張科明, 鄧 鳴, 蘇媛媛, 謝 東, 許有誠, 劉向紅*

(1.廣西食品藥品檢驗(yàn)所,廣西 南寧 530021;2.桂林醫(yī)學(xué)院,廣西 桂林 541004)

隨著護(hù)膚知識(shí)的普及,防曬日漸受到消費(fèi)者重視,防曬劑廣泛應(yīng)用于各類化妝品中,包括防曬霜、防曬乳、防曬噴霧、隔離霜、唇膏以及粉餅等,用量通常在0.1%～10%之間。由于防曬類化妝品中的防曬成分有一定的副作用,世界各國對(duì)防曬劑種類及最大使用濃度有不同要求[1,2]。我國《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)[3](下文簡稱《規(guī)范》)收載了27種準(zhǔn)用防曬劑,包括25種化學(xué)防曬劑和2種物理防曬劑。各化學(xué)防曬劑的使用頻率有較大區(qū)別,根據(jù)2020年本實(shí)驗(yàn)室收集的121批防曬樣品的實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì),甲氧基肉桂酸乙基己酯使用頻率最高(86.0%),其次為雙-乙基己氧苯酚甲氧苯基三嗪(50.4%)、二乙氨羥苯甲?；郊姿峒乎?40.5%)、水楊酸乙基己酯(37.9%)、丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷(36.6%)等14種組分,苯基二苯并咪唑四磺酸酯二鈉、二甲基PABA乙基己酯、樟腦苯扎銨甲基硫酸鹽、亞芐基樟腦磺酸、二苯酮-4/二苯酮-5、3-亞芐基樟腦等6種組分未見使用。

目前,防曬劑的檢測方法有高效液相色譜法[4-11]、超高效合相色譜法[12-13]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[14-17]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[18,19]等,其中高效液相色譜法應(yīng)用最廣?！兑?guī)范》收載了5種檢測方法,2019年又新增了22種防曬劑的檢測方法[20]。其中新增的22種防曬劑的檢測方法操作最便捷,但仍存在諸多不足:流動(dòng)相四氫呋喃含量高,易腐蝕液相色譜聚醚醚酮(PEEK)管路,且污染環(huán)境;被測組分中甲酚曲唑三硅氧烷的穩(wěn)定性差,大批量測定數(shù)據(jù)失真;提取溶劑兼容性差,弱極性組分提取不完全等。因此,本研究選取霜、乳、水、噴霧、唇膏等不同類型基質(zhì)進(jìn)行研究,對(duì)提取溶劑進(jìn)行了改進(jìn);對(duì)分析過程中采用的流動(dòng)相種類及改性劑進(jìn)行了優(yōu)化,使基線平穩(wěn)。在系統(tǒng)優(yōu)化的基礎(chǔ)上,采用小粒徑(2.7 μm)的C18超高壓色譜柱,實(shí)現(xiàn)了全部22種組分(包括《規(guī)范》未收錄的二苯酮-2)的基線分離。方法簡便快捷、結(jié)果準(zhǔn)確、環(huán)保低毒,具有更強(qiáng)的適用性和耐用性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

UltiMate 3000高效液相色譜儀(美國Thermo Scientific公司),配置DAD檢測器;Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司);G560E快速混勻器(美國Scientific Industries有限公司);S120H超聲波發(fā)生器(德國Elma公司);XS205DU電子天平(瑞士梅特勒公司)。

甲醇、乙腈、異丙醇、四氫呋喃、乙酸銨、甲酸均為色譜純(美國Fisher公司);水為超純水。

22種防曬劑標(biāo)準(zhǔn)品及純度為苯基苯并咪唑磺酸(PBS)96.2%、二苯酮-4(BZ4)96.2%、4-甲基芐亞基樟腦(MBC)99.83%、二乙氨羥苯甲?；郊姿峒乎?DHHB)99.4%、二甲基PABA乙基己酯(EDP)99.2%、水楊酸乙基己酯(ES)99.4%、胡莫柳酯(HS)98.86%、亞甲基雙-苯并三唑基四甲基丁基酚(MBP)97%(購自Dr.Ehrenstorfer公司),亞芐基樟腦磺酸(BCS)98.9%、二苯酮-3(BZ3)100%、對(duì)甲氧基肉桂酸異戊酯(IMC)99.2%、奧克立林(OCR)99.6%、丁基甲氧基二苯甲?；淄?BDM)99.7%、甲氧基肉桂酸乙基己酯(EMC)99.5%、二乙基己基丁酰胺基三嗪酮(DBT)98.3%、乙基己基三嗪酮(ET)94.6%、雙-乙基己氧苯酚甲氧苯基三嗪(EMT)98.7%(購自ANPEL公司),對(duì)苯二亞甲基二樟腦磺酸(TDS)98.0%(購自International Laboratory公司),樟腦苯扎銨甲基硫酸鹽(CBM)98.0%、3-亞芐基樟腦(3BC)97.0%(購自Sigma-Aldrich公司),二苯酮-2(BZ2)95.0%(購自CNW公司),甲酚曲唑三硅氧烷(DRT)94.4%(購自CATO公司)。

16批樣品分別由廠家提供或購于本地商場、超市。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取苯基苯并咪唑磺酸標(biāo)準(zhǔn)品50 mg至10 mL棕色容量瓶中,先加入1.0 mL甲醇,然后滴加1.0 mol/L氫氧化鈉溶液至溶解,用甲醇定容至刻度,搖勻,即得苯基苯并咪唑磺酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,置于4 ℃冰箱備用。

分別精密稱取丁基甲氧基二苯甲?；淄?、乙基己基三嗪酮、亞甲基雙-苯并三唑基四甲基丁基酚和雙-乙基己氧苯酚甲氧苯基三嗪標(biāo)準(zhǔn)品各50 mg至不同的10 mL棕色容量瓶中,先加入4.0 mL四氫呋喃,超聲至溶解,用甲醇定容至刻度,搖勻,即得上述4種防曬劑的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,置于4 ℃冰箱備用。

精密稱取其余17種防曬劑各50 mg至不同的10 mL棕色容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,即得其余17種防曬劑的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,置于4 ℃冰箱備用。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:根據(jù)各防曬劑使用限量及色譜響應(yīng)差別,分別移取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量,用甲醇稀釋成100 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,置于4 ℃冰箱備用。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:用甲醇將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋成1、2、5、20、50 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,置于4 ℃冰箱備用。

1.3 樣品前處理

霜、乳、粉餅:稱取樣品0.25 g,置于25 mL具塞比色管中,加入四氫呋喃2.0 mL,渦旋1 min使樣品分散均勻,然后用0.1%(v/v)甲酸乙醇溶液定容至刻度,搖勻,超聲提取20 min,放冷至室溫,準(zhǔn)確吸取1.00 mL至10 mL具塞試管中,0.1%(v/v)甲酸乙醇溶液定容至刻度,混勻,經(jīng)0.45 μm聚四氟乙烯(PTFE)微孔過濾后進(jìn)行測定。

露、爽膚水、噴霧劑:稱取樣品0.25 g,置于25 mL具塞比色管中,0.1%(v/v)甲酸乙醇溶液定容至刻度,搖勻,準(zhǔn)確吸取1.00 mL至10 mL具塞試管中,0.1%(v/v)甲酸乙醇溶液定容至刻度,混勻,經(jīng)0.45 μm PTFE微孔過濾后進(jìn)行測定。

唇膏:稱取樣品0.25 g,置于25 mL具塞比色管中,加入四氫呋喃5.0 mL,渦旋,50 ℃超聲20 min使樣品充分溶散,放冷至室溫,0.1%(v/v)甲酸乙醇溶液定容至刻度,搖勻,準(zhǔn)確吸取1.00 mL至10 mL具塞試管中,0.1%(v/v)甲酸乙醇溶液定容至刻度,混勻,經(jīng)0.45 μm PTFE微孔過濾后進(jìn)行測定。

1.4 色譜條件

色譜柱:Agilent Poroshell 120 EC-C18Column(100 mm×4.6 mm,2.7 μm);流動(dòng)相:A為50 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.05%(v/v)甲酸),B為乙腈,C為異丙醇。梯度洗脫程序:0～5 min,80%A～50%A,10%B～25%B,10%C～25%C;5～8 min,50%A～30%A,25%B～42%B,25%C～28%C;8～22 min,30%A～25%A,42%B～45%B,28%C～30%C;22～26 min,25%A～0%A,45%B～50%B,30%C～50%C;26～33 min,0%A,50%B,50%C;33～35 min,0%A～80%A,50%B～10%B,50%C～10%C;35～38 min,80%A,10%B,10%C。流速:0.5 mL/min;進(jìn)樣量:5 μL;檢測波長:311 nm;柱溫:25 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1色譜柱及柱溫的選擇

本研究考察了Luna C18(150 mm×2.0 mm,3 μm)、Poroshell 120 EC-C18(100 mm×4.6 mm,2.7 μm)、CSH C18(150 mm×3.0 mm,1.7 μm)以及Zorbax Eclipse plus RRHD C18(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)4種型號(hào)的色譜柱對(duì)22種化學(xué)防曬劑的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CSH C18和RRHD C18均不能有效分離BZ2-BCS和OCR-BDM兩組成分,Luna C18和RRHD C18均不能有效分離ET-DRT和MBP-EMT兩組成分,同時(shí)色譜信號(hào)響應(yīng)較低。故本實(shí)驗(yàn)選擇Poroshell 120 EC-C18色譜柱,其分離得到的色譜峰響應(yīng)相對(duì)較高,且分離度良好。

考察了25、30、40、50、60 ℃條件下色譜分離的情況。隨著溫度升高,色譜分離時(shí)間縮短,但幾組物質(zhì)(CBM、BZ2和BCS,3BC和IMC,ET和DRT,MBP和EMT)分離度越來越差,BDM呈現(xiàn)大寬峰,峰形前延嚴(yán)重,不易定性定量。因此,設(shè)置恒定溫度25 ℃。

2.1.2流動(dòng)相的選擇

《規(guī)范》[3,20]選擇了高濃度的四氫呋喃作為流動(dòng)相。四氫呋喃易揮發(fā),毒性較強(qiáng),同時(shí)易腐蝕PEEK管路,縮短儀器使用壽命。因此,本研究考慮采用常規(guī)的甲醇或乙腈和乙酸銨水溶液添加一定比例的酸性改性劑作為流動(dòng)相,以實(shí)現(xiàn)22種防曬劑的分離。僅采用乙酸銨-甲醇或乙酸銨-乙腈均不能實(shí)現(xiàn)大部分化合物的有效分離。乙酸銨-乙腈體系中,加入一定比例的異丙醇,能有效分離大部分脂溶性防曬劑。為了改善目標(biāo)物的色譜峰形及分離度,往乙酸銨中加入0.05%(v/v)甲酸能有效提高DBT等化合物的響應(yīng)值,同時(shí)改善OCR-BDM-EDP-EMC和CBM-BZ2-BCS的分離度。故本實(shí)驗(yàn)選擇50 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.05%(v/v)甲酸)-乙腈-異丙醇作為流動(dòng)相,22種防曬劑的分離效果更好,信號(hào)強(qiáng)度相對(duì)更高。

隨后優(yōu)化了梯度洗脫條件。經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn),改變不同時(shí)間段流動(dòng)相中有機(jī)相和水相的比例,最終確定了最佳梯度洗脫條件,獲得了22種防曬劑的最佳分離效果,色譜圖見圖1。

圖 1 22種防曬劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖(311 nm)Fig.1 HPLC chromatogram of the mixed standard solution of the 22 sunscreen agents (311 nm)PBS:phenylbenzimidazole sulfonic acid;TDS:terephthalydene dicamphor sulfonic acid;BZ4:benzophenone-4;CBM:camphor benzalkonium methosulfate;BZ2:benzophenone-2;BCS:benzylidene camphor sulfonic acid;BZ3:benzophenone-3;3BC:3-benzylidene camphor;IMC:isoamyl p-methoxycinnamate;MBC:4-methylbenzylidene camphor;DHHB:diethylamino hydroxybenzoyl hexyl benzoate;OCR:octocrylene;BDM:butyl methoxydibenzoyl methane;EDP:ethylhexyl dimethyl PABA;EMC:ethylhexyl methoxycinnamate;HS1:homosalate 1;ES:ethylhexyl salicylate;HS2:homosalate 2;DBT:diethylhexyl butamido triazone;ET:ethylhexyl triazone;DRT:drometrizole trisiloxane;MBP:methylene bis-benzotriazolyl tetramethylbutylphenol;EMT:bis-ethylhexyloxyphenol methoxyphenyl triazine.

圖 2 不同提取溶劑提取乳液的效果比較Fig.2 Comparison of emulsion extracted with different solutionsa.methanol-tetrahydrofuran-water-perchloric acid (250∶450∶300∶0.25,v/v/v/v) solution[20];b.sample dispersed and dissolved by adding 2 mL tetrahydrofuran,then extracted with ethanol containing 0.1% (v/v) formic acid.

2.1.3檢測波長的確定

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)二極管陣列檢測器在190～400 nm波長范圍內(nèi)全掃描,結(jié)果發(fā)現(xiàn),22種目標(biāo)物最大紫外吸收波長分布在4個(gè)區(qū)域。PBS、IMC、MBC、OCR、EDP、EMC、ES、HS、DBT、ET、DRT、MBP和EMT均在311 nm波長附近有最大紫外吸收;BZ4、CBM、BCS、BZ3和3BC最大吸收波長為290 nm;TDS和BZ2為340 nm;DHHB和BDM則為358 nm。《規(guī)范》所涉及方法的檢測波長統(tǒng)一為311 nm。本方法在311 nm波長下的檢測靈敏度均高于原標(biāo)準(zhǔn)。因此,為方便結(jié)果比較,選擇311 nm作為檢測波長對(duì)上述22種防曬劑進(jìn)行定性定量分析。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

選取含有多種化學(xué)防曬劑的霜、乳類樣品進(jìn)行提取方法考察。根據(jù)化合物極性相似相溶的原理,我們分別考察了甲醇(極性6.6,黏度0.6)、乙腈(極性6.2,黏度0.37)、異丙醇(極性4.3,黏度2.37)和乙醇(極性4.3,黏度1.2)等溶劑代替四氫呋喃(極性4.2,黏度0.55)提取樣品的效果。同時(shí),為了抑制因苯基苯并咪唑磺酸等組分電離而增加的水溶性,向提取溶劑中加入0.1%(v/v)甲酸,增加有機(jī)溶劑提取效率。與四氫呋喃-甲醇-水-高氯酸(450∶250∶300∶0.25,v/v/v/v)溶劑系統(tǒng)(標(biāo)準(zhǔn)方法[20])比較,各溶劑提取效果見表1。

表1 不同溶劑提取霜、乳類化妝品中防曬劑的結(jié)果(n=2)Table 1 Results of the sunscreen agents extracted with different solvents from cream and emulsion cosmetics (n=2)

從表1我們可以看出,采用《規(guī)范》中的標(biāo)準(zhǔn)方法提取某乳液,亞甲基雙-苯并三唑基四甲基丁基酚、雙-乙基己氧苯酚甲氧苯基三嗪和甲酚曲唑三硅氧烷等脂溶性成分提取不完全。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),樣品不能完全溶散,比色管刻度線上方分散部分樣品,底部樣品顆粒較大(見圖2)。因此,不能反映樣品的真實(shí)情況。本研究采用0.1%(v/v)甲酸乙醇溶劑可以提取絕大部分防曬劑,但也存在上述部分脂溶性成分提取不完全的情況,因此先加入2 mL四氫呋喃溶散霜、乳等非蠟質(zhì)樣品,再用0.1%(v/v)甲酸甲醇溶劑提取可以獲得滿意結(jié)果,提取方法優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)方法。

對(duì)于唇膏等蠟質(zhì)化妝品,僅靠四氫呋喃渦旋振蕩不能使其完全分散,檢測結(jié)果偏低,而采用50 ℃超聲20 min,唇膏樣品分散完全,目標(biāo)物充分溶出,測定結(jié)果準(zhǔn)確。

2.3 線性范圍、檢出限及定量限

在優(yōu)化的色譜條件下,分別對(duì)系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測定,以各化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、色譜峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析。結(jié)果顯示,22種防曬劑在進(jìn)樣范圍內(nèi),線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.998;向不含目標(biāo)物的化妝品基質(zhì)中添加不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,按實(shí)驗(yàn)方法檢測,以3倍信噪比(S/N≥3)時(shí)的目標(biāo)物含量為檢出限,以10倍信噪比(S/N≥10)時(shí)目標(biāo)物含量為定量限,結(jié)果如表2所示。

表2 22種防曬劑的保留時(shí)間、線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Table 2 Retention times,linear ranges,linear equations,correlation coefficients (r),LODs and LOQs of the 22 sunscreen agents

2.4 回收率和精密度

向霜(不含蠟質(zhì))和唇膏(含蠟質(zhì))陰性樣品中添加低、中、高3個(gè)水平的目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液,依本研究建立的方法進(jìn)行樣品處理和測定,用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量,計(jì)算方法的回收率,結(jié)果見表3。不同基質(zhì)中各組分的加樣回收率為85.2%～112.3%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.5%～6.5%,表明該方法具有良好的準(zhǔn)確性和精密度。

表3 空白化妝品中22種防曬劑的加標(biāo)回收率和精密度(n=6)Table 3 Recoveries and precisions of the 22 sunscreen agents spiked in blank cosmetics (n=6)

2.5 穩(wěn)定性

《規(guī)范》使用的四氫呋喃-甲醇-水-高氯酸(450∶250∶300∶0.25,v/v/v/v)溶劑[20]含有45%(v/v)四氫呋喃,沸點(diǎn)低,易揮發(fā),混合儲(chǔ)備溶液(100 mg/L)不能久置。-20 ℃條件下,儲(chǔ)備液放置半個(gè)月,大部分組分濃度升高7%以上;苯基苯并咪唑磺酸組分易分解成兩個(gè)相鄰色譜峰?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液(50 mg/L)室溫放置12 h,甲酚曲唑三硅氧烷降解71%。

常溫條件下,分別用甲醇配制高(50 mg/L)、中(10 mg/L)、低(2 mg/L)3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,于0、4、8、12、16、24、36、48、72 h各測定一次,計(jì)算每次測定的各組分峰面積的RSD。結(jié)果顯示,除BDM、CBM和DRT外,其余19種防曬劑在72 h內(nèi)均穩(wěn)定,RSD均小于3.6%。低濃度條件下,BDM組分48 h內(nèi)穩(wěn)定(降解率<9.2%),CBM組分36 h內(nèi)穩(wěn)定(降解率<11%);中濃度條件下,CBM組分36 h內(nèi)穩(wěn)定(降解率<8.8%),DRT組分12 h內(nèi)穩(wěn)定(降解率<8.8%);高濃度條件下,DRT組分12 h內(nèi)穩(wěn)定(降解率<9.0%)。因此,樣品處理后應(yīng)一天內(nèi)完成測定(除樣品標(biāo)簽提示含有DRT需12 h內(nèi)測定外),從而保證結(jié)果準(zhǔn)確性。

用甲醇配制中、低濃度的DRT單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,72 h內(nèi)均穩(wěn)定,峰面積的RSD<1.0%。綜上所述,溶劑中含有高氯酸(《規(guī)范》溶劑引入)或氫氧化鈉溶液(配制PBS儲(chǔ)備液引入),均會(huì)促使DRT降解發(fā)生。

2.6 實(shí)際樣品的測定

用所建立的方法對(duì)市售的16份化妝品樣品(其中乳6份、霜5份、露或液3份、噴霧1份、唇膏1份)進(jìn)行防曬劑含量分析,并將測定的組分結(jié)果與產(chǎn)品標(biāo)簽和批件進(jìn)行比對(duì),結(jié)果見表4,部分樣品的色譜圖見圖3。測定結(jié)果顯示,所有樣品檢出的組分與產(chǎn)品標(biāo)簽和批件標(biāo)示標(biāo)識(shí)一致,表明產(chǎn)品穩(wěn)定性良好,企業(yè)按批件配方生產(chǎn)。同時(shí),“乳-1”“乳-2”“霜-1”“霜-2”和“霜-3”樣品使用本方法測定的結(jié)果與廠家提供的配方值匹配良好。因此,該方法對(duì)不同基質(zhì)的化妝品具有良好的適用性。

表4 市售化妝品樣品中防曬劑的測定結(jié)果Table 4 Contents of the sunscreen agents found in commercial cosmetic products

圖 3 部分市售化妝品的液相色譜圖Fig.3 Chromatograms of some commercial cosmetic products

3 結(jié)論

本研究在《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)的基礎(chǔ)上,分別就色譜柱種類、流動(dòng)相組成、樣品提取溶劑選擇等方面進(jìn)行了優(yōu)化,使用乙腈-異丙醇-50 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.05%(v/v)甲酸)梯度洗脫,可測定化妝水、乳液、膏霜、唇膏等化妝品中的22種防曬劑。與原方法比較,流動(dòng)相摒棄了四氫呋喃和高氯酸等高腐蝕性溶劑,增加了被測組分二苯酮-2。被測物穩(wěn)定性更好,實(shí)驗(yàn)操作更為便利高效。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本研究方法快速簡便、重現(xiàn)性和耐用性好,結(jié)果準(zhǔn)確可靠,兼顧綠色環(huán)保,有助于防曬類化妝品的質(zhì)量監(jiān)控。