高學(xué)軍，王璐璐，祁 昊，王 哲，甄 貞

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

畜禽蛋白質(zhì)產(chǎn)量由骨骼肌總量決定。骨骼肌由軸旁中胚層發(fā)育而來，由干細胞定向分化形成單核成肌細胞，進而融合形成多核肌管和成熟肌纖維。骨骼肌細胞生長發(fā)育過程不僅包括成肌細胞增殖與分化，也與蛋白質(zhì)合成水平有關(guān)[1]。成肌細胞蛋白質(zhì)合成是骨骼肌生長發(fā)育重要過程之一。

蛋白質(zhì)生物合成受多種信號通路調(diào)控。絲/蘇氨酸蛋白激酶mTOR（The mechanistic target of rapamycin）在細胞生長、增殖和凋亡等過程中發(fā)揮重要生物學(xué)作用，是眾多代謝過程中核心調(diào)控因子。研究發(fā)現(xiàn)，mTOR信號通路可促進骨骼肌生長及再生[2]。mTOR通過mTOR復(fù)合物1（mTOR complex 1，mTORC1）和mTOR復(fù)合物2（mTOR complex 2，mTORC2）發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞生長和蛋白質(zhì)合成作用[3-4]。mTORC1使其下游兩個重要信號分子S6K1（Ribosomal protein S6 kinase 1）與4EBP1（4E-binding protein 1）發(fā)生磷酸化，4EBP1磷酸化后翻譯起始因子eIF4E（Eukaryotic initiation factor 4E）被釋放；eIF4E與eIF4G（Eukaryotic initiation factor 4G）結(jié)合，提高mRNA穩(wěn)定性，促進mRNA翻譯起始；而S6K1磷酸化促使核糖體蛋白S6磷酸化，增加與蛋白質(zhì)合成相關(guān)編碼蛋白mRNA翻譯過程。mTOR通過下游信號分子作用，促進細胞生長和蛋白質(zhì)合成[5]。mTORC2則通過調(diào)節(jié)AKT和PKC激酶活化，參與細胞骨架構(gòu)建及細胞極性調(diào)節(jié)等過程，影響細胞增殖[5]。

各種營養(yǎng)素（氨基酸、脂肪酸、葡萄糖等）和胰島素、生長激素等均可通過PI3K（Phosphatidylinositol 3-kinase）/Akt（Protein kinese B）信號通路mTOR途徑調(diào)節(jié)成肌細胞蛋白質(zhì)合成[6]。在營養(yǎng)因子中，氨基酸既是蛋白質(zhì)合成必需底物，也是mTORC1活性調(diào)節(jié)必要信號分子[7]。?；撬幔═aurine，Tau）是哺乳動物組織中β-氨基磺酸，以游離形式存在或與膽汁酸形成復(fù)合物[8]。細胞通過Na+依賴性牛磺酸轉(zhuǎn)運蛋白（Tau transporter，TauT）積累牛磺酸。此外，Tau也可通過Na+非依賴性β-氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白（The proton-coupled amino acid transporter，PAT1）進入細胞。Naghavi等研究表明，Tau可調(diào) 節(jié)PI3K/AKT、AKT/FOXO1、JAK2/STAT3和mTOR/AMPK等信號通路[9]。

AT富集區(qū)域家族（Adenine thymine-rich interactive domain family，ARID家族）是一類結(jié)合富含AT序列DNA的轉(zhuǎn)錄因子，具有多種調(diào)控作用[10]。ARID家族可分為7個亞家族，分別為ARID1、ARID2、ARID3、ARID4、ARID5、JARID1、JARID2[9]。ARID家族與調(diào)控細胞生長、分化和發(fā)育過程中基因表達及染色質(zhì)重塑有關(guān)。ARID4B是ARID家族成員，一種染色質(zhì)重塑因子[9]。ARID4B參與細胞生長和分化，與腫瘤形成密切相關(guān)，ARID4B基因在乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、卵巢癌和正常睪丸中高度表達，但在其他正常組織中表達有限[11]。ARID4B募集mSIN3A組蛋白脫乙酰酶復(fù)合物并誘導(dǎo)乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移[12]。尚未見ARID4B介導(dǎo)Tau調(diào)節(jié)mTOR等途徑影響蛋白質(zhì)合成的報道。

本試驗擬觀察ARID4B對小鼠骨骼肌成肌細胞系C2C12細胞總蛋白質(zhì)合成以及mTOR磷酸化的影響，進一步分析Tau是否通過ARID4B-mTOR信號通路調(diào)節(jié)C2C12細胞蛋白質(zhì)合成。研究結(jié)果為揭示ARID4B作用機理提供理論依據(jù)，也為Tau應(yīng)用于骨骼肌生長發(fā)育和畜禽蛋白質(zhì)產(chǎn)量提升奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

儀器：CO2細胞培養(yǎng)箱（Thermo，美國），熒光定量PCR儀（Eppendorf，德國），SW-CJ-IFD無菌操作臺（安泰，蘇州），YC-1層析實驗冷柜（亞星儀科，北京），TY-80A/S脫色搖床（榮華儀器，江蘇），倒置相差顯微鏡（DFC280，Leica，德國）。

試劑：?；撬幔兌龋?9%）（Sigma，美國），優(yōu)質(zhì)胎牛血清（P30-1402，PAN Bio-tech，德國），DMEM（12800-058，Gibco，美國），蛋白Marker（PR1800，Gibco，美國），OPTI-MEMⅠ（31985070，Gibco，美國），根據(jù)ARID4B基因序列設(shè)計合成的siRNAoligos、陰性對照siRNA（吉瑪，蘇州），mTOR（#2983）、磷酸化mTOR（p-mTOR）（Ser2448，#5536）（Cell Signaling Technology，美國），ARID4B（24499-1-AP，Proteintech，美國），Anti-Puromycin抗體（MABE343，Millipore，美國），β-actin抗體（sc-47778，Santa Cruz Technology，美國），二辛可寧酸（Bicinchoninic acid，BCA），蛋白濃度測定試劑盒（P0012S，碧云天，北京）。

C2C12細胞：試驗用小鼠成肌細胞系由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院嚴云勤教授實驗室饋贈。

1.2 細胞培養(yǎng)

將C2C12細胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待培養(yǎng)瓶中細胞生長至鋪滿瓶底70%～80%，DHank's液清洗細胞兩次；吸盡培養(yǎng)瓶中液體后，加入500μL胰蛋白酶將其消化，37℃消化1 min左右，輕輕搖晃細胞瓶，待觀察至細胞大部分脫落，根據(jù)試驗所需量，加入含2×雙抗、10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，以適當密度接種于細胞培養(yǎng)瓶或細胞培養(yǎng)板中用于后續(xù)研究。

1.3 篩選ARID4B干擾片段

ARID4B干擾片段和陰性對照RNA片段（Negative control，NC）由蘇州吉瑪生物有限公司設(shè)計并合成。以適當密度細胞懸液均勻鋪在六孔板中，待細胞貼壁后更換成OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)液，細胞饑餓12 h后，分為以下4個試驗組：NC組、ARID4B-siRNA-1組、ARID4B-siRNA-2組、ARID4B-siRNA-3組，3條siRNA序列見表1。

表1 ARID4B-siRNAs序列Table 1 Sequences of ARID4B-siRNAs

1.4 細胞瞬時轉(zhuǎn)染

適當密度細胞懸液均勻鋪于六孔板，待細胞貼壁后，試驗分4組：轉(zhuǎn)染NC組、Tau處理同時轉(zhuǎn)染NC組、轉(zhuǎn)染ARID4B siRNA組、Tau處理同時轉(zhuǎn)染ARID4B siRNA組。利用siRNA-Mate轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染ARID4B siRNA，DEPC水溶解ARID4B siRNA粉末，至其終濃度20μmol·L-1；將ARID4B siRNA、NC分別與siRNA-Mate混勻（5μL NC/siRNA+8μL siRNA-Mate），靜置復(fù)合物15 min，每孔用D-Hank's液清洗兩遍，加入700μL的Opti-MEM I，吹打混勻，將復(fù)合物加入六孔板中。37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h收樣用于后續(xù)試驗。

1.5 熒光定量PCR

采用qRT-PCR檢測mTORmRNA表達。用RNA easyTM動物RNA抽提試劑盒提取細胞中RNA，紫外分光光度法檢測RNA濃度。RNA純度合格后，用于反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系見表2，37℃處理30 min，85℃保溫5 min。

表2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系Table 2 Content of reverse transcription complex

使用qRT-PCR試劑盒（全式金，北京）將反轉(zhuǎn)錄cDNA產(chǎn)物直接用于后續(xù)qRT-PCR。冰上制備反應(yīng)體系，反應(yīng)程序：94℃，30 s預(yù)變性。94℃，5 s；60℃，30 s；40個循環(huán)。使用Primer 5軟件設(shè)計qRT-PCR引物，送華大生物科技有限公司（武漢）合成，qRT-PCR所用引物序列見表3。以β-actin為內(nèi)參基因，采用ΔΔCt法分析，計算相對定量結(jié)果（2-ΔΔCt法）。

表3 qRT-PCR所用引物序列Table 3 Primer sequences for qRT-PCR

1.6 SUnSET法測定蛋白質(zhì)合成速率

Enrico等開發(fā)一種基于非放射性熒光激活細胞分選的測定方法，稱為SUnSET（Surface sensing of translation）法[13]。該方法可檢測哺乳動物細胞中蛋白質(zhì)合成速率。嘌呤霉素（Puromycin）是一種氨基核苷抗生素，與氨基酰tRNA結(jié)構(gòu)接近，可作為蛋白質(zhì)合成抑制劑。向細胞中添加少量嘌呤霉素，嘌呤霉素可整合至新合成的多肽鏈中阻止肽鏈延長，嘌呤霉素結(jié)合蛋白質(zhì)數(shù)量可反映蛋白質(zhì)合成速率。在無菌條件下用水將嘌呤霉素溶解并過濾，配制為10 mg·mL-1原液，-20℃保存。取生長良好C2C12細胞，以適當密度接種于六孔板。當細胞生長至70%左右，更換成OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)液，饑餓12 h，加入不同濃度Tau（0、60、120、160和240μmol·L-1），孵育24 h，在收樣0.5 h前，添加嘌呤霉素，使其終濃度為10μg·mL-1。處理0.5 h后收樣，作Western blot檢測。

1.7 BCA法測定細胞總蛋白質(zhì)含量

采用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測C2C12細胞中總蛋白質(zhì)含量。將試劑A與B充分混勻（50∶1），配置BCA工作液，室溫靜置24 h。標準曲線制作：完全溶解蛋白標準品，PBS稀釋至終濃度0.5 mg·mL-1；蛋白濃度測定：取標準品稀釋液按0、1、2、4、8、12、16和20μL加到96孔板標準品孔中，將C2C12細胞接種于六孔板，待細胞長至60%～70%，更換成OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)液，饑餓12 h，加入不同濃度Tau，孵育24 h，取10μL樣品到96孔板樣品孔中，PBS補足至20μL，各孔加入200μL BCA工作液，37℃放置30 min，取出平板于酶標儀上測吸光度，測定波長為562 nm。按照標準曲線計算蛋白質(zhì)含量。

1.8 蛋白提取與蛋白印跡

將收樣細胞去除培養(yǎng)液，PBS沖洗3遍，加入適量2×SDS上樣緩沖液，靜置10 min，充分裂解，細胞刮收集細胞，轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管，沸水煮10 min，超聲3次，每次15 s，收集樣品用于后續(xù)Western blot試驗。

采用Western blot方法檢測mTOR、p-mTOR（Ser2448）、ARID4B和β-actin蛋白水平變化，按照SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒說明書（P0012AC，碧云天），制備分離膠和濃縮膠，點樣。4℃、恒壓80 V電泳；當溴酚藍指示劑約達到分離膠界面時調(diào)電壓至120 V，距離膠底1 cm時關(guān)閉電源；恒壓75 V轉(zhuǎn)膜90 min；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，根據(jù)目的條帶分子質(zhì)量剪出所需蛋白條帶；放入含5%脫脂乳TBST溶液中，于37℃搖床封閉1.5 h；將NC膜置于一抗稀釋液，4℃搖床孵育過夜；次日，二抗37℃搖床孵育90 min，曝光，以β-actin為內(nèi)參。使用Image J軟件掃描蛋白灰度值。

1.9 統(tǒng)計分析

所得數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。用Excel 17.0軟件處理和分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)標記字母相同為差異不顯著（P＞0.05），字母不同為差異顯著（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度Tau對C2C12細胞總蛋白質(zhì)含量和蛋白質(zhì)合成速率的影響

用不同濃度Tau處理C2C12細胞24 h，采用SUnSET法檢測添加不同濃度Tau細胞中蛋白質(zhì)合成速率。結(jié)果表明，在120μmol·L-1Tau處理下，蛋白質(zhì)合成速率最高，后逐漸下降（見圖1A和B）。通過BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測C2C12細胞中總蛋白質(zhì)含量（見圖1C），隨Tau濃度從0增加至120μmol·L-1，總蛋白質(zhì)含量逐漸增加，并在120μmol·L-1處達到峰值，后下降?？芍?，Tau劑量依賴性調(diào)節(jié)C2C12細胞中蛋白質(zhì)合成速率和總蛋白質(zhì)含量。

2.2 不同濃度Tau對C2C12細胞蛋白質(zhì)合成相關(guān)信號通路的影響

由圖2可知，添加不同濃度Tau處理細胞12 h后，Western blot檢測p-mTOR、mTOR、ARID4B蛋白表達水平變化，結(jié)果表明，添加低濃度（＜120 μmol·L-1）Tau可增加C2C12中磷酸化mTOR和ARID4B蛋白表達水平；添加高濃度（＞120μmol·L-1）Tau，磷酸化mTOR和ARID4B蛋白表達水平逐漸降低，120μmol·L-1處呈現(xiàn)峰值。以上試驗數(shù)據(jù)表明Tau劑量依賴性促進C2C12細胞蛋白質(zhì)合成。

圖1 Tau對C2C12細胞總蛋白質(zhì)含量和蛋白質(zhì)合成速率的影響Fig.1 Effects of Tau on total protein content and protein synthesis rate in C2C12 cells圖1 Tau對C2C12細胞總蛋白質(zhì)含量和蛋白質(zhì)合成速率的影響Fig.1 Effects of Tau on total protein content and protein synthesis rate in C2C12 cells圖1 Tau對C2C12細胞總蛋白質(zhì)含量和蛋白質(zhì)合成速率的影響Fig.1 Effects of Tau on total protein content and protein synthesis rate in C2C12 cells

A-Western blot檢測添加不同濃度Tau后C2C12細胞中蛋白質(zhì)合成速率變化；B-通過灰度掃描量化蛋白質(zhì)合成速率變化水平；C-使用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測添加不同濃度Tau后C2C12細胞中總蛋白質(zhì)含量。數(shù)據(jù)用平均值±均方差表示，3次重復(fù)試驗，不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同。

A-Protein synthesis rate in C2C12 protein levels were analyzed by Western blot analysis using an antibody against puromycin.B-The Western blot was quantified by gray scale scanning.C-The total protein content in C2C12 cells was detected by the BCA protein concentration determination kit after taurine was added at different concentrations.Data were the means±SD from three independent experiments.Values with different lowercase letter indicated significant difference(P＜0.05).The same as below.

圖2 Western blot檢測添加不同濃度Tau對mTOR、p-mTOR和ARID4B表達的影響Fig.2 Effects of different concentrations of Tau on the expression of mTOR,p-mTOR and ARID4B by Western blot analysis

2.3 ARID4B干擾片段篩選2.3 ARID4B干擾片段篩選2.3 ARID4B干擾片段篩選

ARID4B基因干擾片段由蘇州吉瑪公司設(shè)計合成，共設(shè)計3條siRNA片段，通過轉(zhuǎn)染和Western blot試驗，篩選出ARID4B-siRNA-2（正義鏈：5' GCGGACAACUAGUUUCUAUTT 3'，反義鏈：5' AUAGAAACUAGUUGUCCGCTT 3'）為ARID4B干擾效果最佳siRNA片段，結(jié)果見圖3。選擇該干擾片段用于后續(xù)試驗。

2.4 添加Tau并敲低ARID4B對C2C12細胞總蛋白質(zhì)含量和蛋白質(zhì)合成速率的影響

添加Tau并敲低ARID4B，24 h后收集細胞樣品，使用SUnSET法檢測敲低ARID4B后C2C12細胞蛋白質(zhì)合成速率，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測C2C12細胞總蛋白質(zhì)含量。結(jié)果表明，添加最適濃度Tau提高蛋白質(zhì)合成速率，敲低ARID4B阻斷Tau對C2C12細胞蛋白質(zhì)合成的促進作用（見圖4A和B）。添加最適濃度Tau后，總蛋白質(zhì)含量升高，敲低ARID4B阻斷Tau對C2C12細胞總蛋白質(zhì)含量的促進作用（見圖4C）。結(jié)果說明ARID4B介導(dǎo)Tau提高C2C12細胞總蛋白質(zhì)含量和蛋白質(zhì)合成速率。

2.5 添加Tau并敲低ARID4B對相關(guān)信號通路表達變化的影響

添加Tau并敲低ARID4B后，C2C12細胞mTOR磷酸化變化趨勢與mTORmRNA水平變化趨勢相同，如圖5所示。添加最適濃度Tau后，mTOR磷酸化水平顯著升高，ARID4B敲低后，不僅降低mTOR磷酸化作用，且消除添加Tau對mTOR磷酸化的刺激作用（見圖5A-C）。敲低ARID4B也阻斷Tau對mTORmRNA表達水平促進作用（見圖5D）。結(jié)果表明，ARID4B敲低阻斷Tau對mTOR磷酸化和mTORmRNA表達促進作用。

圖3 ARID4B干擾片段篩選Fig.3 Screening of ARID4B interference fragments

圖4 ARID4B敲低對Tau調(diào)節(jié)C2C12細胞總蛋白質(zhì)含量和蛋白質(zhì)合成速率的影響Fig.4 Effects of ARID4B knockdown on the stimulation of Tau on total protein content and protein synthesis rate of C2C12 cells

圖5 敲低ARID4B基因?qū)2C12細胞mTOR磷酸化和mTOR mRNA表達的影響Fig.5 Effects of ARID4B knockdown on mTOR phosphorylation and mTOR mRNA expression in C2C12 cells

3 討 論

3.1 Tau對C2C12細胞蛋白質(zhì)合成的影響

研究表明，氨基酸通過G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）、氨基酸轉(zhuǎn)運體等調(diào)控細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如PI3K、mTOR等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[14]。早期研究表明Leu、Met、Lys、Arg、Ile等均可刺激mTOR磷酸化，其中Leu是主要激活mTOR的氨基酸[15]。Leu可提高mTOR通路中S6K1磷酸化水平，促進大鼠骨骼肌中蛋白合成，改善大鼠生長性能[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，當Tau濃度低于120μmol·L-1時，Tau劑量依賴性促進C2C12細胞總蛋白質(zhì)含量和蛋白質(zhì)合成速率。低濃度Tau促進mTOR磷酸化，在Tau濃度為120μmol·L-1處達到峰值，后逐漸下降，表明Tau劑量依賴性促進C2C12細胞蛋白質(zhì)合成。Ulrike等報道顯示，過量Tau可被氧化為可能具有細胞毒性的羥乙基磺酸和磺基乙醛[17]。p-mTOR蛋白水平受Tau刺激而改變，而mTOR蛋白水平無顯著變化，與本研究結(jié)果一致[18]。表明Tau劑量依賴性促進C2C12細胞中蛋白質(zhì)合成，而過量Tau對蛋白質(zhì)合成有抑制作用。

3.2 ARID4B介導(dǎo)Tau對成肌細胞C2C12蛋白質(zhì)合成的影響

轉(zhuǎn)錄因子ARID4B具有多種調(diào)控作用，Wu報道ARID4A和ARID4B在小鼠正常發(fā)育和生理過程中具有重要作用[12]。本研究中，向C2C12細胞中添加最適濃度（120μmol·L-1）Tau后，細胞內(nèi)總蛋白質(zhì)含量以及蛋白質(zhì)合成速率顯著提高。ARID4B敲低后，細胞內(nèi)總蛋白質(zhì)含量以及蛋白質(zhì)合成速率顯著減少。通過Western blot試驗進一步分析，ARID4B敲低后，mTOR磷酸化也顯著降低。結(jié)果顯示，ARID4B敲低不僅消除蛋白質(zhì)合成功能，還消除Tau促進作用。綜合以上數(shù)據(jù)表明，ARID4B介導(dǎo)Tau通過調(diào)控mTOR磷酸化促進C2C12細胞蛋白質(zhì)合成。本試驗發(fā)現(xiàn)Tau劑量依賴性調(diào)節(jié)ARID4B表達水平，但具體分子機理尚不清楚，有待進一步研究。

3.3 ARID4B介導(dǎo)Tau對C2C12細胞mTOR mRNA表達的影響

通過qRT-PCR試驗發(fā)現(xiàn)，mTORmRNA水平在ARID4B敲低后也顯著減少，ARID4B敲低也顯著抑制Tau對mTORmRNA表達促進作用。Liang等研究報道ARID4B正向調(diào)節(jié)PI3K表達，且是PI3K亞基PIK3CA和PIK3R2轉(zhuǎn)錄激活因子[19]；ARID4B等位基因與組蛋白脫乙?；笍?fù)合物成員mSIW3A和MSDS3結(jié)合調(diào)節(jié)基因表達[19]。因此，推斷ARID4B介導(dǎo)Tau可能通過調(diào)節(jié)mTOR基因轉(zhuǎn)錄促進mTOR磷酸化，也可能激活mTOR上游PI3K基因表達從而促進mTOR磷酸化。ARID4B調(diào)節(jié)C2C12細胞蛋白質(zhì)合成調(diào)控方式有待進一步研究。

4 結(jié) 論

本研究揭示Tau劑量依賴性促進C2C12細胞蛋白質(zhì)合成。ARID4B介導(dǎo)Tau正向調(diào)節(jié)mTOR磷酸化以及mTORmRNA表達水平，促進C2C12細胞的蛋白質(zhì)合成，同時揭示ARID4B介導(dǎo)Tau調(diào)節(jié)成肌細胞蛋白質(zhì)合成功能和作用機理，為Tau作為飼料添加劑提高畜禽產(chǎn)肉量性狀提供理論依據(jù)。