韓浩園,高慧軍,吳依依,楊 帥,王先寧,尹慧茹,王惠繪,李 君,王擁慶,權(quán) 凱*

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院動物科技學院，鄭州 450046；2.南陽市獸藥監(jiān)察所，河南 南陽 473068；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)藥學院，蘭州 730070；4.沈丘縣農(nóng)牧科技研發(fā)中心，河南 周口 466300）

遺傳多樣性和起源、進化是動物遺傳領域研究熱點，線粒體DNA（mtDNA）研究涉及哺乳動物大群體遺傳、屬內(nèi)及種間親緣關(guān)系、系統(tǒng)發(fā)生、物種起源與分化方面，可解決育種、改良、選種和保種問題[1-2]。山羊是馴化較早的牲畜之一，其馴化中心在肥沃新月地帶[3]。捻角野山羊（C.aegagrus）和旋角野山羊（C.falconeri）是家養(yǎng)山羊的兩大野生祖先[4]。大量mtDNA研究結(jié)果表明，山羊具有多個母系起源并且在不同時間存在群體擴張[5]。山羊mtDNA具有7個高度分化的單倍型分支（A、B1、B2、C、D、F、G），且C支系和D支系可能分別起源于B支系和A支系[6-7]，而C支系可能起源于亞洲，D支系可能起源于肥沃新月地帶。中國家養(yǎng)山羊線粒體DNA D-loop遺傳多樣性豐富[8-9]，可劃分為A、B、C、D四個分支，并且A支系和B支系經(jīng)歷群體擴張，地理遺傳結(jié)構(gòu)分化不明顯[10-11]。

伏牛山屬秦嶺山脈東段支脈，秦巴山脈河南片區(qū)，位于河南省西南部，是秦巴山脈生態(tài)功能區(qū)重要組成部分。伏牛山區(qū)涵蓋河南省洛陽市、平頂山市、三門峽市和南陽市，占河南省總面積24 %。該區(qū)域經(jīng)過自然進化和人類長期選育，形成伏牛白山羊、堯山白山羊和槐山羊3個山羊品種。目前對于伏牛山區(qū)山羊群體遺傳多態(tài)性相關(guān)報道極少，本研究以伏牛山區(qū)3個地方山羊品種為研究對象，通過分析mtDNA D-loop區(qū)全序列研究其遺傳多樣性，分析3個山羊品種起源進化及遺傳分化，確定品種遺傳特征，了解各群體間親緣關(guān)系及山羊遺傳資源背景狀況，為河南省畜禽遺傳資源評估和育種提供重要依據(jù)，促進地方畜牧業(yè)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

本研究共采集槐山羊（Huai goat，H）、堯山白山羊（Yaoshan white goat，YSB）和伏牛白山羊（Funiu white goat，F(xiàn)NB）共98個個體外周血樣本，其中72個槐山羊樣本采自河南省周口市沈丘縣杰瑞槐山羊場和老城鎮(zhèn)羊場，9個堯山白山羊樣本采自河南省平頂山市魯山縣平頂山亨榮農(nóng)牧有限公司，17個伏牛白山羊樣本由河南省內(nèi)鄉(xiāng)縣畜牧站提供。所有樣本采集前由外貌體格特征確認品種血統(tǒng)。外周血樣由EDTA抗凝管頸靜脈采血5 mL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA提取與PCR擴增

采用北京艾德萊生物科技有限公司動物基因組DNA提取試劑盒提取山羊外周血基因組DNA，4℃保存?zhèn)溆?。由生工生物工程（上海）股份有限公司合成山羊D-loop區(qū)特異性引物（上游引物序列為5'AACCACTATTAACCACATCTA 3'，下游引物序列為5'CACTTACCATGTAAAAGACCC 3'）。PCR擴增體系為25μL，包括DNA模板（20 ng·μL-1）1 μL，正反向引物（10μmol·L-1）各1μL，TaqPCR Master Mix 12.5μL（5μmol·L-1dNTP、1 UTaqPolymerase、1 mmol·L-1KCl、0.03 mmol·L-1Mg-Cl2、0.2 mmol·L-1Tris-HCl），ddH2O 9.5μL。PCR擴增程序為：95℃預變性4 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸60 s，36個循環(huán)；72℃延伸9 min，4℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物片段與目的片段一致樣本送往生工生物工程（上海）股份有限公司作雙向測序（單向測序長度為1 000 bp）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Lasergene軟件包SeqMan軟件將雙向序列拼接，利用MEGA 6.0軟件[12]ClustalW作多重比對分析并截齊序列。利用截齊后1 132 bp序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)進化樹，自舉檢驗重復數(shù)為1 000。基于MEGA6.0軟件Kimura 2-parameter（K2P）模型[13]計算槐山羊、堯山白山羊和和伏牛白山羊品種間遺傳距離。導出MEGA 6.0比對后序列，利用DnaSP V5軟件分析3個山羊品種D-loop區(qū)DNA多態(tài)性（核苷酸多樣度Pi、單倍型多樣度Hd）、品種間遺傳分化（固定系數(shù)Fst、遺傳分化系數(shù)Gst、種群間核苷酸平均差異數(shù)Kxy和核苷酸歧義度Dxy）和中性檢驗[14-15]，利用DnaSP V5軟件作單倍型鑒定，生成單倍型數(shù)據(jù)，導入NETWORK 10.0.0.0軟件（Fluxus Technology Ltd.,Kiel,Germany）構(gòu)建槐山羊、堯山白山羊和伏牛白山羊3個品種線粒體D-loop單倍型網(wǎng)絡圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增結(jié)果

伏牛山區(qū)3個山羊品種98個樣本DNA提取結(jié)果顯示OD260/OD280為1.80～2.00，證明提取DNA無蛋白質(zhì)和RNA污染。PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示單一、清晰、明亮條帶（見圖1），條帶位于1 000～2 000 bp，產(chǎn)物長度約1 100 bp，與目標產(chǎn)物長度相符，可用于后續(xù)分析。

2.2 線粒體D-loop區(qū)遺傳多樣性分析

槐山羊、堯山白山羊和伏牛白山羊比對截齊后D-loop序列為1 132 bp，其中單態(tài)位點992個，多態(tài)（分離）位點S為105個，缺失位點為32個。3個品種98只個樣本共定義56個單倍型，槐山羊和堯山白山羊存在3個共享單倍型。總單倍型多樣度Hd為0.965，各品種單倍型多樣度范圍為0.456～0.975；總核苷酸多樣度Pi為0.01214，各品種核苷酸多樣度范圍為0.00832～0.01234。3個品種平均核苷酸差異數(shù)k為13.318（見表1）。遺傳多態(tài)性分析結(jié)果表明槐山羊和堯山白山羊D-loop序列遺傳多樣性豐富，而伏牛白山羊單倍型多樣度明顯低于另外兩個品種。

圖1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis results of PCR products

表1 3個山羊品種線粒體D-loop遺傳多態(tài)性分析Table 1 Genetic polymorphisms of mtDNA D-loop of three goat breeds

2.3 群體結(jié)構(gòu)分析

基于鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建槐山羊、堯山白山羊和伏牛白山羊的系統(tǒng)進化樹（見圖2），結(jié)果表明系統(tǒng)進化樹共聚為5支（CladeⅠ～Ⅴ），CladeⅡ、Ⅴ以伏牛白山羊為主，CladeⅠ、Ⅲ、Ⅳ為槐山羊和堯山白山羊混合支。由系統(tǒng)發(fā)育樹可見，伏牛白山羊較另外兩個品種血統(tǒng)更純，存在獨立分支。遺傳距離結(jié)果表明槐山羊、堯山白山羊和伏牛白山羊遺傳距離均小于0.02（見表2），未達到亞種間遺傳距離。

圖2 基于3個山羊品種D-loop序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic trees of three goat breeds based on D-loop sequences

表2 槐山羊、堯山白山羊和伏牛白山羊品種間遺傳距離Table 2 Genetic distance among Huai goat,Yaoshan white goat and Funiu white goat

2.4 單倍型和母系起源分析

單倍型分析共鑒定56個單倍型（Hap 1～56），其中槐山羊有48個單倍型（Hap 1～48），堯山白山羊有8個單倍型（Hap 3,8,33,49～53），伏牛白山羊有3個單倍型（Hap 54～56）。槐山羊與堯山白山羊存在3個共享單倍型（Hap 3,8和33）。單倍型網(wǎng)絡圖共有2個單倍群（Haplotype group 1和2）（見圖3），單倍群1對應系統(tǒng)發(fā)育樹CladeⅠ～Ⅳ，為槐山羊、堯山白山羊和伏牛白山羊共有單倍群，且單倍群1中各單倍型分布與系統(tǒng)發(fā)育樹相符；單倍群2對應分支CladeⅤ，為槐山羊和伏牛白山羊單倍群。網(wǎng)絡圖結(jié)果表明河南省3個山羊品種存在兩個母系起源，且可能存在共同的母系起源。

2.5 群體分化和群體擴張分析

品種間遺傳分化分析結(jié)果表明品種間核苷酸平均差異數(shù)Kxy范圍為10.75154～17.15931，核苷酸岐異度Dxy變異范圍為0.00980～0.01564，槐山羊與伏牛白山羊山羊品種間核苷酸平均差異數(shù)和歧異度最高，堯山白山羊和槐間核苷酸平均差異數(shù)和歧異度最低。固定系數(shù)Fst范圍為0.01730～0.32582，遺傳分化系數(shù)Gst范圍為0.01618～0.19562（見表3）。3個山羊品種間分化程度如表3所示。遺傳分化結(jié)果支持系統(tǒng)發(fā)育樹中伏牛白山羊獨立分支及3個山羊品種間遺傳距離的結(jié)果。

伏牛白山羊Fu and Li's F檢驗結(jié)果為正值，且顯著偏離中性（見表4），表明伏牛白山羊近期經(jīng)歷過瓶頸效應和平衡選擇，與伏牛白山羊遺傳多態(tài)性較低結(jié)果相符。槐山羊和堯山白山羊Fu and Li's F檢驗均為P＞0.10，不顯著，符合動態(tài)平衡，未出現(xiàn)群體大規(guī)模擴張或瓶頸現(xiàn)象，群體大小保持相對穩(wěn)定。

圖3 基于線粒體D-loop的3個山羊品種單倍型網(wǎng)絡圖Fig.3 Haplotype network of three goat breeds based on mtDNA D-loop

表3 品種間遺傳分化系數(shù)Table 3 Genetic differentiation among breeds

表4 中性檢驗Table 4 Neutrality test

3 討 論

3.1 伏牛山區(qū)山羊遺傳多樣性

本研究分析3個伏牛山區(qū)山羊品種線粒體遺傳多態(tài)性、品種間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、遺傳距離和遺傳分化。由于本地種質(zhì)資源樣本稀缺，堯山白山羊和伏牛白山羊樣本較少可能影響遺傳多態(tài)性及單倍型分析結(jié)果。研究表明3個山羊品種核苷酸多樣度均大于0.005，屬于高核苷酸多樣性；槐山羊和堯山白山羊單倍型多樣度豐富（Hd＞0.5），伏牛白山羊單倍型屬于中度多態(tài)，可能與樣本量較少有關(guān)。李婉清等研究表明槐山羊和伏牛白山羊線粒體D-loop區(qū)核苷酸多樣度為0.0165，單倍型多樣度為0.92[16]，與本研究結(jié)果相近。Liu等研究表明中國山羊品種遺傳多樣性豐富[17-18]，與本研究結(jié)果一致。巴基斯坦山羊線粒體遺傳多樣性豐富[19]；地中海地區(qū)5個山羊品種則顯示中度單倍型和核苷酸多樣度[20]。

本研究結(jié)果表明98個樣本共定義56個單倍型，槐山羊、堯山白山羊和伏牛白山羊D-loop區(qū)分別鑒定48個、8個和3個單倍型，大部分為品種特異單倍型，僅槐山羊和堯山白山羊共享3個單倍型，山羊D-loop僅有少數(shù)共享單倍型結(jié)果與Vacca、王杰、趙中權(quán)等研究結(jié)果一致[20-22]，說明中國山羊不同群體具有獨特mtDNA D-loop單倍型，不同品種間共享單倍型較少，類群單倍型豐富?；鄙窖蚝蛨蛏桨咨窖蜻z傳多樣性豐富，物種遺傳多樣性與其進化潛力、環(huán)境適應能力緊密相關(guān)[23]，證明槐山羊和堯山白山羊具有較強進化潛力和環(huán)境適應力，從遺傳多樣性角度揭示槐山羊和堯山白山羊種質(zhì)資源優(yōu)良，發(fā)展?jié)摿^大。

3.2 伏牛山區(qū)山羊群體擴張

在動物進化過程中，群體數(shù)量對群體遺傳多樣性和DNA變異有較大影響，為了解群體遺傳進化歷史，需檢測該群體是否發(fā)生擴張。伏牛白山羊中性檢驗結(jié)果為正值，且顯著偏離中性（P＜0.02），表明伏牛白山羊近期經(jīng)歷過瓶頸效應和平衡選擇?；鄙窖蚝蛨蛏桨咨窖蛑行詸z驗不顯著（P＞0.10），未出現(xiàn)群體大規(guī)模擴張或瓶頸現(xiàn)象，群體大小保持相對穩(wěn)定。Liu等分析9個中國山羊品種mtDNA D-loop，槐山羊?qū)儆谥礎，核苷酸不配對分布曲線分析和Fu的Fs中性檢驗表明山羊支系A曾經(jīng)歷群體擴張[17]，與本研究結(jié)果不一致，可能是本研究槐山羊和伏牛白山羊樣本存在亞群體結(jié)構(gòu)造成。目前尚無針對伏牛白山羊和堯山白山羊的群體歷史動態(tài)研究結(jié)果。郝榮超等研究發(fā)現(xiàn)中國其他家養(yǎng)山羊中性檢驗結(jié)果不顯著，表明中國山羊未出現(xiàn)群體擴張[24]，與本研究結(jié)果一致。

3.3 伏牛山區(qū)山羊母系起源

槐山羊、堯山白山羊和伏牛白山羊系統(tǒng)進化樹聚為5支（CladeⅠ～Ⅴ），CladeⅠ、Ⅲ～Ⅴ為槐山羊、伏牛白山羊和堯山白山羊混合支。李婉濤等構(gòu)建槐山羊、伏牛白山羊和牛腿山羊NJ進化樹，共聚分為3支，其中伏牛白山羊和槐山羊聚為1大支[16]，與本研究結(jié)果相符，說明槐山羊、堯山白山羊和伏牛白山羊品種間有一定程度基因交流。伏牛白山羊占據(jù)CladeⅡ和Ⅴ兩個分支，且CladeⅤ的5個樣本與其他樣本遺傳差異較大，可能與采樣時伏牛白山羊為不同群體或伏牛白山羊不同母系起源有關(guān)。單倍型網(wǎng)絡圖共鑒定2個單倍群，與系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果一致，表明伏牛山區(qū)山羊至少存在兩個母系起源，同樣，Liu等根據(jù)92種mtDNA單倍型構(gòu)建中國山羊NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，說明中國山羊存在支系A和支系B兩大母系起源[17]。楊忠誠等根據(jù)mtDNA單倍型構(gòu)建貴州山羊NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，聚類表明貴州山羊存在支系A和支系B兩大母系起源[25]，本研究結(jié)果同時也支持山羊多起源說[19,26]。

4 結(jié) 論

河南省伏牛山區(qū)山羊遺傳多態(tài)性較豐富，槐山羊與堯山白山羊為高遺傳多態(tài)性，伏牛白山羊為中度遺傳多態(tài)性；3個品種間未達到種間遺傳距離，有一定的基因交流；槐山羊、堯山白山羊和伏牛白山羊存在兩個母系起源，3個品種間可能存在共同母系起源；伏牛白山羊近期經(jīng)歷瓶頸效應和平衡選擇，槐山羊和堯山白山羊群體近期維持動態(tài)平衡。