薛 敏

(1.北京理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,北京 102488;2.山東新華制藥股份有限公司,山東 淄博 255086)

帕金森氏病(PD)是老年人的神經(jīng)退行性疾病。該疾病主要導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)障礙,如靜息性震顫、肌肉僵硬、運(yùn)動(dòng)遲緩和步態(tài)異常,以及非運(yùn)動(dòng)性癥狀,如肌張力低下、睡眠障礙、焦慮和抑郁[1,2]。PD影響世界各地的數(shù)百萬(wàn)人。中國(guó)有超過(guò)250萬(wàn)PD患者。研究表明,PD的發(fā)病率會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而顯著增加,到2030年,PD的患者數(shù)量可能會(huì)增加一倍[3,4]。目前,尚未發(fā)現(xiàn)可以逆轉(zhuǎn)或治愈PD的確切藥物和相應(yīng)療法。因此,如何有效地延遲PD的進(jìn)程是當(dāng)前亟待解決的問(wèn)題。PD的治療主要是臨床對(duì)癥治療為主,以康復(fù)治療為輔,其中藥物治療是主要治療手段[5,6]。左旋多巴(L-dopa)是控制PD的非常有效的代表性藥物,但長(zhǎng)期大量服用左旋多巴常伴有藥物運(yùn)動(dòng)型并發(fā)癥劑末現(xiàn)象,導(dǎo)致PD癥狀加重或者惡化[7,8]。

由日本的Kyowa Hakko Kogyo公司研發(fā)的伊曲茶堿((E)-8-(3,4-二甲氧基苯乙烯基)-1,3-二乙基-7-甲基-3,7-二氫-1H-嘌呤-2,6-二酮,見圖1)是一種新型選擇性腺苷A2A受體拮抗劑,通過(guò)激活丘腦底核的γ-氨基丁酸(GABA)能通路,改善患者的運(yùn)動(dòng)癥狀[9]。

圖 1 伊曲茶堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of istradefylline

伊曲茶堿于2013年3月在日本上市,作為左旋多巴/卡比多巴的輔助療法,能明顯縮短關(guān)期,延長(zhǎng)開期,可顯著降低左旋多巴治療的劑末現(xiàn)象[10-13]。與其他抗PD藥物相比,伊曲茶堿具有較小的副作用,在克服多巴胺藥物的某些缺陷上具有顯著作用,因此在治療PD方面具有廣闊的前景[14]。

伊曲茶堿的上市在PD患者的藥物治療上又邁出了成功的一步,但在伊曲茶堿的合成過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)其中還存在一些未知雜質(zhì),這些雜質(zhì)的存在會(huì)對(duì)藥物活性帶來(lái)一定的影響,對(duì)安全性帶來(lái)一定的風(fēng)險(xiǎn)。因此鑒定和減少藥物中的雜質(zhì)非常必要,可以保證藥物的有效性和安全性[15,16]。目前高效液相色譜(HPLC)是最常用的雜質(zhì)檢測(cè)方法之一[17,18]。

在伊曲茶堿合成中,中間體A1(6-氨基-1,3-二乙基-2,4-(1H,3H)-嘧啶二酮)是其中一個(gè)關(guān)鍵中間體,由1,3-二乙基脲與氰基乙酸經(jīng)縮合、環(huán)合反應(yīng)制得[19](見圖2)。

圖 2 中間體A1合成路線Fig.2 Synthetic route of intermediate A1

圖 3 (E)-N-乙基-2-氰基-3-乙氨基-2-丁烯酰胺的結(jié)構(gòu)Fig.3 Structure of (E)-N-ethyl-2-cyano-3-ethylamino-2-butene amide

在我們前期的研究中,中間體A1的一個(gè)雜質(zhì)已經(jīng)被鑒定出并進(jìn)行了表征,如圖3所示,其結(jié)構(gòu)被鑒定為(E)-N-乙基-2-氰基-3-乙氨基-2-丁烯酰胺,此為中間體A1的降解雜質(zhì)[20]。在對(duì)合成過(guò)程中的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行研究和分析時(shí),發(fā)現(xiàn)A1中還存在另外一個(gè)未知雜質(zhì)。因此,我們繼續(xù)展開研究以確定其結(jié)構(gòu),并對(duì)其進(jìn)行鑒定及表征。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀:配備SPD-10 Avp檢測(cè)器的LC-20AD系統(tǒng)(日本Shimadzu);制備型高效液相色譜儀:KNAUER-AZURA HPLC系統(tǒng)(德國(guó)Knauer);高分辨率質(zhì)譜(HRMS):1200RRLC-6520 Accurate-Mass Q-TOF(美國(guó)安捷倫),其中ESI為正離子模式。核磁共振(NMR)分析儀:Bruker AⅧ 600 M(美國(guó)Bruker);單晶衍射儀:Bruker-apex2 X射線衍射儀(美國(guó)Bruker)。

伊曲茶堿中間體:山東新華制藥股份有限公司(中國(guó)淄博)生產(chǎn);色譜級(jí)乙腈、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自德國(guó)Merck;水通過(guò)Milli-Q水凈化系統(tǒng)(美國(guó)Millipore)進(jìn)行凈化。

1.2 樣品制備

稱取0.4 g中間體A1放入50 mL的燒杯中,依次加入8 mL水、8 mL乙腈,超聲溶解,然后通過(guò)0.45 μm有機(jī)膜過(guò)濾,得到測(cè)試樣品溶液。

1.3 HPLC條件

分析型HPLC Agilent Zorbax C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫:35 ℃;流動(dòng)相:乙腈(A)和水(B);流速:1.0 mL/min;梯度洗脫(tmin/A∶B)=t0/20∶80,t15/60∶40,t20～t50/90∶10;檢測(cè)波長(zhǎng):268 nm。

制備型HPLC Ceres B制備柱(250 mm×30 mm,7 μm);流動(dòng)相:乙腈-水(30/70,v/v);流速:30 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):268 nm。

1.4 核磁共振、質(zhì)譜分析條件

NMR:將樣品(氫譜:1 mg;碳譜:10 mg)放入清潔干燥的樣品管中,加入1 mL DMSO溶解后將樣品管密封好。將樣品管插入轉(zhuǎn)子,調(diào)整樣品管的高度,樣品管插入深度與量筒的底部相平。將轉(zhuǎn)子按序列放入進(jìn)樣器,設(shè)置樣品檢測(cè)參數(shù),開始測(cè)試。測(cè)試完成后,對(duì)圖譜進(jìn)行處理。

HRMS:將樣品(10 mg)加入25 mL容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,用0.22 μm的有機(jī)濾膜過(guò)濾,得到樣品,備用。設(shè)置參數(shù),進(jìn)樣,開始測(cè)試。測(cè)試完成后,對(duì)圖譜進(jìn)行處理,分析檢測(cè)結(jié)果。

1.5 單晶X射線衍射條件

單晶制備:于50 mL單口瓶中加入1 g伊曲茶堿中間體A1、20 mL乙醇,攪拌加熱至回流,待完全溶解,關(guān)掉熱源,冷卻至室溫后,繼續(xù)攪拌析晶2 h。抽濾干燥得伊曲茶堿中間體A1晶體。

檢測(cè)條件:Mo-Kα輻射(λ=71.073 pm),296 K。

2 結(jié)果與討論

2.1 雜質(zhì)分析

通過(guò)高效液相色譜對(duì)伊曲茶堿中間體A1進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)分析,在保留時(shí)間6.82 min和20.22 min處有兩個(gè)較大的雜質(zhì)峰(見圖4)。在前期的研究[20]中,保留時(shí)間20.22 min處的雜質(zhì)已經(jīng)被鑒定出并進(jìn)行了表征,保留時(shí)間6.82 min處雜質(zhì)需要進(jìn)一步分離、鑒定。

2.2 制備型HPLC分離、制備雜質(zhì)

在1.3節(jié)制備型HPLC色譜條件下分離中間體A1及相關(guān)物質(zhì)。從圖5可以看出,中間體A1和雜質(zhì)分離度較好，收集保留時(shí)間為5.80 min處的餾分(經(jīng)薄層色譜及分析型HPLC分析確定為目標(biāo)物),然后用二氯甲烷萃取,減壓濃縮,干燥,得到淡黃色物料。

圖 5 中間體A1相關(guān)物質(zhì)的制備HPLC圖Fig.5 Preparative HPLC chromatogram of intermediate A1 and its relative substances

2.3 雜質(zhì)的表征

從圖6可以看出,雜質(zhì)的HRMS圖顯示了質(zhì)子化分子[M-H]-在m/z253.19處,與中間體A1的質(zhì)譜(m/z183.100 8)明顯不同。

圖 6 雜質(zhì)的HRMS圖Fig.6 HRMS spectrum of the impurity

雜質(zhì)的NMR光譜圖見圖7。

圖 7 雜質(zhì)的(a)1H NMR譜和(b)13C NMR譜Fig.7 (a) 1H NMR spectrum and (b) 13C NMR spectrum of the impurity

圖 8 雜質(zhì)的(a)HSQC和(b)HMBC NMR譜圖Fig.8 (a) Heteronuclear single quantum coherence (HSQC) and (b) heteronuclear multiple bond correlation (HMBC) NMR spectra of the impurity

雜質(zhì)1H-NMR:1H-NMR (600 MHz,DMSO):δ1.01 (q,J=6.9 Hz,3H),1.02 (q,J=6.9 Hz,3H),1.07 (t,J=6.9 Hz,3H),3.04 (p,J=6.8 Hz,2H),3.74 (q,J=7.0 Hz,2H),3.94 (q,J=7.1 Hz,2H),5.85 (s,1H)。

雜質(zhì)13C-NMR (150 MHz,DMSO):δ13.9,14.1,15.9,34.6,34.9,36.9,81.9,152.2,153.3,159.3,162.0。

基于上述表征,該雜質(zhì)比中間產(chǎn)物A1多一個(gè)甲基和一個(gè)亞甲基,雜質(zhì)的分子骨架具有11個(gè)碳,這與具有8個(gè)碳的A1的分子骨架不一致。因此,可以得出結(jié)論,雜質(zhì)是中間產(chǎn)物A1的副產(chǎn)物。

為了進(jìn)一步確定雜質(zhì)的結(jié)構(gòu),使用異核單量子相干譜(HSQC)和異核多碳相關(guān)譜(HMBC)(見圖8)來(lái)表征氫和碳。根據(jù)HSQC,H(δ1.02)與H-5(δ3.74)相關(guān),并且與C-6(δ13.9)相關(guān),因此被確認(rèn)為H-6。H(δ1.01)與H-10(δ3.04)相關(guān),并且與C-11(δ15.9)相關(guān),被確認(rèn)為H-11。H(δ1.07)與H-7(δ3.94)相關(guān),并且與C-8(δ14.1)相關(guān),被確認(rèn)為H-8。H(δ3.74)與H-6(δ1.02)相關(guān),并且與C-5(δ34.9)相關(guān),被確認(rèn)為H-5。H(δ3.04)與H-11(δ1.01)相關(guān),并且與C-10(δ34.6)相關(guān),被確認(rèn)為H-10。H(δ3.94)與H-8(δ1.07)相關(guān),并且與C-7(δ36.9)相關(guān),已確認(rèn)為H-7。H(δ5.85)與C-3(δ81.9)相關(guān),被確認(rèn)為H-3。

根據(jù)化學(xué)位移和相應(yīng)的氫光譜,雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)包含3個(gè)伯碳、3個(gè)仲碳、1個(gè)叔碳和4個(gè)季碳。在HMBC光譜中,伯碳峰(δ15.9)與H-11(δ1.01)相關(guān),而與H-10(δ3.04)遠(yuǎn)程相關(guān),因此是甲基C-11。C(δ14.1)與H-8(δ1.07)相關(guān),而與H-7(d3.94)遠(yuǎn)程相關(guān),為甲基C-8。C(δ13.9)與H-6(δ1.02)相關(guān),而與H-5(δ3.74)遠(yuǎn)程相關(guān),因此為甲基C-6。根據(jù)HMBC光譜,仲碳峰(δ36.9)與H-7(δ3.94)相關(guān),而與H-8(δ1.07)遠(yuǎn)程相關(guān),因此被確認(rèn)為亞甲基C-7。C(δ34.9)與H-5(δ3.74)相關(guān),而與H-6(δ1.02)遠(yuǎn)程相關(guān),被確認(rèn)為亞甲基C-5。C(δ34.6)與H-10(δ3.04)相關(guān),而與H-11(δ1.01)遠(yuǎn)程相關(guān),為亞甲基C-10。叔碳峰(δ81.9)與H-3(δ5.85)相關(guān),與HMBC光譜無(wú)關(guān),已確認(rèn)為C-3。季碳峰(δ162.0)與HMBC譜圖中H-7(δ3.94)遠(yuǎn)程相關(guān),確認(rèn)為C-4。HMBC譜顯示C(δ159.3)與H-10(δ3.04)密切相關(guān),確認(rèn)為C-9。C(δ153.3)與H-7(δ3.94)和H-5(δ3.74)密切相關(guān),確認(rèn)為C-1。C(δ152.2)與H-5(δ3.74)遠(yuǎn)程相關(guān),被確認(rèn)為C-2。綜上所述,推測(cè)該結(jié)構(gòu)為1-(1,3-二乙基-2,6-二氧-1,2,3,6-四氫嘧啶-4-基)-3-乙基脲(見表1)。

表1 雜質(zhì)的HSQC和HMBC核磁共振數(shù)據(jù)Table 1 HSQC and HMBC NMR data of the impurity

為了進(jìn)一步驗(yàn)證和確定物質(zhì)的空間結(jié)構(gòu),用單晶X射線衍射對(duì)分離出的雜質(zhì)進(jìn)行了表征,表征結(jié)果見表2。通過(guò)數(shù)據(jù)分析及單晶衍射結(jié)構(gòu)(見圖9)分析,進(jìn)一步確定其結(jié)構(gòu)為1-(1,3-二乙基-2,6-二氧-1,2,3,6-四氫嘧啶-4-基)-3-乙基脲。

表2 雜質(zhì)的晶體數(shù)據(jù)Table 2 Crystal data for the impurity

圖 9 雜質(zhì)的單晶X射線衍射結(jié)構(gòu)Fig.9 Single crystal X-ray diffraction structure of the impurity

2.4 雜質(zhì)的形成機(jī)理

在合成中間體A1時(shí)使用的原料是過(guò)量的,因此我們推斷雜質(zhì)的形成機(jī)理可能如下:氰基乙酸與二乙基脲、乙酸酐進(jìn)行縮合反應(yīng)得到中間體A1的過(guò)程(見圖2)中,過(guò)量的二乙基脲繼續(xù)與A1發(fā)生酰胺化反應(yīng)生成1-(1,3-二乙基-2,6-二氧-1,2,3,6-四氫嘧啶-4-基)-3-乙基脲,即生成了此雜質(zhì)(見圖10)。此雜質(zhì)為中間體A1副產(chǎn)物,與前期研究[20]中發(fā)現(xiàn)的中間體A1降解雜質(zhì)(E)-N-乙基-2-氰基-3-乙氨基-2-丁烯酰胺形成機(jī)理雖然不同,但同樣都是在高溫條件下形成的。

圖 10 推測(cè)的雜質(zhì)反應(yīng)機(jī)理Fig.10 Speculated reaction mechanism of the impurity

3 結(jié)論

本研究采用制備型HPLC分離伊曲茶堿中間體A1中的雜質(zhì)。通過(guò)HRMS、NMR、2D NMR和單晶X射線衍射分析,雜質(zhì)結(jié)構(gòu)確定為1-(1,3-二乙基-2,6-二氧-1,2,3,6-四氫嘧啶-4-基)-3-乙基脲。推測(cè)其反應(yīng)機(jī)理為:由于在堿性條件下或高溫下合成中間體A1時(shí)過(guò)量的二乙基脲而產(chǎn)生了中間體A1的副產(chǎn)物。該雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)可能會(huì)對(duì)伊曲茶堿的安全性和有效性產(chǎn)生影響。為了確保伊曲茶堿的質(zhì)量,在生產(chǎn)過(guò)程中需要對(duì)該雜質(zhì)的含量進(jìn)行控制。

致謝 感謝遼寧雙士利制藥技術(shù)有限公司提供2D NMR服務(wù)。