許 鼎 鮑賢豪 張 恒 劉 鵬 馬鵬程 徐子依 陸 燁劉軍軍 郭明金 馮 睿 景在平 馮家烜

1解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院血管外科，上海 200433

2青島大學(xué)附屬醫(yī)院血管外科，青島 266555

3上海市第一人民醫(yī)院介入中心血管外科，上海 200940

主動(dòng)脈夾層是一種威脅生命、易引起猝死的血管疾病，每年的發(fā)病率為0.05‰～0.30‰[1]。主動(dòng)脈夾層分為Stanford A型（累及升主動(dòng)脈）和Stanford B型（未累及升主動(dòng)脈），其中Stanford B型通常采用血管腔內(nèi)治療。Stanford B型主動(dòng)脈夾層患者的近端破裂口采用開放手術(shù)置換或腔內(nèi)隔絕術(shù)治療后，多數(shù)患者夾層假腔穩(wěn)定，但文獻(xiàn)顯示，經(jīng)過長期隨訪，每3例Stanford B型主動(dòng)脈夾層患者經(jīng)腔內(nèi)隔絕術(shù)治療后就有1例出現(xiàn)主動(dòng)脈夾層假腔遠(yuǎn)端動(dòng)脈瘤樣擴(kuò)張（distal aneurysmal expansion of false lumen of aortic dissection，DAEAD）[2]，這表明主動(dòng)脈夾層仍在進(jìn)展，出現(xiàn)疼痛等癥狀，甚至出現(xiàn)DAEAD瘤腔壓迫周圍臟器形成梗阻。30.0%～62.5%的DAEAD患者在隨訪5年以上時(shí)需要再次治療[3]。由于DAEAD解剖學(xué)的高度復(fù)雜性，當(dāng)發(fā)生廣泛累及內(nèi)臟分支動(dòng)脈的DAEAD時(shí)，無論采取開放手術(shù)還是腔內(nèi)治療都具有高風(fēng)險(xiǎn)。近期研究顯示，可以采用平行支架技術(shù)進(jìn)行腔內(nèi)修復(fù)作為解決DAEAD的方法[4]。但這一技術(shù)通?；ㄙM(fèi)高昂，同時(shí)也存在著內(nèi)漏、分支動(dòng)脈閉塞等缺點(diǎn)。有研究顯示，DAEAD即使進(jìn)行早期腔內(nèi)干預(yù)，也無法避免高昂的花費(fèi)，也存在術(shù)后并發(fā)癥[5]。但是對于真正進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)較高的患者，早期識別干預(yù)還是具有重要意義，因此需要對DAEAD的發(fā)病機(jī)制開展深入研究，本研究探討DAEAD的遺傳學(xué)風(fēng)險(xiǎn)，初步探索DAEAD進(jìn)展的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，從而為臨床提供新的夾層進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)評估指標(biāo)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2013年4月至2020年10月解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院主動(dòng)脈夾層近端破裂口治療后患者外周血樣本中的基因表達(dá)譜和影像等臨床資料。根據(jù)隨訪轉(zhuǎn)歸情況分為DAEAD組和非DAEAD組。DAEAD患者納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）主動(dòng)脈夾層（Stanford A型或B型）近端撕裂采用開放手術(shù)（Stanford A型夾層行升主置換或術(shù)中象鼻支架技術(shù)）、腔內(nèi)治療（支架移植物隔絕近端破裂口）；（2）近端破裂口處理良好（無內(nèi)漏、無逆撕Stanford A型夾層等），遠(yuǎn)端夾層動(dòng)脈瘤繼續(xù)進(jìn)展，形成了胸降主動(dòng)脈夾層動(dòng)脈瘤、胸腹主動(dòng)脈夾層動(dòng)脈瘤或腹主動(dòng)脈夾層動(dòng)脈瘤；（3）夾層動(dòng)脈瘤的主動(dòng)脈最大直徑＞5 cm和/或迅速增大（5 毫米/6個(gè)月或1 厘米/年）。DAEAD患者排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）交通事故、高空墜落等創(chuàng)傷因素引起的創(chuàng)傷性主動(dòng)脈夾層；（2）非典型的主動(dòng)脈夾層，如主動(dòng)脈潰瘍或壁間血腫；（3）缺少必要臨床信息或不能提供隨訪期完整影像學(xué)資料。根據(jù)納入排除標(biāo)準(zhǔn)，最終納入12例DAEAD患者為DAEAD組。同期選取主動(dòng)脈夾層近端破裂口治療后假腔遠(yuǎn)端恢復(fù)良好患者為非DAEAD組患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）主動(dòng)脈夾層（Stanford A型或B型）近端撕裂采用開放手術(shù)（Stanford A 型夾層行升主動(dòng)脈置換或術(shù)中象鼻支架技術(shù)）、腔內(nèi)治療（支架移植物隔絕近端破裂口）。（2）第1次手術(shù)治療后隨訪，主動(dòng)脈計(jì)算機(jī)斷層掃描血管造影（computed tomography angiography，CTA）證實(shí)主動(dòng)脈夾層假腔無進(jìn)展或萎縮，甚至假腔完全消失。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，最終納入5例患者。兩組患者臨床特征比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1），具有可比性。

1.2 資料收集

收集首次圍手術(shù)期結(jié)果和并發(fā)癥等相關(guān)信息。此外，使用Aquarius和CTA測量各主動(dòng)脈裂口的位置和大小，測量真腔和假腔的長短徑等夾層動(dòng)脈瘤解剖數(shù)據(jù)。測量部位包括主動(dòng)脈根部、主動(dòng)脈弓部、降主動(dòng)脈和腹主動(dòng)脈。由成都奇恩生物技術(shù)公司進(jìn)行基因測序。

1.3 樣本處理和全外顯子組測序

采用基因組DNA提取試劑盒（Invitrogen，美國）從患者外周血中提取外顯子測序和變異體調(diào)用基因組DNA。使用SureSelect Human All Exon V6試劑盒（Agilent Technologies，美國）或Medical Exome v2（MyGenostics，中國）制備和捕獲測序文庫。使用NovaSeq或HiSeq-X測序系統(tǒng)在Illumina平臺上對靶區(qū)域進(jìn)行配對末端測序[6]。

對原始測序讀數(shù)過濾，從而去除測序質(zhì)量較低的讀數(shù)。用BWA-MEM軟件將清洗后的讀數(shù)映射到人類參考基因組（Grch37）上，并用Picards（http://broadinstitute.github.io/picard）去除聚合酶鏈反應(yīng)的重復(fù)序列[7]。變體調(diào)用通過4種基于單倍型的調(diào)用算法（Platypus、Samtools、6 FreeBayes和GATK單倍型調(diào)用者）中至少2種方法的一致調(diào)用來執(zhí)行。用R軟件包ExomeDepth分析基因拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNV）。使用VEP軟件進(jìn)行變異注釋，包括基因功能結(jié)果（基因背景、氨基酸變化、剪接效應(yīng)等）[8]。致病性預(yù)測還采用多種計(jì)算方法（SIFT、Polyhen2、MutationTaster、CADD等 ）。健康人群的健康對照組等位基因頻率來自2個(gè)數(shù)據(jù)庫：Exac（http://exac.broadinstitute.org/）和gnomAD（https://gnomad.broadinstitute.org/）[9]。

1.4 變異過濾與基因診斷

分析僅限于外顯子、典型剪接位點(diǎn)和已知致病內(nèi)含子區(qū)域內(nèi)的變異。對變異進(jìn)行篩選，只包括普通人群中罕見的變異[在gnomAD和Exac數(shù)據(jù)庫中，最小的等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）≤0.001]。結(jié)合臨床表型-基因關(guān)系的XREARE算法[10]和美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)（American College of Medical Genetics，ACMG）序列變異解釋指南[11]被用于基因診斷的變異分類。重點(diǎn)研究了28個(gè)已知主動(dòng)脈瘤和7個(gè)夾層相關(guān)的基因，并詳細(xì)檢查了這些基因中罕見的變異[12]。對于未知意義的變異的遺傳，測試了主動(dòng)脈瘤和夾層相關(guān)最重要的3條途徑：細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix pathway，ECM ）途徑、平滑肌細(xì)胞收縮（smooth muscle cell contraction，SMC ）途徑和轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β ）途徑。對每條通路進(jìn)行Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)，比較DAEAD患者中意義未明的基因突變（variant of undetermined significance，VUS）的數(shù)量與健康對照組中VUS變異的數(shù)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用 SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以n表示，組間比較采用Fisher確切概率法；非正態(tài)分布資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 圍手術(shù)期結(jié)果

患者術(shù)后無截癱，無內(nèi)臟缺血等并發(fā)癥和死亡。撕裂部位以降主動(dòng)脈最多。DAEAD組和非DAEAD組在腹腔干平面真腔長徑和短徑、腸系膜上動(dòng)脈平面真腔長徑和短徑及假腔長徑和短徑、左腎動(dòng)脈平面真腔長徑和短徑、右腎動(dòng)脈平面真腔長徑和短徑、腎下最大平面真腔長徑和短徑及假腔長徑比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；DAEAD組腹腔干平面、左腎動(dòng)脈平面和右腎動(dòng)脈平面的假腔長徑和短徑長于非DAEAD組，腎下最大平面的假腔短徑長于非DAEAD組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2）。DAEAD組和非DAEAD組患者不同分支血管的真假腔比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表3）。

表2 DAEAD組和非DAEAD組患者不同平面的真假腔長短徑比較[mm，M（P25，P75）]

表3 DAEAD組和非DAEAD組患者不同分支血管的真假腔情況

2.2 DAEAD組與非DAEAD組的基因分析

2.2.1 全外顯子組測序的致病變異

結(jié)合表型和遺傳證據(jù)分析，在17例患者中發(fā)現(xiàn)共10個(gè)可能的致病/致病（likely pathogenic/ pathogenic，LP/P）變異和潛在未知意義的變異（variant of uncertain significance，VUS）（圖1）。在DAEAD組患者中發(fā)現(xiàn)7個(gè)可能的致病/致?。╨ikely pathogenic/pathogenic，LP/P） 變 異， 而 在 非DAEAD組中，沒有發(fā)現(xiàn)致病變異。LP/P的變異體分布的基因[3個(gè)在原纖維蛋白-1（fibrillin 1，F(xiàn)BN1）中，2個(gè)在α-肌動(dòng)蛋白（actin alpha 2，ACTA2）中，1個(gè)在轉(zhuǎn)化生長因子β受體1（transforming growth factor beta receptor 1，TGFBR1）中，1個(gè)在轉(zhuǎn)化生長因子β受體2（transforming growth factor beta receptor 2，TGFBR2） 中]。DAEAD組患者致病變異率為58.3%（7/12）。

圖1 DAEAD組和非DAEAD組基因突變分布

2.2.2 潛在的未知意義的突變體

本研究獲得7個(gè)LP/P變異外，還發(fā)現(xiàn)了3個(gè)潛在的未知意義的突變體。其中包括1例DAEAD患者在ClinVar數(shù)據(jù)庫中報(bào)道的1個(gè)錯(cuò)義突變（ACTA2中的c.46T＞C），1例DAEAD患者無菌α基序和組氨酸天冬氨酸結(jié)構(gòu)域蛋白 1基因（sterile α motif and histidine-aspartate domain-containing protein 1，SAMHD1）突變（c.276-7A＞G）以及腺嘌呤核苷三磷酸結(jié)合盒亞家族 C成員 6基因（adenosine triphosphate binding cassette subfamily C member 6，ABCC6）中的1個(gè)錯(cuò)義突變（c.4070G＞A）。

進(jìn)一步將VUS風(fēng)險(xiǎn)變量分析擴(kuò)展到與主動(dòng)脈瘤和夾層相關(guān)的3條重要途徑中，結(jié)果顯示，DAEAD組和非DAEAD組的ECM 途徑的VUS變異多于健康對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2）；DAEAD組、非DAEAD組和健康對照組的SMC途徑和TGF-β 途徑的VUS變異比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖3，圖4）。

圖2 DAEAD組、非DAEAD組和健康對照組的ECM途徑的VUS變異情況

圖3 DAEAD組、非DAEAD組和健康對照組SMC途徑的VUS 變異情況

圖4 DAEAD組、非DAEAD組和健康對照組的TGF-β 途徑的VUS變異情況

3 討論

隨著主動(dòng)脈夾層患者急性期開放手術(shù)治療和微創(chuàng)腔內(nèi)治療技術(shù)和器具的發(fā)展，近端破裂口治療的成功率顯著提高。而近端破裂口治療后的隨訪中，遠(yuǎn)端夾層繼續(xù)進(jìn)展為DAEAD的風(fēng)險(xiǎn)成為主動(dòng)脈夾層研究的熱點(diǎn)。DAEAD是一種需要及時(shí)治療的疾病，因其病情復(fù)雜，預(yù)后不良，不管是胸腹主動(dòng)脈置換的開放手術(shù)、雜交手術(shù)，還是腔內(nèi)修復(fù)（八爪魚技術(shù)、分支型移植物、開窗型移植物等），都難度較高和風(fēng)險(xiǎn)較大，且遠(yuǎn)期療效仍需要進(jìn)一步評估。因此，針對主動(dòng)脈夾層治療后仍是高危且可進(jìn)展至DAEAD的患者需要進(jìn)行早期干預(yù)，目前已成為臨床亟需解決的問題。據(jù)報(bào)道，急性或亞急性期主動(dòng)脈夾層腔內(nèi)治療后的主動(dòng)脈重塑優(yōu)于慢性主動(dòng)脈夾層[13]。而DAEAD的形成原因也被廣泛討論，比如腔內(nèi)移植物過短[14]和遠(yuǎn)端胸主動(dòng)脈或腹主動(dòng)脈大破裂口[15]也可能與DAEAD有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，撕裂部位以降主動(dòng)脈居多，DAEAD組腹腔干平面、左腎動(dòng)脈平面和右腎動(dòng)脈平面的假腔長徑和短徑長于非DAEAD組，腎下最大平面的假腔短徑長于非DAEAD組，該現(xiàn)象可能與其在各分支區(qū)的血流動(dòng)力學(xué)有關(guān)，也有可能與兩組患者基因相關(guān)。但DAEAD組和非DAEAD組患者臨床特征比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明無法根據(jù)臨床特征發(fā)現(xiàn)主動(dòng)脈夾層近端破裂口治療后患者是否會進(jìn)展至DAEAD。結(jié)合表型和遺傳證據(jù)分析，在17例主動(dòng)脈夾層近端破裂口治療后患者中發(fā)現(xiàn)10個(gè)致病變異、新的致病變異和潛在的未知意義的變異，根據(jù)ACMG指南證據(jù)水平，在DAEAD組患者中發(fā)現(xiàn)了7個(gè)可能的LP/P變異，而在非DAEAD組中，沒有發(fā)現(xiàn)致病變異。DAEAD組患者致病變異率為58.3%，這一致病變異率與之前報(bào)道的主動(dòng)脈瘤和夾層全外顯子測序結(jié)果相比顯著增高[16-18]。這是針對遺傳因素對DAEAD發(fā)生的影響的報(bào)道，這有助于從遺傳基因的角度去分析主動(dòng)脈夾層近端破裂口治療后患者的病因和預(yù)后，尤其是DAEAD發(fā)生發(fā)展的遺傳病因，這有利于為主動(dòng)脈夾層近端破裂口治療后患者提供病因、預(yù)后和制定整體臨床治療策略的、更全面的、更關(guān)注遠(yuǎn)期療效的數(shù)據(jù)和證據(jù)。

本研究遺傳分析顯示，LP/P的VUS主要分布于FBN1和ACTA2中，ACTA2相關(guān)的家族性胸主動(dòng)脈6型是自體顯性，臨床表現(xiàn)包括升主動(dòng)脈夾層、主動(dòng)脈瘤、早期冠心病和煙霧現(xiàn)象。OMIM數(shù)據(jù)報(bào)道，ACTA2相關(guān)突變導(dǎo)致家族性胸主動(dòng)脈瘤6型[19-20]。2007年，Guo等[21]研究顯示，主動(dòng)脈瘤合并主動(dòng)脈夾層的家族中發(fā)現(xiàn)了ACTA2雜合突變Arg149CyS（RS121434526）。2009年，另一項(xiàng)研究顯示，45例Arg149Cys突變患者中，24例患有胸主動(dòng)脈瘤和主動(dòng)脈夾層，12例患有冠心病[21]。這些臨床發(fā)現(xiàn)均高度提示ACTA基因突變與主動(dòng)脈病變的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，針對其基因突變位點(diǎn)和類型仍需要深入研究。

FBN1基因突變是馬方綜合征的致病基因。1991年，在馬方綜合征患者中發(fā)現(xiàn)了第1例纖維蛋白原基因突變，并證實(shí)15號染色體上的纖維蛋白基因位點(diǎn)的突變與馬方綜合征有關(guān)[22]。目前已在馬方綜合征患者中發(fā)現(xiàn)了41 500個(gè)FBN1突變[23]，許多FBN1等位基因突變通過顯性-負(fù)效應(yīng)導(dǎo)致馬方綜合征。馬方綜合征是一種全身性結(jié)締組織病，主要累及眼、骨和心血管系統(tǒng)，具有高度的臨床特異性。其中，心血管系統(tǒng)異常是馬方綜合征患者早期死亡的主要原因，包括升主動(dòng)脈擴(kuò)張、二尖瓣脫垂伴/不伴反流、三尖瓣脫垂、主動(dòng)脈夾層和近端肺動(dòng)脈擴(kuò)張等。

主動(dòng)脈夾層和動(dòng)脈瘤疾病的遺傳風(fēng)險(xiǎn)是復(fù)雜的[24]。這類疾病可能由于單基因遺傳疾病中的高滲透性致病變異（如馬方綜合征中的FBN1基因），也可能是多基因中低滲透性VUS“風(fēng)險(xiǎn)變異”的聯(lián)合作用[25-26]。本研究進(jìn)一步分析基因突變和表達(dá)顯示，將VUS風(fēng)險(xiǎn)變量分析擴(kuò)展到與主動(dòng)脈瘤和夾層相關(guān)的3條重要途徑，ECM 途徑，SMC 途徑，TGF-β途徑。DAEAD組和非DAEAD組的ECM 途徑 VUS變異多于健康對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；這表明本研究對于主動(dòng)脈夾層發(fā)生發(fā)展的基因突變?nèi)孕枰M(jìn)行更深入的研究，這些VUS突變可能會揭示新的主動(dòng)脈夾層致病基因或是基因突變組合。

通過對主動(dòng)脈瘤或夾層患者進(jìn)行外顯子全序列基因檢測，可以準(zhǔn)確地識別已知相關(guān)基因中的致病變異（包括以前報(bào)道的和識別新的相關(guān)變異）。本研究報(bào)道DAEAD這一主動(dòng)脈夾層近端破裂口治療后不良預(yù)后的遺傳基因突變相關(guān)性的研究，提示了基于基因檢測對主動(dòng)脈夾層患者的臨床意義。對于基因檢測發(fā)現(xiàn)的攜帶高危致病基因突變的患者，可能需要更加加強(qiáng)隨訪，如半年一次，發(fā)現(xiàn)有DAEAD進(jìn)展趨勢，早期干預(yù)以簡化治療，阻斷病理進(jìn)展。在局限性方面，DAEAD組和非DAEAD組的患者數(shù)量較少，這是因?yàn)檫@一項(xiàng)初步研究在開始之初，為了確?；颊叽_實(shí)是遠(yuǎn)端進(jìn)展高?；颊呋蚴沁h(yuǎn)期預(yù)后良好的患者，必須有長期隨訪的影像學(xué)支持，而且要有典型的測量數(shù)據(jù)和臨床癥狀支持，從而嚴(yán)格入組，相當(dāng)一部分難以判斷其遠(yuǎn)期轉(zhuǎn)歸的患者排除在外。而在臨床危險(xiǎn)因素分析方面，影響DAEAD發(fā)生與否的因素仍不明確，可能不局限于本研究所分析的參數(shù)。

綜上所述，本研究提示一些已知主動(dòng)脈疾病的致病基因不僅與主動(dòng)脈夾層發(fā)病有關(guān)，而且與其遠(yuǎn)期進(jìn)展的不良預(yù)后有關(guān)。