毛雨曉, 鄭蒙蒙, 劉桂真, 安保禮, 康經(jīng)武*

(1.上海大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系,上海 200444;2.中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所,生命有機(jī)化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200032)

蛋白質(zhì)磷酸化是生命過(guò)程中調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活力和功能的最基本、最普遍、最重要的機(jī)制[1,2]。在生物體中只有大約1%～2%的蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生磷酸化修飾,在質(zhì)譜檢測(cè)中會(huì)受到大量非磷酸化肽段的干擾[3]。發(fā)展富集磷酸化肽段的技術(shù)是提高磷酸化蛋白分析的重要實(shí)驗(yàn)方法[4]。免疫沉淀法[5,6]、固定金屬親和色譜法[7,8]和金屬氧化物親和色譜法[9,10]是磷酸化蛋白分離和富集最為常見(jiàn)的方法。由于不同特性的納米復(fù)合材料能夠選擇性結(jié)合磷酸化多肽和磷酸化蛋白,因此納米復(fù)合材料常用于磷酸化蛋白的分離與鑒定[11,12]。將磷酸化蛋白的分離與富集技術(shù)和生物質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)合使用是分析磷酸化蛋白的常用技術(shù)。磁性納米粒子經(jīng)常用于富集磷酸化蛋白和磷酸化肽段[13-16]。

免疫印跡(Western Blot)是分子生物學(xué)和生物化學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法,其基本原理是將電泳分離后的細(xì)胞或組織總蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物硝酸纖維素膜或聚偏二氟乙烯膜上,然后用特異性抗體檢測(cè)某特定蛋白質(zhì)的檢測(cè)技術(shù)。采用免疫印跡分離和鑒定磷酸化蛋白時(shí),需要借助磷酸化抗體對(duì)磷酸化蛋白進(jìn)行特異性識(shí)別,且需使用二抗放大檢測(cè)信號(hào)[17]。但是,磷酸化抗體價(jià)格昂貴,難以保存,而且不同批次之間的重現(xiàn)性不好。因此,亟須發(fā)展一種制備過(guò)程簡(jiǎn)單、容易保存、成本低廉、對(duì)磷酸化蛋白具有特異性識(shí)別的納米發(fā)光材料代替磷酸化抗體。發(fā)光二氧化硅納米粒子常用于細(xì)胞成像分析[18-20],目前未發(fā)現(xiàn)將發(fā)光二氧化硅納米粒子用于測(cè)定磷酸化蛋白的文獻(xiàn)報(bào)道。

本工作合成了一種包覆異硫氰酸熒光素的發(fā)光二氧化硅納米粒子FITC@SiO2,并將其用于磷酸化蛋白的富集和熒光識(shí)別分析。將能夠富集和識(shí)別磷酸基團(tuán)的用于螯合金屬離子Ti4+的N,N-(雙羧甲基)-L-賴氨酸的連接臂通過(guò)共聚反應(yīng)鍵合到FITC@SiO2納米粒子表面上。修飾后的FITC@SiO2納米粒子可以直接富集和熒光識(shí)別磷酸化蛋白。FITC@SiO2納米粒子帶有熒光,標(biāo)記凝膠電泳條上的磷酸化蛋白條帶后,使用凝膠成像系統(tǒng)可以清楚地觀測(cè)到磷酸化蛋白被標(biāo)記后的熒光信號(hào)。這是首次將發(fā)光二氧化硅FITC@SiO2納米粒子與蛋白免疫印跡法結(jié)合,本實(shí)驗(yàn)方法可以大大降低磷酸化蛋白的檢測(cè)成本。發(fā)光二氧化硅FITC@SiO2納米粒子還具有較穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì),有望顯著提高磷酸化蛋白的檢測(cè)重現(xiàn)性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

熒光光譜儀(FLS1000,Edinburgh Instruments,英國(guó));Ultimate 3000 HPLC-LTQ XL質(zhì)譜聯(lián)用儀(賽默飛世爾,美國(guó))。Bio-Rad GelDoc EZ凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad,美國(guó))。

過(guò)硫酸銨(APS)、四乙氧基硅烷(TEOS)、熒光素異硫氰酸酯(FITC)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、硫酸鈦(Ti(SO4)2)、六水合氯化鐵(FeCl3·6H2O)、八水合氯氧化鋯(ZrOCl2·8H2O)、甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TEMED)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、Triton-X100、丙烯酰胺、三氟乙酸(TFA)和甲酸(HCOOH)購(gòu)自Fluka公司(美國(guó));正己醇和環(huán)己烷購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑有限公司;甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷(MPS)、3-(三羥丙基)甲基膦酸丙酯(THMPS)、預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、α-酪蛋白和胰蛋白酶購(gòu)自Sigma-Aldrich公司(美國(guó));戊烯酸、N-羥基琥珀酰亞胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)購(gòu)自上海安耐吉化學(xué)公司;氨水、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(CH2Cl2)、鹽酸(35%～37%,分析純)、碳酸氫鈉和4-二甲氨基吡啶(DMAP)購(gòu)自梯希愛(ài)(上海)公司;N,N-(雙羧甲基)-L-賴氨酸購(gòu)自畢得醫(yī)藥公司(上海);β-巰基乙醇購(gòu)自Amresco公司(美國(guó));牛血清白蛋白(BSA)、碳酸氫銨和氯化鈉均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)(北京);乙腈(ACN)和甲醇購(gòu)自Merck公司(德國(guó))。實(shí)驗(yàn)用水均經(jīng)過(guò)Millipore凈水器處理。

1.2 FITC@SiO2納米粒子的合成及其表面功能化修飾

FITC-APTES前驅(qū)體的合成:在避光條件下,向塑料瓶中依次加入10.5 mg FITC、2 mL無(wú)水乙醇和138 μL APTES,磁力攪拌,反應(yīng)12 h后得到FITC-APTES前驅(qū)體。使用反相微乳液法St?ber方法合成發(fā)光二氧化硅FITC@SiO2納米粒子[21]。將123.2 mL環(huán)己烷、25.6 mL正己醇和5.44 mL去離子水超聲混合,然后加入28.3 g Triton X-100,磁力攪拌15 min,形成澄清透明的微乳液體系。在10 min內(nèi)依次向微乳液中加入0.8 mL FITC-APTES前驅(qū)體、1.6 mL TEOS和0.96 mL濃氨水(25%～27%,質(zhì)量分?jǐn)?shù)),于24 ℃下攪拌24 h。反應(yīng)結(jié)束后,用200 mL無(wú)水乙醇破壞微乳液體系,離心分離,用無(wú)水乙醇超聲洗滌3次,得到發(fā)光二氧化硅FITC@SiO2納米粒子。

FITC@SiO2-MPS發(fā)光二氧化硅納米粒子的合成:在一個(gè)干燥的250 mL廣口瓶中,將FITC@SiO2納米粒子分散于100 mL干燥的無(wú)水乙醇中,超聲15 min,使FITC@SiO2納米粒子充分分散。在體系中加入1 mL MPS,于35 ℃油浴中反應(yīng)4 h。反應(yīng)完畢后,離心分離,用無(wú)水乙醇超聲洗滌3次,即得FITC@SiO2-MPS納米粒子。

功能單體2-(雙羧甲基氨基)-6-戊-4-烯酰氨基己酸(NTA)[22]的合成:在一個(gè)干凈的250 mL燒瓶中,加入4.5 gN-羥基琥珀酰亞胺,抽換氮?dú)?次后,加入150 mL二氯甲烷,攪拌均勻后,加入3 mL戊烯酸,待白色粒子分散,溶液呈澄清透明狀后,加入6.9 g EDC·HCl和4.0 g DMAP,室溫?cái)嚢?2 h,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后,產(chǎn)物進(jìn)行柱層析分離,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后得到白色晶體4-戊烯酸琥珀酰亞胺酯5.13 g,產(chǎn)率為86.9%。將一定量的4-戊烯酸琥珀酰亞胺酯溶于水中,制成質(zhì)量濃度為200 mg/mL的溶液,用NaHCO3調(diào)至pH 8后,取5 mL 4-戊烯酸琥珀酰亞胺酯的水溶液,加入2.5 g的N,N-雙羧甲基-L-賴氨酸,溶解后室溫?cái)嚢? h,產(chǎn)物進(jìn)行柱層析分離,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到1.53 g 2-(雙羧甲基氨基)-6-戊-4-烯酰氨基己酸,產(chǎn)率為88.9%。

帶有三羧酸基團(tuán)的FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA發(fā)光二氧化硅納米粒子的合成:在一個(gè)干凈的50 mL圓底燒瓶中,加入30 mg FITC@SiO2-MPS中間體、20 mL去離子水,超聲30 min分散,加入1 mL無(wú)水乙醇,超聲10 min,加入0.2 mL GMA、10 mg NTA功能單體。在氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌加熱。當(dāng)溫度升至80 ℃時(shí),用注射器慢慢加入0.1 mL新配的10%過(guò)硫酸銨水溶液,攪拌,反應(yīng)24 h,然后以8 300 r/min離心分離1 min,用乙醇超聲洗滌粒子3次,得到帶有三羧酸結(jié)構(gòu)的FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA納米粒子。合成的反應(yīng)流程如圖1所示。

圖 1 FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA-Ti4+發(fā)光二氧化硅納米粒子的合成流程示意圖Fig.1 Workflow schematic diagram for synthesis of luminescent FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA-Ti4+ nanoparticlesFITC:fluorescein isothiocyanate;MPS:methacryloxy propyltrimethoxysilane;GMA:glycidyl methacrylate;NTA:nitrilotriacetic acid.

分別配制100 mg/mL硫酸鈦、氯化鋯、氯化鐵水溶液,將0.10 g FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA納米粒子分別加入上述不同離子的水溶液中。在室溫下孵育1 h后,連接臂上的三羧酸基團(tuán)可以成功地螯合金屬離子。

將納米粒子離心分離,用超純水洗滌3次,除去未螯合的金屬離子,真空干燥后即可得螯合不同金屬離子的發(fā)光二氧化硅納米粒子(FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA-Zr4+、FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA-Zr4+、FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA-Fe3+),并于4 ℃保存,待用。

1.3 磷酸化肽段和磷酸化蛋白的預(yù)處理

FITC@SiO2-MPS-PGMA-NTA-Ti4+納米粒子用于磷酸化肽段的富集。分別稱取1 mg牛血清白蛋白、α-酪蛋白于Eppendorf管中,加入胰蛋白酶過(guò)夜酶解。同時(shí)配制緩沖液A(200 mmol/L NaCl水溶液(含有50%ACN和6% TFA)、緩沖液B(30%乙腈水溶液(含0.1% TFA))、緩沖液C(80%乙腈水溶液(含/6% TFA))、蛋白質(zhì)洗脫液(10%氨水溶液)。先用緩沖液A洗滌FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA-Ti4+粒子,洗滌3次后,將0.1 mg FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA-Ti4+粒子分散于1 mL緩沖液A中。將酶解后的蛋白質(zhì)溶液(1 mg/mL)與緩沖液C按體積比1∶1混合,孵育1 h。在FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA-Ti4+充分吸附肽段后,以10 000 r/min離心分離1 min,棄去上清液。用緩沖液A和B分別洗滌FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA-Ti4+粒子,以除去納米粒子上殘留的非磷酸化肽段。最后使用蛋白質(zhì)洗脫液洗脫FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA-Ti4+粒子上吸附的磷酸化肽段,收集洗脫液,冷凍干燥,溶于含2%乙腈和0.1%TFA的水溶液中,最后進(jìn)行HPLC-MS分析。

1.4 分析條件

色譜柱:Agilent ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫:25 ℃;流動(dòng)相A:水(含0.1%甲酸);流動(dòng)相B:乙腈;流速:1 mL/min。洗脫梯度程序:0～25 min,5%B～45%B;25～30 min,45%B～75%B;30～35 min,75%B;35～40 min,75%B～5%B;40～50 min,5%B。進(jìn)樣體積:10 μL。

HPLC與LTQ-Fleet離子阱質(zhì)譜聯(lián)用,在正離子模式下進(jìn)行所有質(zhì)譜信號(hào)的采集;噴霧電壓為4.0 kV;鞘氣流速為40 L/min;輔助氣流速為10 L/min;金屬毛細(xì)管溫度為320 ℃;歸一化的碰撞能量為35%;質(zhì)量掃描范圍為m/z300～2 000。

1.5 發(fā)光二氧化硅納米粒子標(biāo)記磷酸化蛋白

FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA-Ti4+納米粒子用于標(biāo)記磷酸化蛋白。配制0.1 mg/mL的α-酪蛋白和牛血清白蛋白樣品進(jìn)行免疫印跡電泳。電泳所用膠條由15%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))分離膠和5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))濃縮膠組成。每個(gè)泳道上樣15 μL,80 V電壓堆積10 min后加壓至110 V,約1 h后停止電泳。電泳完成后,在100 V電壓下將膠條上的蛋白條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,轉(zhuǎn)膜時(shí)間約為1 h。

稱取5.8 g Tris、2.9 g甘氨酸、0.37 g十二烷基硫酸鈉(SDS)和1 mL Tween-20,加入200 mL甲醇后定容至1 L容量瓶中,配制得到的溶液稱為T(mén)BST溶液。用TBST溶液洗去硝酸纖維素膜上的轉(zhuǎn)膜液,同時(shí)將硝酸纖維素膜浸泡在含有FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA-Ti4+納米粒子的TBST溶液(0.1 mg/mL)中,常溫下?lián)u蕩30 min，使蛋白質(zhì)與納米粒子充分結(jié)合。隨后使用TBST溶液浸泡硝酸纖維素膜,搖蕩30 min以去除膜上未能與磷酸化蛋白結(jié)合的FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA-Ti4+納米粒子。該過(guò)程重復(fù)3次。洗滌結(jié)束后,將硝酸纖維素膜置于Bio-Rad GelDoc EZ凝膠成像系統(tǒng)下掃描成像,得到經(jīng)FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA-Ti4+納米粒子染色后的磷酸化蛋白的熒光圖像。

2 結(jié)果與討論

2.1 FITC@SiO2納米粒子的制備和表征

通過(guò)反相微乳液體系合成的FITC@SiO2納米粒子具有光滑的球形外形。本文首先優(yōu)化了前驅(qū)體中FITC與APTES的物質(zhì)的量之比,制備了6種FITC@SiO2納米粒子。將FITC@SiO2納米粒子分別分散在無(wú)水乙醇中,配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的待測(cè)溶液,設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm,分別測(cè)定其發(fā)射光譜,最大發(fā)射波長(zhǎng)為526 nm。測(cè)定結(jié)果如圖2所示,隨著APTES含量逐漸升高,FITC@SiO2納米粒子的熒光強(qiáng)度也逐漸增強(qiáng),當(dāng)FITC:APTES物質(zhì)的量比例為1∶20時(shí),熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值。隨后再增加APTES的含量,FITC@SiO2納米粒子的熒光強(qiáng)度反而減小。因?yàn)楫?dāng)FITC的含量較多,而APTES不足時(shí),無(wú)法形成足夠的FITC-APTES前驅(qū)體。在TEOS的水解過(guò)程中,游離的FITC不能被包覆在SiO2納米粒子中。因此選用FITC∶APTES=1∶20(物質(zhì)的量)作為制備前驅(qū)體的比例。

圖 2 以不同前驅(qū)體(FITC和APTES)物質(zhì)的量之比合成的發(fā)光二氧化硅FITC@SiO2納米粒子的熒光發(fā)射光譜圖 Fig.2 Fluorescence emission spectra of FITC@SiO2 nanoparticles obtained from the precursor with the different amount of substance ratio of FITC and APTES APTES:3-aminopropyltriethoxysilane.

為了確認(rèn)聚合物膜是否包裹在FITC@SiO2納米粒子表面,我們對(duì)FITC@SiO2納米粒子進(jìn)行了元素分析。FITC@SiO2納米粒子的碳、氮含量均小于0.3%,氫含量為0.5%,經(jīng)過(guò)MPS修飾后的FITC@SiO2-MPS粒子的碳含量為0.76%,氮含量小于0.3%,氫含量為0.44%,說(shuō)明有少量的MPS修飾在FITC@SiO2納米粒子表面。與FITC@SiO2納米粒子相比,經(jīng)過(guò)表面共聚后現(xiàn)成的納米粒子FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA的碳、氮含量均大幅上升,碳含量為4.98%,氮含量為0.91%,結(jié)果說(shuō)明NTA基團(tuán)已經(jīng)與GMA共聚在納米粒子表面。

對(duì)FITC@SiO2、FITC@SiO2-MPS和FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA納米粒子分別進(jìn)行透射電鏡表征。圖3a和圖3b分別為FITC@SiO2和FITC@SiO2-MPS的TEM圖,通過(guò)反相微乳液體系合成的FITC@SiO2納米粒子具有光滑的球形外形,粒徑分布比較均勻,FITC@SiO2和FITC@SiO2-MPS的平均粒徑為60 nm。圖3c對(duì)應(yīng)的是FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA納米粒子的TEM圖,可以看出,FITC@SiO2-MPS粒子表面形成一層聚合物涂層GMA和NTA基團(tuán)后,對(duì)FITC@SiO2粒子的形貌影響很小,仍是表面光滑的球形粒子,FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA的整體粒徑?jīng)]有發(fā)生明顯的變化,直徑仍大約為60 nm。

圖 3 FITC@SiO2納米粒子的TEM照片F(xiàn)ig.3 TEM photos of the FITC@SiO2 nanoparticlesa.FITC@SiO2;b.FITC@SiO2-MPS;c.FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA.

將不同質(zhì)量濃度(10-5～1 mg/mL)的FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA納米粒子分散在水中,在365 nm紫外燈照射下,不同濃度的粒子均發(fā)出綠色熒光,熒光的強(qiáng)度由弱到強(qiáng)(見(jiàn)圖4)。各粒子的水分散性均較好,靜置1 d后均無(wú)明顯的沉降現(xiàn)象。

圖 4 不同濃度FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA在365 nm紫外燈照射下的熒光成像Fig.4 Fluorescence images of FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA with different concentrations under 365 nm UV lamp Contents of a-f were 1.0×10-5 ,1.0×10-4,1.0×10-3,1.0×10-2,0.1 and 1.0 mg/mL,respectively.

2.2 發(fā)光二氧化硅納米粒子對(duì)磷酸化肽段和磷酸化蛋白的特異性識(shí)別

實(shí)驗(yàn)選擇了3種金屬離子與發(fā)光二氧化硅納米粒子形成固定化金屬離子親和配體(FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA-Fe3+、FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA-Zr4+和FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA-Ti4+)，并分別富集α-酪蛋白酶解液中的磷酸化肽段,色譜分析結(jié)果見(jiàn)圖5。FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA-Ti4+可以從α-酪蛋白酶解液中富集到10條磷酸化肽段(見(jiàn)圖5a)。色譜圖中的非磷酸化肽段的信號(hào)峰很低,譜圖比較干凈,說(shuō)明FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA-Ti4+納米粒子能夠特異性地富集和識(shí)別磷酸化肽段。如圖5b所示,FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA-Zr4+納米粒子富集到7條磷酸化肽段,磷酸化肽段的色譜峰信號(hào)較強(qiáng),并且譜圖也較干凈,說(shuō)明FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA-Zr4+粒子的非特異性吸附較少,但是Zr4+作為識(shí)別基團(tuán)的納米粒子富集后譜圖的色譜峰信號(hào)強(qiáng)度約為T(mén)i4+的50%。如圖5c所示,FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA-Fe3+納米粒子從α-酪蛋白酶解液中富集到了4條磷酸化肽段,表明FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA-Fe3+納米粒子富集和識(shí)別磷酸化肽段的效果最差。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA-Ti4+納米粒子富集和識(shí)別磷酸化肽段的性能最好。表明用聚合物GMA包裹FITC@SiO2納米粒子以減少非特異性吸附肽段的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是成功的。

圖 5 不同納米粒子富集α-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)酶解液中的磷酸化肽段的色譜圖Fig.5 Chromatograms of phosphorylated peptides enriched by different nanoparticles in standard hydrolysate of α-casein a.FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA-Ti4+;b.FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA-Zr4+;c.FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA-Fe3+.* phosphorylated peptides.

將α-酪蛋白和BSA分別在2條電泳泳道內(nèi)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后,將得到的蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,用合成的FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA-Ti4+納米粒子對(duì)其進(jìn)行熒光染色。由圖6可以看出,α-酪蛋白被成功染色,在熒光燈照射下發(fā)出熒光,由于BSA中不含有磷酸化蛋白,BSA蛋白條帶的位置沒(méi)有檢測(cè)到熒光信號(hào)。而標(biāo)記蛋白條帶的100 kDa處也是磷酸化蛋白,也產(chǎn)生了熒光信號(hào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,合成的FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA-Ti4+納米粒子能夠特異性識(shí)別磷酸化蛋白,且不會(huì)與其他種類的蛋白質(zhì)發(fā)生非特異性吸附。合成的FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA-Ti4+納米粒子同時(shí)起到識(shí)別磷酸化蛋白和放大信號(hào)的作用,并且其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,易于保存。表明FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA-Ti4+納米粒子可以用于Western Blot實(shí)驗(yàn)中代替磷酸化抗體。

圖 6 經(jīng)過(guò)FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA-Ti4+標(biāo)記的α-酪蛋白免疫印跡電泳圖Fig.6 Electropherogram for Western Blot of α-casein after labelling with the nanoparticles of FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA-Ti4+

3 結(jié)論

本文成功合成了單分散球形的可以螯合金屬離子的發(fā)光二氧化硅納米粒子FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA-Ti4+,用以富集和識(shí)別磷酸化的蛋白質(zhì)。在Western Blot分析磷酸化蛋白時(shí),使用FITC@SiO2-MPS-GMA -NTA-Ti4+納米粒子可以特異性熒光標(biāo)記磷酸化蛋白,產(chǎn)生明亮的熒光條帶,而對(duì)非磷酸化蛋白不發(fā)生標(biāo)記作用。FITC@SiO2-MPS-GMA-NTA-Ti4+納米粒子與磷酸化蛋白的特異性好,熒光強(qiáng)度高,可以在室溫下保存較長(zhǎng)時(shí)間,因此可廣泛用于磷酸化蛋白的電泳成像。