溫翰榮, 朱 玨, 張 博

(廈門大學化學化工學院,福建 廈門 361005)

微型化已成為現(xiàn)代分析儀器發(fā)展的一個重要趨勢。微型化的分析系統(tǒng)可以有效地減少樣品和試劑的消耗,提高檢測效率,降低檢測成本。作為重要的分離分析手段,色譜儀器的微型化也是分離科學未來發(fā)展的重要趨勢。從色譜儀器的角度看,微型化可以帶來的優(yōu)勢包括[1-7]:(1)溶劑消耗量的大幅減少,理想狀態(tài)下相較于常規(guī)色譜系統(tǒng)可減少溶劑消耗近3個數(shù)量級;(2)樣品需求量下降,適合生物組學研究等無法獲得大量樣品的分析領(lǐng)域;(3)快速的分離分析;(4)有利于色譜裝置的模塊化、集成化設(shè)計。此外,在液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用中,由于電噴霧離子源(ESI)的離子化效率與前端色譜流速的倒數(shù)具有線性關(guān)系[8],色譜微型化帶來的低流速可以有效適配ESI-MS,適用于分析生物組學研究中常見的微量復雜樣品。

基于微流控芯片平臺的液相色譜被稱為芯片液相色譜。得益于微機電技術(shù)(MEMS)強大的微結(jié)構(gòu)加工能力,相較于另一類微型化色譜——毛細管液相色譜,芯片液相色譜具有更高的靈活度和可集成性,在微型化、模塊化、智能化、自動化等方面,芯片液相色譜具有更好的發(fā)展前景。目前,芯片液相色譜可以良好地實現(xiàn)常規(guī)液相色譜的富集、分離等功能[9-17],產(chǎn)業(yè)界也在芯片液相色譜商品化上取得一定成果。本文將著重介紹近年來芯片液相色譜技術(shù)在學術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界的最新進展,并展望芯片液相色譜技術(shù)未來的發(fā)展方向。

1 芯片色譜系統(tǒng)

芯片色譜系統(tǒng)的設(shè)計、加工、使用是一個復雜的系統(tǒng)工程。根據(jù)具體分離任務(wù)的需要,芯片基底材料的選擇、色譜固定相的選擇、芯片通道結(jié)構(gòu)的設(shè)計與制造、流體驅(qū)動方式以及芯片連接方式的選擇、檢測器的選擇與聯(lián)用、特殊色譜結(jié)構(gòu)或方法的聯(lián)用,各個要素相互影響、相互牽制,每一個要素都具有重要的作用。

1.1 芯片基底材料

芯片基底材料的選擇需要綜合考慮材料的特性(硬度、形變模量、化學惰性、吸光性質(zhì)、吸脫附性質(zhì)、生物兼容性等),并根據(jù)所擁有的加工手段以及分離分析的具體條件來決定。最早使用的芯片色譜基底材料是硅[18]。由于早期微流控芯片加工工藝大部分直接繼承自微機電加工技術(shù),硅自然成為工程師們最為熟悉的芯片材料。硅材料具有較高的硬度和良好的化學惰性,適用于絕大多數(shù)色譜方法,因此硅在早期芯片液相色譜領(lǐng)域內(nèi)有很多應用[19-21]。但是,硅在紫外以及可見光區(qū)無法透射,這導致在硅芯片上直接原位使用光學檢測較為困難。因此,人們常用玻璃或石英材料替換硅。玻璃以及石英具有出色的化學穩(wěn)定性、機械強度、優(yōu)良的生物兼容性和可衍生能力,同時還具有極高的透射率。Belder課題組在玻璃芯片上開展了系統(tǒng)性的工作[22-24]。他們設(shè)計了一整套標準化的玻璃芯片器件(見圖1a),這些芯片結(jié)合了液相色譜分離與ESI離子源,并配備了高壓不銹鋼夾具用于芯片與外部設(shè)備的連接。這種高壓不銹鋼夾具可以承受高達36 MPa的流體壓力,同時還可以實現(xiàn)極低死體積(約2～10 nL)的側(cè)向芯片連接。Mellors等[25,26]設(shè)計了一種毛細管電泳芯片并與ESI-MS聯(lián)用,他們將矩形芯片的一個角直接作為ESI噴口,證明了玻璃芯片可以直接作為ESI離子源的噴口。利用玻璃對高溫的耐受性,Heiland等[27]開發(fā)了具有溫度梯度洗脫功能的玻璃色譜芯片,并用于分離多環(huán)芳烴。這種溫度梯度芯片可在以4 ℃/s的溫度梯度升溫至200 ℃的梯度條件下工作。該課題組還利用玻璃材料優(yōu)良的穩(wěn)定性和機械強度,在同一套玻璃芯片的基礎(chǔ)上開發(fā)了芯片超臨界流體色譜(supercritical fluid chromatography,SFC)聯(lián)用雙光子激發(fā)(two-photon excitation,TPE)熒光光譜裝置[28]。這一裝置可在20 s內(nèi)完成色譜分離,且在20 mm/s的高流速下仍能得到高度對稱的色譜峰。

圖 1 芯片色譜基底材料Fig.1 Chip substrate materialsa.glass chip[24].b.copolymers of cycloolefin,COC polymer chip[36];b-A:capillary connection;b-B:PEEK connection.

與硅和玻璃材料相比,聚合物基底材料具有更良好的加工性能,是目前微流控芯片領(lǐng)域最常用的芯片基底材料?；诰酆衔锊牧?人們已發(fā)展了豐富的加工技術(shù),如激光燒灼技術(shù)[29,30]、軟光刻技術(shù)[31]、噴射造型技術(shù)[4]等。這些穩(wěn)定且成熟的物理加工手段使得聚合物芯片具有較高的批次間重現(xiàn)性。然而,聚合物芯片在化學穩(wěn)定性和機械強度方面,要普遍遜色于石英芯片和玻璃芯片。聚二甲基硅氧烷(PDMS)是目前應用最為廣泛的聚合物微流控芯片材料,PDMS具有優(yōu)良的透光率和生物兼容性。同時,PDMS還極為柔軟(彈性模量約為500～4 000 kPa),只需要施加一個大氣壓的壓力就可以引起PDMS一個維度上近10%的形變[32]。這使得PDMS相比玻璃芯片可以更容易地實現(xiàn)芯片與其他設(shè)備的連接,甚至可以在PDMS芯片通道內(nèi)直接加工泵閥結(jié)構(gòu)[33]。但PDMS的缺點亦十分明顯[4]:PDMS材料在常用的色譜流動相溶劑中易發(fā)生溶脹;其較強的吸附性質(zhì)和透氣性會導致較嚴重的色譜峰展寬;低彈性模量使得PDMS芯片無法承受高流體壓力,不適合高效液相色譜這類流體背壓較大的色譜方法。以上諸多問題使得PDMS材料在芯片色譜領(lǐng)域內(nèi)的應用受到較大限制。但PDMS作為極易加工和批量生產(chǎn)的芯片材料,在微流控領(lǐng)域常作為原型設(shè)計使用。熱塑性材料(thermoplastics)的高分子鏈結(jié)構(gòu)更加緊密,在加熱到玻璃化轉(zhuǎn)變溫度時熱塑性材料會由固態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂幸欢鲃有缘臓顟B(tài),其冷卻后會固定形態(tài)的性質(zhì)稱為熱塑性。熱塑性的芯片材料有[34]:聚碳酸酯(PC)、聚甲基丙烯酸酯(PMMA)、環(huán)烯烴共聚物(copolymers of cycloolefin,COC)等。相比于以PDMS為代表的彈性體(elastomer),熱塑性材料具有更高的機械強度(如PMMA彈性模量可達3.2 GPa[35])、更強的抗溶劑腐蝕性能和更優(yōu)良的可加工性。Wouters等[36]開發(fā)了基于COC的高效液相色譜芯片系統(tǒng)(見圖1b),他們利用微銑削技術(shù)直接在COC基底上銑出芯片通道,通過溶劑-真空輔助鍵合技術(shù)封裝芯片,配合特別設(shè)計的芯片接口制成在38 MPa壓力下可長時間運行的COC液相色譜芯片,并利用這一系統(tǒng)完成了烷基苯酮的快速分離。還有一些特殊的芯片基底材料,如鈦[37,38]、陶瓷[39]、鉆石[40]等,基于它們極高的機械強度、極強的耐腐蝕性能、極高的熱穩(wěn)定性等原因,也被嘗試應用于芯片色譜基底材料。但由于它們較為苛刻的加工和制造條件,目前這幾類芯片基底材料還沒有被大規(guī)模的應用。

1.2 芯片色譜柱

最早投入使用的芯片色譜柱結(jié)構(gòu)是開管柱(open-tube)[18,41]。開管柱床的制備是在色譜柱通道內(nèi)壁上修飾硅烷、凝膠、聚合物等作為固定相。開管柱因其中空的柱床結(jié)構(gòu)而具有最小的分離阻抗,開管柱床可以相對容易地在芯片孔道內(nèi)實現(xiàn)。但其中空的結(jié)構(gòu)也導致開管柱的柱床比表面積低,相比低,色譜柱容量小。提高開管柱柱容量的關(guān)鍵是提高固定相層的比表面積。Collins等[42]利用光引發(fā)聚合反應在毛細管上可控地生成聚合物開管柱床(見圖2a),所獲得柱床厚度的相對標準偏差在±0.8%,實現(xiàn)了高度可控的開管柱床制備。Yang等[43]在制備柱床時,將聚合物前體與商品化的色譜填料顆?；旌献⑷肟涛g好的柱管,之后用紫外光引發(fā)聚合反應。生成的聚合物層將填料顆粒包裹并固定在管壁上形成柱床。這些工作在一定程度上改善了開管柱的上樣量,但仍無法從根本上解決開管柱的柱容量問題。

填充柱床(packed bed)是將預先制備好的固定相填料顆粒通過流體帶動填裝進色譜柱管形成的色譜柱床。填充柱具有顯著優(yōu)于開管柱的比表面積。由于柱管內(nèi)充滿填料顆粒,填充柱流體背壓通?？梢赃_到5～40 MPa。得益于色譜固定相技術(shù)數(shù)十年間的發(fā)展,填充柱擁有種類和功能都十分豐富的色譜固定相庫可供選擇。在微流控芯片上制備填充床需要解決兩個問題:(1)如何將填充顆粒固定在芯片孔道內(nèi);(2)如何提高填料裝填的重現(xiàn)性。固定填料顆粒常用的方法是在微流控芯片通道內(nèi)構(gòu)建柱塞(frit)結(jié)構(gòu)。柱塞結(jié)構(gòu)可以通過微加工手段制得,也可以利用原位聚合反應制備聚合物柱塞。Thurmann等[44]利用激光輔助的光聚合手段在芯片通道中原位聚合生成一段約100 μm長的多孔聚合物整體柱塞。之后進行顆粒填料裝填形成色譜柱床,最后在柱床末端再聚合制備一段柱塞完成色譜柱床兩頭的固定。這種不到100 μm長的多孔聚合物整體柱塞能承受25 MPa的裝填壓力,可以很好地滿足芯片柱裝填和使用的承壓要求。Huft等[45,46]利用PDMS的柔性,設(shè)計了一種多層PDMS多柱液相色譜芯片,并應用于免疫球蛋白基因逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增產(chǎn)物的分離純化。這一芯片通過微閥擠壓芯片孔道形成局部錐形結(jié)構(gòu),利用基石效應(keystone effect)[47]將色譜填料固定在柱管內(nèi)。同時,他們還在芯片柱管壁上加工了大量微型旁路陣列,極大地減小了裝填時的阻力,可有效輔助填料在PDMS孔道內(nèi)的裝填。旁路陣列在進行色譜分離時會通過微波照射封閉,不影響正常的色譜分離。本課題組的單顆粒柱塞技術(shù)[48]也被運用到芯片填充柱的制備上。單顆粒柱塞是一種多孔的硅球顆粒,其顆粒尺寸略大于分離通道尺寸,此前常用于各類毛細管色譜柱的制備。使用時,只需將單顆粒直接塞入通道即可形成柱塞,使用方便可靠。Li等[49]將多孔的單顆粒柱塞安裝進入芯片通道內(nèi)用于固定填充柱床,制備好的芯片柱可在約34.4 MPa的高壓下工作。該芯片可在5 min內(nèi)完成3種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的分離,理論塔板數(shù)達到100 000塊/米。柱塞結(jié)構(gòu)并非固定柱床的唯一方法,另一種方法是基于納米微球顆粒自組裝形成填充柱床。Shaabani等[50]將甲基丙烯酸-2-羥基乙酯(HEMA)和二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)、光引發(fā)劑、致孔劑以及二氧化硅納米顆?；旌虾笞⑷隤DMS芯片的通道。通過光引發(fā)使HEMA和EDMA聚合,聚合過程中二氧化硅納米顆粒發(fā)生自組裝相互交聯(lián)形成膠體自組裝(colloidal self-assemble,CSA)柱床(見圖2b)。該芯片在7天時間內(nèi)進行28次蛋白質(zhì)分離實驗,蛋白質(zhì)的洗脫時間相對標準偏差小于0.83%,芯片分離能力穩(wěn)定。同一蛋白質(zhì)片段在不同芯片(3片芯片)間洗脫時間的相對標準偏差為4.3%,芯片間也有較好的重現(xiàn)性。納米填料顆粒自組裝形成的柱床具有較高的重現(xiàn)性,且對裝柱技術(shù)要求較低。但由于納米顆粒粒徑極小,導致柱背壓極大,因此除了電色譜方法外,其他液相色譜方法難以在納米顆粒自組裝柱床上使用。

整體柱床(monolithic bed)是一種通過聚合反應在色譜柱管內(nèi)原位合成的固定相結(jié)構(gòu)。相比于填充柱[51],整體柱的流阻較小,且不需要柱塞結(jié)構(gòu)來固定柱床。相比于開管柱,整體柱具有更高的比表面積和柱容量。其原位聚合的模式也使整體柱在芯片色譜領(lǐng)域的應用備受關(guān)注。整體柱床主要的缺陷是[2]:(1)聚合反應可控性較差,柱間重現(xiàn)性較難保證;(2)聚合反應的化學環(huán)境對芯片材料的選擇有限制;(3)在聚合反應前后,整體柱床的尺寸常發(fā)生一定“縮水”,容易導致柱床脫落。Kendall等[52]開發(fā)了一種非原位的整體柱床制備方法。他們首先在一個芯片模具中制備整體柱床,之后拆開模具芯片并取出柱床。在對柱床做衍生化處理后,再將其放入一個通道尺寸縮小10%的芯片,最后封閉芯片完成制備。這種制備方式雖然失去了整體柱原位聚合的優(yōu)點,但換來的是尺寸更加可控的整體柱床制備。在解決柱床收縮問題的同時,還可以實現(xiàn)不同功能化的柱床聯(lián)用,實現(xiàn)多維分離。除了常見的有機聚合物整體柱床,無機材料也被應用于芯片整體柱的制備:Zhai等[53]開發(fā)了一種基于氧化石墨烯硅烷聚合物的分子印跡整體材料芯片色譜柱(見圖2c),并用于分離富集辣椒粉中的羅丹明B。他們將氧化石墨烯(GO)與3-氨丙基三乙氧基硅烷耦聯(lián)生成氧化石墨烯硅烷(GO/SiO2),之后通過交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)與GO/SiO2反應生成整體柱床。該芯片色譜柱對羅丹明B富集因子可達110,檢出限為0.40 ng/g。

柱陣列柱床(pillar array bed)是芯片色譜獨有的柱床結(jié)構(gòu)。柱陣列柱床的原型是一種被稱為COMOSS(collocated monolithic support structure)的微流控芯片結(jié)構(gòu)[54,55]。這種結(jié)構(gòu)由大量規(guī)則排列的微柱組成,通常是通過光刻結(jié)合深反應離子刻蝕(DRIE)技術(shù)加工制成?；谖锢砑庸な侄蔚闹圃旆椒ㄊ沟弥嚵兄簿哂袠O高的重現(xiàn)性,并且可以批量復制。單純的COMOSS結(jié)構(gòu)比表面積較低,樣品載量低,作為色譜柱床使用需要對微柱陣列進行額外的修飾。Lincoln等[56]研究了在柱陣列表面修飾多孔層的厚度對柱效以及保留時間的影響。多孔層厚度的增加對理論塔板數(shù)的提升較小,但保留性能會有明顯的增加。同時,極大提高的比表面積也對柱陣列柱床的載樣能力有顯著提升。Desmet課題組對柱陣列色譜(pillar array chromatography,PAC)技術(shù)的成熟完善以及應用做了較為系統(tǒng)的工作[57-60](見圖2d),包括:柱陣列色譜柱的制備、流體動力學模型、柱陣列多孔層研究、柱陣列長柱制備等方面。尤其在柱陣列芯片色譜長柱制備上,Desmet課題組做出了系統(tǒng)性的工作。Baca等[61]利用串聯(lián)4張柱長為2 m的柱陣列色譜芯片得到的8 m長的柱陣列色譜柱分離小分子混合物,在2 050 min的梯度時間內(nèi)得到了1 815的峰容量。由于柱陣列的結(jié)構(gòu)特點,相比于8 m的柱長,該串聯(lián)芯片組可以在較低的流體壓力(25 MPa)下以0.60 mm/s的線速度完成分離。

圖 2 芯片色譜柱床電子顯微鏡照片F(xiàn)ig.2 Electron microscopy pictures of chromatography chip column bedsa.open-tube bed[42];b.colloidal self-assemble bed[50];c.monolithic bed[53];d.pillar array bed[60].

1.3 流體控制

芯片色譜是以微流控芯片作為載體的色譜系統(tǒng),其核心-微流控芯片的關(guān)鍵功能就在于流體控制。高效的微流體控制是芯片色譜正常工作的基礎(chǔ)。進樣是色譜分析極為重要的一個步驟。進樣量過大會導致進樣時間過長、色譜柱過載、峰展寬等問題,嚴重影響色譜分離的效率。目前與高效液相色譜配套的進樣針的規(guī)格普遍在微升級別,而芯片色譜平臺需要控制納升級別的進樣量。因此,開發(fā)與芯片色譜相匹配的進樣系統(tǒng)顯得十分重要。芯片色譜進樣技術(shù)大致可分為電動進樣與壓力進樣兩類。其中,電動進樣無需泵閥結(jié)構(gòu)、操作簡單的特點使其成為最早投入使用的方法(T型和雙T型電動進樣通道)[62,63],同時也是目前最常用的芯片色譜進樣模式。Cong等[64]開發(fā)了一種電動閥門式的芯片色譜進樣結(jié)構(gòu)(見圖3a)。這種結(jié)構(gòu)中有一個電驅(qū)動的可變型閥門,閥門兩側(cè)分別是進樣通道和色譜柱。在準備階段,在樣品通道與色譜通道兩端施加電壓,樣品先進入樣品通道,并由于閥門阻擋無法進入色譜柱。在進樣階段,閥門脈沖開關(guān)打開,樣品定量進入色譜通道,之后閥門關(guān)閉并開始色譜分離。電動進樣由于擴散、遷移率等問題[65],通常進樣誤差很大,很難做到定量進樣。相對的,基于機械手段推動樣品的壓力進樣方式可以實現(xiàn)高精度的定量進樣。但由于需要對流體額外施加壓力,壓力進樣需要更多泵閥結(jié)構(gòu)提供支持(如Agilent HPLC-chip的3層六通閥結(jié)構(gòu)[66])。壓力進樣也可以通過分流的操作方式擺脫泵閥結(jié)構(gòu),從而實現(xiàn)簡單的定量進樣。Gáspár等[67]在PDMS芯片上設(shè)計了一種分流進樣結(jié)構(gòu),由進樣口注入分流區(qū)的樣品(微升級)會依據(jù)分流結(jié)構(gòu)各通道的寬度比進行分流。通過控制進入色譜柱的通道與其他分流通道的比例就可以將進樣量精確地控制在納升級。但需要指出,分流式壓力進樣需要較大的樣品量,且不可避免地會造成樣品浪費。Ha等[68]開發(fā)了一種特殊的“穿刺”進樣方法,他們直接將微升級的進樣針扎入PDMS芯片的通道中,之后用千分尺調(diào)節(jié)進樣針筒活塞位置實現(xiàn)“穿刺進樣”。由于千分尺精確的距離調(diào)節(jié),這種進樣方式可實現(xiàn)3 nL體積的精準可重復進樣,且非常廉價、使用簡單。

圖 3 芯片色譜流體控制措施Fig.3 Chip fluid control methodsa.electronic microvalve injection[64];a-A:before loading;a-B:sample loading;a-C:sample injection;a-D:sample separation.b.chip droplet microfluidics[75].

芯片色譜泵可簡單分為芯片外置泵和芯片內(nèi)置泵。早期芯片色譜泵直接沿用高效液相色譜設(shè)備使用的常規(guī)高壓泵。但由于芯片通道尺寸減小,這些常規(guī)泵在進行梯度分離時會發(fā)生嚴重的梯度滯后現(xiàn)象。因此,常規(guī)泵需要加入分流裝置來調(diào)整流速,以適應芯片色譜的工作條件[69,70]。但分流在梯度分離中會造成嚴重的溶劑浪費[71],因此芯片色譜需要與其匹配的低流速高壓泵系統(tǒng)。在芯片外置泵中,能夠同時實現(xiàn)低流速和高壓力的最簡單的泵類型就是注射泵。Grinias等[72]通過閥門切換梯度儲存流路與UPLC泵和氣動放大泵的連接實現(xiàn)了一種高壓注射泵結(jié)構(gòu)。在準備階段,常規(guī)UPLC泵與梯度儲存流路相連,配制好的流動相被注入梯度儲存流路并保存在其中。在色譜分離階段,切換閥門使裝載有流動相的梯度儲存流路與色譜柱相連,啟動與梯度儲存流路相連的氣動泵,使儲存的流動相以一個較高的壓力注入色譜柱中完成分離。這一泵結(jié)構(gòu)可以達到300 MPa的運行壓力。芯片內(nèi)置泵的驅(qū)動方式以電驅(qū)動、電滲流和磁驅(qū)動為主,雖然也存在芯片內(nèi)置機械泵,但蠕動泵、氣動泵結(jié)構(gòu)在芯片上的加工難度較高,應用實例很少。最具代表性的芯片內(nèi)置泵是電滲泵(electroosmotic pumps,EOP)。EOP有如下幾點優(yōu)勢[73]:(1)可直接集成到微流控芯片上;(2)可生成無脈沖液流;(3)可快速改變液流大小和方向;(4)沒有運動組件,可有效提高泵的穩(wěn)定性和壽命;(5)在較大的背壓范圍內(nèi)都可產(chǎn)生中低流速液流。Wang等[74]開發(fā)了一種高壓EOP芯片,該芯片泵的工作壓力約17 MPa,工作流速約為500 nL/min,該條件已足以支持芯片液相色譜的運行。該芯片由大量EOP基本單元組成,每個EOP基本單元由數(shù)個電滲通道并聯(lián)而成。每個基本單元再與其他單元串聯(lián)成整個EOP芯片,芯片泵可產(chǎn)生的液流壓力直接正比于芯片內(nèi)含的EOP基本單元數(shù)量。

液滴技術(shù)作為一種新型的微流體控制技術(shù)也被應用到了芯片色譜上。Gerhardt等[75]將液滴微流控技術(shù)與HPLC芯片無縫組合(見圖3b),在HPLC芯片色譜柱出口處耦合T型液滴生成通道。利用與色譜通道正交的油相切割水相色譜洗脫物,將洗脫物以45 Hz的頻率切割為大量體積約1 nL的液滴。靜態(tài)液滴內(nèi)流體為層流狀態(tài),具有低擴散、無返混的特點。因此將色譜洗脫物切割為液滴的過程,相當于將色譜分離的色譜圖譜切割成大量片段并進行保存,防止洗脫物返混合污染,最大限度地保留了分離分辨率。這一利用液滴保存色譜結(jié)果的技術(shù)也為洗脫物在柱后進一步的處理與分析提供了時間和空間條件。

1.4 檢測器

相較于常規(guī)色譜,芯片色譜需要更加靈敏、響應更快的檢測器。芯片色譜常用的檢測器可分為光學檢測器、電化學檢測器、質(zhì)譜檢測器3類。紫外-可見光譜法是分析化學中應用最為廣泛的光學檢測手段,其簡單的結(jié)構(gòu)使其在芯片色譜中有著廣泛的應用。但芯片通道尺寸相較常規(guī)色譜柱徑的大幅度縮小,使得芯片色譜通道的光程大幅縮小。這極大影響了紫外-可見光譜在芯片色譜上原位檢測的靈敏度[2,4](尤其是當通道寬度小于100 μm時)。因此,在芯片色譜上進行紫外-可見光譜檢測需要通過增大通道寬度或添加微結(jié)構(gòu)(如光纖[76]、波導管[77])等手段來增加光程,以提高檢測靈敏度。相比之下,熒光光譜的發(fā)射光強度與激發(fā)光強度成正相關(guān),在使用激光這樣的強光源作為激發(fā)光源時(激光誘導熒光光譜,LIF),光程的減小對熒光光譜檢測靈敏度的影響幾乎可以忽略[78]。熒光光譜主要局限于可自發(fā)熒光的物種有限,目前需要借助熒光標記和熒光染料才能做到廣泛應用。TPE熒光光譜利用兩個光子同時激發(fā)一個分子,可使分子達到更高的能級,從而讓一些原本不會發(fā)出熒光的分子產(chǎn)生熒光信號,該技術(shù)有望實現(xiàn)無標記的廣泛熒光檢測。Hackl等[79]將電色譜芯片與TPE熒光光譜聯(lián)用(見圖4a),實現(xiàn)了芯片色譜平臺上的無標記時間分辨熒光光譜檢測。該芯片對多環(huán)芳烴的檢測靈敏度達到了nmol級。他們同時還證明了532 nm的TPE熒光光譜可以達到與266 nm單光子激發(fā)(one-photon excitation,OPE)熒光光譜相近的靈敏度。這意味著雙光子激發(fā)熒光光譜可在聚合物芯片等具有一定紫外吸收能力、但更容易制作的芯片平臺上使用,而無標記單光子激發(fā)熒光光譜則需要使用石英等低紫外吸收的芯片材料來保證檢測靈敏度。除了紫外-可見光譜、熒光光譜外,拉曼光譜(相干反斯托克拉曼散射(coherent anti-Stokes Raman scattering,CASR[80])、表面增強拉曼光譜(surface-enhanced raman spectroscopy,SERS[81]))也被嘗試應用于芯片色譜檢測器,并表現(xiàn)出可期的前景。

電化學檢測器是通過檢測電極表面電化學反應產(chǎn)生的電信號(電流、電壓)來進行分析檢測的手段。用于電化學檢測的電極可以很容易地進行微型化,并集成到微流控芯片平臺上。而且,電化學檢測的工作站已經(jīng)可以做到小型化便攜式,因此電化學檢測方法也被視為實現(xiàn)便攜式芯片色譜的重要手段[82,83]。電化學檢測方法在芯片色譜中的應用有一個限制因素:電極的使用壽命有限,需要經(jīng)常更換;常見的微流控芯片在封裝后就無法再拆開,因此電極損壞后檢測芯片就只能報廢處理。Erkal等[84]為解決這一問題,開發(fā)了一種3D打印的電化學檢測芯片。這種芯片在電極位置加工了螺紋結(jié)構(gòu)用于可替換電極的固定;同時螺紋結(jié)構(gòu)還滿足了芯片的密封需求,使得芯片多次更換電極也不會漏液。相比于常規(guī)電導、電勢檢測需要的電極與溶液直接接觸,電容耦合非接觸電導檢測(capacitively coupled contactless conductivity detection,C4D)不需要與待測溶液直接接觸,且電導檢測靈敏度極高,其作為微流控芯片檢測器更具潛力[85,86]。Beutner等[87]設(shè)計了一種C4D與質(zhì)譜聯(lián)用的檢測方法,用于毛細管電泳分析檢測酚類物質(zhì)。他們發(fā)現(xiàn)這兩種檢測方法具有較好的互補性:C4D檢測器對間甲酚具有極佳的靈敏度而對硝基酚敏感性不佳,而質(zhì)譜檢測器則正好相反。

質(zhì)譜法是基于不同質(zhì)荷比的離子在電場加速后進入磁場中運動軌跡的不同,或在真空中飛行時間的不同,進行物質(zhì)鑒定的檢測方法。質(zhì)譜法的質(zhì)量分辨本領(lǐng)使其具有極高的靈敏度和分辨率,以及超快的分析速度,同時還能提供豐富的分析信息。相比于光學檢測器和電化學檢測器,質(zhì)譜檢測器顯然是三者之中結(jié)構(gòu)最為復雜,成本最為昂貴的檢測器。但由于質(zhì)譜法極高的靈敏度、微型化色譜與質(zhì)譜極好的相容性以及質(zhì)譜在組學研究中的重要地位,芯片色譜與質(zhì)譜的聯(lián)用仍然是前沿的研究方向[88]。芯片色譜與質(zhì)譜聯(lián)用需要解決色譜出口與質(zhì)譜離子源之間的耦合問題。目前常用的芯片色譜-質(zhì)譜聯(lián)用離子源是ESI和基質(zhì)輔助激光解吸電離離子源(matrix-assisted laser desorption/ionization,MALDI)。ESI離子源因其廣泛的應用性和高靈敏度而成為與芯片色譜耦合最理想的離子源。Lotter等[23]對玻璃芯片的ESI噴口進行了較為系統(tǒng)的探究。他們研究了4類ESI噴口形狀對質(zhì)譜檢測效果的影響(見圖4b),發(fā)現(xiàn)在高流速(約400 nL/min)條件下4種芯片噴口沒有明顯的區(qū)別。但是在低流速(<50 nL/min)條件下,尖銳的ESI噴口(pulled和ground型)產(chǎn)生的電噴霧更加穩(wěn)定,離子化效果更好。加工芯片ESI噴口需要較為精密的加工技術(shù),一種更為簡單的噴口構(gòu)建方法是在芯片柱上嵌入一段拉尖毛細管作為ESI噴口。Dietze等[89]在制作聚合物芯片時,在通道中嵌入一段一端燒蝕拉尖的毛細管,成功與ESI源耦合。這種利用毛細管針尖制作噴口的方法特別適合于聚合物這類無法直接作為ESI噴嘴的芯片基底材料。MALDI離子源應用于微流控芯片上,可分為在線離子源[90]和離線離子源[91]兩類。人們已報道了數(shù)類微流控MALDI芯片[92],但帶有色譜分離功能的芯片色譜-MALDI-MS較少。Lazar等[93]開發(fā)了一種新型的液相色譜-MALDI-MS芯片(見圖4c),該芯片以C18顆粒填料作為色譜固定相,在色譜柱通道的正交方向制作了大量與色譜柱通道相通的MALDI收集通道。在進樣并完成色譜分離后,洗脫物不再由色譜柱軸向洗脫,而是通過與MALDI收集通道相連的電滲泵結(jié)構(gòu)橫向泵入MALDI儲液槽中,直接進行MALDI-MS檢測。由于MALDI收集通道被集成在色譜柱通道側(cè)向,進行洗脫物收集時相當于對色譜圖進行了切割和分段檢測,這使得該系統(tǒng)可以獲得優(yōu)良的分辨率和檢測通量。

圖 4 部分芯片色譜檢測器Fig.4 Some example of the detector in chip chromatographya.LC-TPE chip[79];b.glass chip ESI emitter design[23];c.LC-MALDI-MS chip[93].

2 芯片色譜的商品化

2005年,Yin等[94]報道了安捷倫(Agilent)公司HPLC-Chip/MS系統(tǒng)的原型,標志著芯片色譜的發(fā)展正式進入商品化階段。商品化的芯片色譜系統(tǒng)需要做到堅實耐用、高強健性以及不遜色于常規(guī)色譜系統(tǒng)的分離能力。為了做到使用方便簡單,商品化芯片色譜系統(tǒng)通常還需要完備的配套系統(tǒng),包括精密的芯片-外設(shè)連接、穩(wěn)定的流體驅(qū)動、靈敏的檢測器等。本部分將簡要介紹4家公司的芯片色譜產(chǎn)品以及這些產(chǎn)品的實際應用情況。

2.1 安捷倫

Agilent HPLC-Chip/MS系統(tǒng)是安捷倫公司的經(jīng)典芯片色譜產(chǎn)品,也是最早投入實際應用的芯片色譜系統(tǒng)。該色譜芯片由激光燒灼的聚酰亞胺作為基底材料制成,包含多層結(jié)構(gòu)。芯片內(nèi)含:富集柱(40/80 nL,填充5 μm Zorbax 300SB C18填料)、分析柱(75 μm×150 mm,填充5 μm Zorbax 300SB C18填料)、ESI噴口、多層六通閥進樣系統(tǒng),芯片結(jié)構(gòu)和填料可在一定程度上定制。芯片配套Chip-Cube系統(tǒng)實現(xiàn)芯片與各外部設(shè)備的標準管路連接。Chip-Cube系統(tǒng)的轉(zhuǎn)子可切換芯片六通閥的連接狀態(tài)實現(xiàn)進樣、樣品富集、樣品分離等操作。該芯片系統(tǒng)的應用主要集中在蛋白質(zhì)定量[94,95]、糖蛋白分析[96]、蛋白質(zhì)磷酸化分析[97]、藥用小分子分離[98]等領(lǐng)域。Bishop等[99]報道了安捷倫HPLC-Chip/MS系統(tǒng)適配電感耦合等離子體(ICP)離子源的改良版本,新系統(tǒng)去除了原本的ESI噴口,而通過Chip-Cube將分析柱通向特制的氣動噴霧器來聯(lián)用ICP-MS。該系統(tǒng)被用于分離檢測馬血漿中的維生素B12,7次平行試驗中,維生素B12保留時間的相對標準偏差為0.19%,檢出限為14 ng/mL。

2.2 Sciex-Eksigent

cHiPLC系統(tǒng)是Eksigent公司開發(fā)的芯片色譜系統(tǒng)。Sciex公司收購Eksigent公司液相色譜產(chǎn)品線后,cHiPLC系統(tǒng)仍被冠名為Eksigent-cHiPLC。cHiPLC系統(tǒng)可同時操作3張石英液相色譜芯片,每張芯片都可以具有不同的功能(富集、分離等)且可以相互串聯(lián),這使得cHiPLC芯片間的組合可實現(xiàn)多種色譜工作模式。cHiPLC分析柱有兩種規(guī)格:nano-cHiPLC(75 μm×150 mm)和micro-cHiPLC(200 μm×150 mm)。芯片柱使用圓形截面通道,圍堰固定填充柱床,以及數(shù)種可選擇的固定相填料。其芯片結(jié)構(gòu)可支持高壓流體運行,且連接死體積極小(約13 nL)。cHiPLC系統(tǒng)的雙分析柱模式可以實現(xiàn)兩張芯片色譜的交替分離,一張芯片色譜在進行分離的同時可以對另一張芯片進行沖洗,這種工作模式可以減少色譜柱的準備時間,提高分析效率。cHiPLC系統(tǒng)主要的應用領(lǐng)域有:蛋白質(zhì)組學[100,101]、糖肽分析[102]、酶活性測試[103]等。

2.3 沃特世(Waters)

沃特世目前有兩款芯片色譜產(chǎn)品:ionKey/MS系統(tǒng)和TRIZAIC nanotile,兩種色譜芯片所使用的的基底材料均為陶瓷材料。ionKey/MS芯片為150 μm內(nèi)徑填充柱(填充沃特世亞2 μm填料,UPLC分離)液相色譜芯片。該芯片通過沃特世的iKey結(jié)構(gòu)實現(xiàn)與外部設(shè)備的連接。該結(jié)構(gòu)完全取代傳統(tǒng)的色譜接口,可以實現(xiàn)“即插即用(plug and play)”,最大限度地消除了操作人員的技術(shù)水平差異。該芯片柱還可以配備柱后添加通道(pass column adding,PCA),對色譜分離物添加特定試劑,輔助后續(xù)分析操作。ionKey/MS系統(tǒng)主要應用于蛋白質(zhì)組學研究[104,105]。TRIZAIC nanotile芯片可作為富集芯片(180 μm×20 mm,填充5 μm C18填料)或分析芯片(180 μm×100 mm,填充1.8 μm HSS T3填料顆粒)使用,主要的應用有類固醇分析[106]和人血清多肽定量分析[107]。

2.4 PharmaFluidics

PharmaFluidics是芯片色譜領(lǐng)域一家年輕的公司,成立于2010年,其在2017年推出μPAC柱陣列色譜芯片系列。目前有兩種芯片規(guī)格:200 cm μPAC芯片和50 cm μPAC芯片。μPAC芯片采用Si-Pyrex glass基底材料,固定相采用5 μm直徑的圓柱柱陣列柱床(柱間距2.5 μm)。柱陣列柱床結(jié)構(gòu)使200 cm μPAC芯片可以在1.5 μL/min的高流動相流速下以35 MPa的壓力運行。柱陣列柱床也使該芯片產(chǎn)品具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。μPAC芯片沒有配套外設(shè)系統(tǒng),芯片通道通過環(huán)氧膠粘劑連接標準石英毛細管。芯片可通過毛細管與任何帶有標準色譜PEEK接頭的設(shè)備進行連接,這在一定程度上增加了μPAC芯片的使用難度,但也提高了該芯片設(shè)備搭建的自由度,使其更適合科研實驗室使用。作為較新的芯片色譜產(chǎn)品,μPAC芯片目前應用實例較少。Mann課題組[108]將其用于蛋白質(zhì)組學研究,基于μPAC芯片搭建的LC-MS/MS平臺鑒定了340 000個蛋白質(zhì),將此前蛋白組學嚴格分辨的蛋白質(zhì)數(shù)量翻倍,為蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)庫的豐富做出了卓越貢獻。

3 總結(jié)與展望

從歷史上第一個芯片色譜裝置誕生至今已近30年,但芯片色譜技術(shù)仍基本停留在基礎(chǔ)研究和科研實驗室里。相較于最初的期待,芯片色譜走向產(chǎn)業(yè)化的推進速度顯得些許緩慢。目前存在的主要瓶頸在于:芯片色譜技術(shù)對微型化、集成化的需求與芯片材料、工藝和設(shè)計發(fā)展現(xiàn)狀的矛盾。微流控芯片微型化、集成化主要通過縮小通道尺寸和增加通道總長度實現(xiàn)。對微納尺度流體,通道尺寸的縮小和長度的增加都會大幅增加流體阻力?，F(xiàn)有的芯片基底材料承壓能力普遍在60 MPa以下,材料性質(zhì)限制了色譜芯片微型化和集成化的進一步提升。這一瓶頸的解決在于發(fā)展新型的芯片基底材料,尤其是高強度和優(yōu)良加工性的聚合物材料;同時也需要產(chǎn)業(yè)界形成相對統(tǒng)一標準的流體通道基本結(jié)構(gòu)設(shè)計,以提高材料性能的利用度。此外,與芯片色譜匹配的外部設(shè)備微型化程度低,芯片接口技術(shù)尚不成熟,以及芯片色譜產(chǎn)業(yè)缺乏統(tǒng)一行業(yè)標準等,都有待學術(shù)界與產(chǎn)業(yè)界共同努力解決。但客觀地看,色譜微型化的趨勢已經(jīng)十分明顯:毛細管色譜的產(chǎn)業(yè)化、微流甚至納流色譜的推廣及其在生物醫(yī)學分析中應用已日漸增多。作為色譜微型化另一途徑的芯片色譜,正式走向?qū)嶋H應用只是時間問題。芯片液相色譜極高的可擴展性、可集成性以及模塊化的優(yōu)勢使其最有可能成為色譜這項技術(shù)走入便攜檢測(POCT)領(lǐng)域的方式,但這一理想還有待進一步提高芯片集成度和系統(tǒng)微型化程度才能真正實現(xiàn)。相信在不久的將來,“plug-and-play”的芯片色譜將成為現(xiàn)實。