閆 梅，馬 倩，馬雅玲,，劉 媛，馬立萍

0引言

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration,ARMD)是一種影響視網(wǎng)膜黃斑區(qū)，導(dǎo)致中央視力逐漸喪失的疾病，多發(fā)生于60歲以上的人群中，是造成視覺損害的主要原因之一[1-2]。我國現(xiàn)已步入老齡化社會，人口老齡化呈指數(shù)增長，其患病率將進(jìn)一步上升。研究發(fā)現(xiàn)，ARMD的發(fā)病機(jī)制涉及氧化應(yīng)激、光損傷、炎癥、遺傳基因等方面[3-5]。其中，視網(wǎng)膜色素上皮(retina pigment epithelium,RPE)的炎性損傷是重要環(huán)節(jié)[1,3]。RPE具有維持視網(wǎng)膜感光細(xì)胞層的功能，可保護(hù)視網(wǎng)膜免受過度光照，并參與形成血-視網(wǎng)膜屏障及視網(wǎng)膜中央黃斑的免疫防御等[4-5]。研究表明，各種刺激形成的RPE炎性損傷能夠促進(jìn)新生血管生成，加速病情進(jìn)展為滲出性ARMD[3-6]。所以，抑制RPE細(xì)胞內(nèi)炎性損傷，同時預(yù)防RPE的丟失，是開發(fā)治療ARMD新方案的關(guān)鍵。研究證實，枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharide,LBP)具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗衰老等作用[7-9]。本課題組既往研究也表明枸杞多糖對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜具有保護(hù)作用，對氧化應(yīng)激造成視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡具有抑制作用[10-11]，但是，枸杞多糖對RPE炎性反應(yīng)的影響尚不明確。所以，本實驗通過細(xì)菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激人視網(wǎng)膜色素上皮(ARPE-19)細(xì)胞構(gòu)建ARMD的體外炎癥反應(yīng)模型，探索枸杞多糖對RPE炎性反應(yīng)的影響及機(jī)制，為治療滲出性ARMD及RPE炎癥相關(guān)疾病提供新思路。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1主要試劑ARPE-19細(xì)胞株(中科院上海細(xì)胞庫)、枸杞多糖(寧夏沃福百瑞)、LPS(美國Sigma)、胎牛血清(美國Gibco)、DMEM-F12培養(yǎng)基(美國Hyclone)、0.25%胰蛋白酶+EDTA(索萊寶)、青-鏈霉素混合液(100×)(索萊寶)、RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen)、SYBR Green qPCR Master Mix(DBI Bioscience)、總RNA提取試劑盒(北京天根)、引物(上海生工)、CCK-8細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒(上海貝博)、全蛋白提取試劑盒(凱基生物)、BCA蛋白定量試劑盒(凱基生物)、ECL高敏檢測試劑盒(凱基生物)。一抗：p-IκBα、IκBα、p-ERK、p-p38及p-JNK(Affinity，CAT：5002、2002、1015、4001、3318)，p-p65、p65(CST，CAT：3033、8242)，ERK、p38及JNK(萬類生物，CAT：01864、00764、01295)，β-Actin(中杉金橋，CAT：TA-09)。

1.1.2儀器Infinite M200 Pro酶標(biāo)儀(瑞士TECAN)、PowerPac 200電泳儀(美國Bio-Rad)、IQ5 Real-Time PCR儀(美國Bio-Rad)、ChemiDoc Touch化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad)。

然而,企業(yè)減排導(dǎo)致生產(chǎn)成本增加,成本增加導(dǎo)致國際競爭力下降,國際競爭力下降導(dǎo)致國內(nèi)經(jīng)濟(jì)現(xiàn)代化受阻。不減排,國際輿論壓力大,綠色貿(mào)易壁壘愈演愈烈,在國際分工中將長期處于產(chǎn)業(yè)價值鏈的低端水平,國內(nèi)經(jīng)濟(jì)也無法實現(xiàn)高質(zhì)量發(fā)展。

1.2方法

1.2.1 ARPE-19細(xì)胞培養(yǎng)收到ARPE-19細(xì)胞后放置入培養(yǎng)箱，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞密度約為85%時使用胰酶進(jìn)行消化，1200r/min離心5min，1∶3傳代，接種于T25培養(yǎng)瓶中，加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)(10% FBS，1%青-鏈霉素混合液，89% DMEM-F12)，2d換液一次，穩(wěn)定傳代后取2～4代用于實驗。同時，細(xì)胞密度為85%時進(jìn)行消化離心，加入凍存液(10% DMSO，90% FBS)重懸，放入-80℃冰箱凍存，次日投入液氮長期保存。

1.2.2實驗分組及處理將細(xì)胞隨機(jī)分為空白組、LPS組、低濃度LBP組、中濃度LBP組、高濃度LBP組。所有分組加藥前均使用不含血清的培養(yǎng)基饑餓24h?？瞻捉M使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，與其余組同時換液；LPS組給予含10μg/mL LPS的完全培養(yǎng)基刺激24h；LBP組分別給予含有低濃度LBP(0.1mg/mL)、中濃度LBP(0.5mg/mL)及高濃度LBP(1mg/mL)的完全培養(yǎng)基孵育24h，再以同樣方式給予10μg/mL LPS作用24h。

1.2.3 CCK-8觀察各組細(xì)胞存活率細(xì)胞以濃度為1×104個/mL接種于96孔板中，每孔加入200μL培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h，待細(xì)胞貼壁后PBS沖洗兩遍并給予無血清DMEM培養(yǎng)基饑餓24h。各組處理同上，處理后PBS沖洗換液加入含10% CCK-8的無血清培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱中避光孵育2h，酶標(biāo)儀450nm檢測OD值，使用公式：細(xì)胞存活率=[(實驗孔-空白孔)/(對照孔-空白孔)]×100%，計算出細(xì)胞存活率。

1.2.4 Real Time-PCR檢測各組細(xì)胞內(nèi)炎性因子的mRNA表達(dá)量上述各組細(xì)胞接受處理后按照天根總RNA提取試劑盒步驟過柱提取，提取后測定RNA濃度并用瓊脂糖凝膠電泳驗證純度后，每組取等量RNA參照Invitrogen逆轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成為cDNA，-80℃保存。使用DBI SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒，嚴(yán)格按照步驟，以cDNA為模板進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增。引物序列見表1。反應(yīng)體系為：20μL。采用試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)三步法進(jìn)行Real Time-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：預(yù)變性，95℃ 2min；PCR反應(yīng)，95℃ 10s，50℃～60℃ 30～34s，72℃ 30s，共40循環(huán)。熔解曲線，55℃～98℃ 84循環(huán)。得出Ct值，以GAPDH為內(nèi)參，使用相對定量法，計算2-△△Ct值。

1.2.5 Western-blot檢測各組蛋白表達(dá)量各組細(xì)胞接受處理后，根據(jù)全蛋白提取試劑盒步驟，冷PBS洗滌細(xì)胞2次，加入提前配置的裂解液并刮出細(xì)胞，收集懸液放置冰上，間隔4min震蕩一次，每次持續(xù)1min，循環(huán)5次。離心機(jī)12000r/min、4℃離心20min取上清液，依照BCA蛋白定量試劑盒步驟進(jìn)行蛋白定量。定量后加入5×上樣緩沖液，100℃變性5min備用。配制10% SDS-PAGE凝膠，取40μg蛋白(p-p65、p65、p-IκBα、IκBα)或80μg蛋白(p-p38、p-ERK、p-JNK、p38、ERK、JNK)上樣，加入電泳液，連接電泳儀調(diào)整電壓為80V進(jìn)行電泳，至分離膠時轉(zhuǎn)120V電泳至底部，打開切膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜(PVDF膜，濕轉(zhuǎn)，220mA，60min)，5%脫脂奶粉或5% BSA溶液(磷酸化蛋白)封閉4h，洗膜(0.1% PBST 5min，重復(fù)3次)后一抗封閉過夜，第2d洗膜后二抗孵育2h，再洗膜，取出表面滴ECL發(fā)光液進(jìn)行曝光。一抗?jié)舛龋簆-p65、p65、p-IκBα、IκBα、p-p38、p38及p-ERK(均1∶1000)，p-JNK及JNK(1∶800)，ERK(1∶500)，β-Actin(1∶1000)。二抗?jié)舛龋?∶10000。使用Image J軟件分析條帶，p-p65與p65比值，p-IκBα、IκBα與β-Actin比值進(jìn)行計算，p-p38、p-ERK及p-JNK分別與p38、ERK和JNK比值進(jìn)行計算。

2結(jié)果

2.1枸杞多糖對LPS誘導(dǎo)下ARPE-19細(xì)胞活力的影響空白組、LPS組、低濃度LBP組、中濃度LBP組、高濃度LBP組細(xì)胞存活率分別為(96.33±6.51)%、(61.79±19.78)%、(107.58±40.47)%、(118.29±34.42)%、(114.01±20.70)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.496，P=0.026)。與空白組相比，LPS組細(xì)胞存活率下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。相較于LPS組，各LBP處理組細(xì)胞存活率升高，均大于80%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但各濃度處理組之間相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，表明一定濃度的LBP對LPS誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞的炎性損傷具有抑制作用，見圖1。

圖1 枸杞多糖對LPS誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞活力的影響 a P<0.05 vs LPS組。

圖2 枸杞多糖對LPS誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞內(nèi)炎性因子的影響 A：IL-6的mRNA表達(dá)量；B：IL-1β的mRNA表達(dá)量；C：MCP-1的mRNA表達(dá)量。 b P<0.01 vs LPS組。

表1 RT-PCR引物序列

2.2各組細(xì)胞內(nèi)炎性因子mRNA表達(dá)量的變化各組細(xì)胞內(nèi)炎性因子IL-6、IL-1β和MCP-1的mRNA表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見表2。其中，LPS組表達(dá)量較空白組均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；與LPS組相比，低、中、高濃度LBP組的IL-6及MCP-1表達(dá)量均明顯下降，高濃度LBP組的IL-1β表達(dá)量也明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。但各因子的三個LBP濃度組之間進(jìn)行比較，表達(dá)量未見明顯變化，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。可見，在轉(zhuǎn)錄水平，LBP能夠抑制LPS誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞中炎性因子IL-1β、IL-6及MCP-1的表達(dá)，而此作用與LBP的劑量無關(guān)，見圖2。

表2 各組細(xì)胞內(nèi)炎性因子mRNA的表達(dá)

圖3 枸杞多糖對LPS誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞內(nèi)NF-κB通路相關(guān)因子蛋白表達(dá)量的影響 A：p-p65相對蛋白表達(dá)量；B：p-IκBα相對蛋白表達(dá)量；C：IκBα相對蛋白表達(dá)量；D：蛋白表達(dá)檢測條帶。a P<0.05，b P<0.01 vs LPS組。

表3 各組細(xì)胞內(nèi)NF-κB/MAPK通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.3各組細(xì)胞內(nèi)NF-κB/MAPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)量的變化

2.3.1 NF-κB通路各組NF-κB通路的p-p65、p-IκBα及IκBα蛋白表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表3)。LPS組的p-p65、p-IκBα表達(dá)水平較空白組明顯升高，而IκBα蛋白表達(dá)量降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與LPS組相比，低、中、高濃度LBP組的p-p65表達(dá)量均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與低濃度LBP組比較，高濃度LBP組的p-p65、p-IκBα蛋白表達(dá)量均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，可見LBP的作用隨濃度升高而增強(qiáng)；同時，高濃度LBP組的IκBα表達(dá)量較LPS組升高，而p-IκBα表達(dá)量降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明LBP能夠抑制IκBα蛋白向p-IκBα轉(zhuǎn)化。所以，枸杞多糖能夠抑制LPS刺激ARPE-19細(xì)胞NF-κB通路的激活，并可通過抑制NF-κB通路相關(guān)蛋白p65、IκBα的磷酸化發(fā)揮效應(yīng)，且呈現(xiàn)出LBP劑量依賴性，見圖3。

2.3.2 MAPK通路檢測各組MAPK通路磷酸化因子的蛋白相對表達(dá)量進(jìn)行比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。與空白組相比，LPS刺激后p-JNK、p-ERK及p-p38的蛋白表達(dá)量升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與LPS組相比較，低、中、高濃度LBP組p-p38的蛋白表達(dá)量可見明顯下降，中、高濃度LBP組p-JNK的蛋白表達(dá)量降低，并且在高濃度LBP組的細(xì)胞中p-ERK的蛋白表達(dá)量有所減少，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；比較低濃度LBP組與高濃度LBP組，發(fā)現(xiàn)三種磷酸化蛋白表達(dá)量隨著LBP濃度的升高均有降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。由此可見，枸杞多糖能夠抑制LPS刺激ARPE-19細(xì)胞內(nèi)JNK、ERK及p38的磷酸化，并具有劑量依賴性，揭示枸杞多糖可通過JNK/ERK/p38通路抑制LPS誘導(dǎo)的ARPE-19炎性反應(yīng)。

圖4 枸杞多糖對LPS誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞內(nèi)MAPK通路相關(guān)因子蛋白表達(dá)量的影響 A：p-JNK相對蛋白表達(dá)量；B：p-ERK相對蛋白表達(dá)量；C：p-p38相對蛋白表達(dá)量；D：蛋白表達(dá)檢測條帶。a P<0.05, b P<0.01 vs LPS組。

3討論

LBP具有明確的抗炎作用，研究發(fā)現(xiàn)它可通過抗炎、抗氧化和抗凋亡等機(jī)制發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[12-13]。在小鼠巨噬細(xì)胞中，LBP可通過抑制TLR4/NF-κB信號通路減輕LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)[14]；并且，LBP可通過MAPK通路調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子的變化，進(jìn)而抑制小鼠肝腦損傷及運(yùn)動障礙[15]。眼科研究中，已證實雷公藤、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2激動劑等藥物可通過NF-κB/MAPK通路抑制LPS誘導(dǎo)的RPE炎癥性反應(yīng)[16-17]。所以，我們采用LPS誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞建立炎性反應(yīng)模型觀察LBP的作用，證實LPS可誘導(dǎo)ARPE-19發(fā)生炎性損傷、細(xì)胞存活率下降，并且發(fā)現(xiàn)一定濃度的LBP預(yù)處理能提高炎性損傷后的RPE細(xì)胞活力。而且，LPS與LBP同時應(yīng)用并未降低細(xì)胞活力，證實了LBP應(yīng)用的無毒性，這可為預(yù)防RPE的炎性損傷提供一種安全的新藥物。

在ARMD的機(jī)制及治療研究中，炎性因子一直受到廣泛關(guān)注。近年研究發(fā)現(xiàn)，眼部衰老相關(guān)疾病可伴隨有IL-6、IL-1β及MCP-1等炎性因子的增加[18-19]；有人使用IL-1β刺激RPE細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)IL-6、IL-8及MCP-1等炎性因子的升高[20]；還發(fā)現(xiàn)通過LPS刺激RPE細(xì)胞也可出現(xiàn)IL-6、IL-8及MCP-1等升高[17-21]。而在本實驗中，我們也觀察到LPS誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)炎性因子IL-6、IL-1β及MCP-1的表達(dá)量明顯升高，并且發(fā)現(xiàn) LBP可發(fā)揮明顯的抗炎作用，降低這些炎性因子的表達(dá)，為LBP能夠抑制RPE細(xì)胞的炎性反應(yīng)提供了有力證據(jù)。另外，細(xì)胞產(chǎn)生炎性反應(yīng)時，幾乎都存在NF-κB通路的激活。比如LPS刺激細(xì)胞后，可與細(xì)胞表面的Toll樣受體結(jié)合，激活I(lǐng)κBα激酶，合成IκBα復(fù)合物，進(jìn)一步誘導(dǎo)IκBα磷酸化、泛素化，后被相應(yīng)蛋白酶識別降解，使得p50/p65從IκBα復(fù)合物中釋放出來，形成p50/p65二聚體，再迅速發(fā)生核轉(zhuǎn)位，由p65形成p-p65，最后啟動細(xì)胞核中如TNF-α、IL-1β、IL-6及MCP-1等細(xì)胞炎性因子的靶基因表達(dá)[22-24]。在本實驗中我們觀察到LPS誘導(dǎo)后ARPE-19細(xì)胞中IκBα、p65的磷酸化水平升高，進(jìn)一步證實LPS能夠通過誘導(dǎo)RPE細(xì)胞中NF-κB通路的激活發(fā)揮其致炎作用。在此基礎(chǔ)上新發(fā)現(xiàn)LBP可上調(diào)RPE細(xì)胞中IκBα蛋白水平，下調(diào)磷酸化因子p-IκBα、p-p65的表達(dá)，表明LBP能夠抑制胞內(nèi)NF-κB通路激活、阻礙IκBα及p65向磷酸化轉(zhuǎn)化。此結(jié)果明確了在RPE細(xì)胞中，LBP的抗炎作用機(jī)制可通過抑制NF-κB通路進(jìn)行。并且我們還對LBP在三個濃度梯度下的抗炎作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)濃度越高，LBP抑制NF-κB通路激活的作用越強(qiáng)。這顯示出LBP的抗炎作用存在劑量依賴性，可為下一步進(jìn)行體內(nèi)及臨床研究時選擇藥物濃度提供參考。

MAPK通路與細(xì)胞增殖、應(yīng)激、炎癥、凋亡等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路密切相關(guān)。作為這些通路的交匯點，它將胞外信號經(jīng)受體、G蛋白、蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子等組成信號網(wǎng)絡(luò)，傳遞到胞內(nèi)，參與細(xì)胞分化、癌變、遷移、凋亡等細(xì)胞病理生理過程。MAPK通路是信號從細(xì)胞表面到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者，分為ERK、p38、JNK和ERK5等亞族，其激活通過級聯(lián)過程進(jìn)行，被激活后表現(xiàn)為逐級的磷酸化[25]。研究表明，LPS刺激可通過激活細(xì)胞內(nèi)信號通路適配器MyD88蛋白的表達(dá)進(jìn)行，再啟動下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)，引起MAPK通路中p-JNK、p-ERK及p-p38的激活[26-27]。我們的實驗結(jié)果也證實了這一點。同時發(fā)現(xiàn)LBP可降低LPS刺激后RPE細(xì)胞內(nèi)JNK、ERK及p38的磷酸化表達(dá)，這顯示LBP是通過抑制MAPK中亞級通路JNK/ERK/p38的激活來降低RPE炎性反應(yīng)。除此之外，不同濃度LBP作用強(qiáng)度不同，在低濃度LBP的處理下抑制MAPK通路激活的作用并不明顯，但在高濃度LBP組中，三種因子的磷酸化表達(dá)均有很大程度的減低，所以，LBP的抗炎作用與藥物用量密切相關(guān)。再者，由于MAPK通路與細(xì)胞增殖及凋亡聯(lián)系緊密，所以ARMD中RPE細(xì)胞的炎癥相關(guān)死亡方式也值得關(guān)注。

本實驗雖然得出細(xì)胞水平的結(jié)論，無體內(nèi)實驗證據(jù)，但可為下一步繼續(xù)深入探討LBP對ARMD中炎癥方面的作用提供基本依據(jù)?；诩?xì)胞實驗，還可進(jìn)行細(xì)胞死亡方式的研究，并觀察其他可能參與RPE炎性反應(yīng)的信號通路，為ARMD及眼科RPE相關(guān)炎癥性疾病的治療提供新靶點。

綜上所述，枸杞多糖對于LPS誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞炎性反應(yīng)具有抑制作用，并通過抑制NF-κB/MAPK通路相關(guān)因子的磷酸化及阻礙細(xì)胞內(nèi)炎性因子IL-1β、IL-6及MCP-1的轉(zhuǎn)錄過程而發(fā)揮影響。