黃柳娟,馮 博,劉海燕,周昌艷,2,白 冰,邵 毅,2

(1 上海市農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質量標準與檢測技術研究所;2 上海市設施園藝技術重點實驗室,上海201403)

因冷鮮雞肉與熱鮮肉、冷凍肉相比,有著營養(yǎng)價值高、口感風味佳等優(yōu)點,所以成為我國雞肉消費的主要模式之一[1]。在屠宰、分割、剔骨、包裝、運輸、貯藏到銷售過程中,冷鮮雞肉可能受到羽毛、腳、腸道微生物以及環(huán)境微生物的污染,可能染上病原微生物和其他有害菌;并因冷藏條件不嚴格而發(fā)生細菌的增殖,從而影響雞肉產(chǎn)品的品質及安全性[2]。由于冷鮮雞肉表面接觸的污染源多且復雜,又在冷藏過程中受存儲溫度、含氧量等原因的影響,因此,冷鮮雞肉表面和內(nèi)部微生物的種類、數(shù)量和增殖情況可能不同[3]。雖然我國對生肉的微生物檢驗明確了取樣部位為深層肌肉[4],但目前對于冷鮮雞肉微生物的研究大多仍將肉塊看作一個整體,較少考慮內(nèi)源和外源細菌的差異[5-6]。

近年來,高通量測序[7]、變性梯度凝膠電泳(DGGE)[8]和基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)[9]等技術的發(fā)展實現(xiàn)了樣本中細菌的高通量分離和鑒定。其中,高通量測序技術因其不依賴于細菌的培養(yǎng)、快速高通量、可以定量分析等優(yōu)點而越來越多地用于樣品的菌群多樣性分析研究。本試驗基于高通量測序技術,分別對冷藏0 d 和3 d 的冷鮮雞肉表面及內(nèi)部細菌菌群結構多樣性和增殖趨勢進行分析,旨在為冷鮮雞肉微生物安全的精細控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2 份冷鮮整雞和3 份雞胸肉共5 份冷鮮雞肉樣品于2019年2月隨機采自上海市閔行區(qū)和浦東新區(qū)的5個大型超市。樣品均為塑封包裝,生產(chǎn)或包裝日期為采樣當天。將樣品裝入無菌袋,低溫條件(約4 ℃)下3 h 內(nèi)運回實驗室。

1.2 儀器與試劑

儀器:BAGMIXER400 型均質機(法國Interscience 公司);Mini-Sub cell GT 型水平核酸電泳系統(tǒng)(美國Bio-Rad 公司);Criterion Stain Free 型凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad 公司);NanoDrop 2000c 型超微量分光光度計(美國Thermo 公司);BCD-649WE 型冰箱(中國青島海爾股份有限公司);1384 型生物安全柜(美國Thermo 公司);5424 型離心機(德國Eppendorf 公司);SX-500 型高壓滅菌鍋(日本TOMY 公司)。

試劑:生理鹽水由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn);醫(yī)用酒精購自國藥集團化學試劑有限公司;細菌基因組提取試劑盒購自德國QIAGEN 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理

每份樣品都平均分為2 份:1 份直接分離表面的外源細菌及內(nèi)部的內(nèi)源細菌,命名為E0 組和I0 組;另1 份在4 ℃±1 ℃條件下貯藏3 d,再分別分離外源及內(nèi)源細菌,命名為E3 組和I3 組。

1.3.2 冷鮮雞內(nèi)源和外源細菌的分離和基因組提取

冷鮮雞外源細菌的分離:無菌條件下將雞肉樣品表面(深度不超過5 mm)的組織剪碎,混勻。準確稱量25 g 于帶濾膜的無菌袋中,加入75 mL 滅菌生理鹽水,均質機均質2 min,吸取上清,獲得冷鮮雞外源細菌的均質液。

冷鮮雞內(nèi)源細菌的分離:用醫(yī)用酒精對雞肉進行表面消毒,在沸水內(nèi)燙3—5 s[4],再用無菌剪刀剪取深層雞肉,剪碎后準確稱量25 g,同外源細菌的分離步驟,獲得冷鮮雞內(nèi)源細菌的均質液。

細菌基因組提取:取50 mL 細菌均質液,12000 r∕min 離心,棄上清,用試劑盒提取細菌基因組,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和核酸定量儀測定,確定所提細菌總DNA 的質量后,委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行細菌群落結構的多樣性分析。

1.3.3 細菌菌群的高通量測序及數(shù)據(jù)分析

用聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)擴增16S rDNA 的V3-V4 區(qū)。上游引物序列為5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’,下游引序列為5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’。擴增結束后,用2%瓊脂糖凝膠電泳和核酸定量儀檢測PCR 產(chǎn)物的質量,基于IonS5TMXL 測序平臺,利用單端測序(Single-End)的方法,對構建的小片段文庫進行高通量測序。

將下機數(shù)據(jù)導出fastq 文件,根據(jù)barcode 序列區(qū)分各樣本的數(shù)據(jù),并進行嵌合體過濾,得到用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)(Clean reads)。以97% 的一致性對所有樣本進行操作分類單元(OTUs,Operational Taxonomic Units)聚類和物種分類分析。用Qiime 軟件(Version 1.9.1)計算α多樣性指數(shù),包括反映菌群豐富度的超指數(shù)(Chao1)和ACE 指數(shù),反映菌群多樣性的香農(nóng)指數(shù)(Shannon)和辛普森指數(shù)(Simpon),以及指示測序深度的菌群覆蓋度指數(shù)(Good’s Coverage),以評估四個處理組內(nèi)物種豐富度和均勻度;同時用R 軟件(Version 2.15.3)的WGCNA、stats 和ggplot2 軟件包,基于Unifrac 距離[10]、選取貢獻率最大的主坐標繪制帶有95%置信區(qū)間的置信圈的主坐標分析(PCoA,Principal co-ordinates analysis)圖,以初步評估4個處理組之間的菌群差異。

用SILVA132(http:∕∕www.arb-silva.de∕)的SSUrRNA 數(shù)據(jù)庫在界(Kingdom)、門(Phylum)、綱(Class)、目(Order)、科(Family)、屬(Genus)和種(Species)7個水平對每個OTU 的序列做物種注釋分析,得到對應的物種信息和基于物種的豐度分布情況;基于R 軟件用MetaStat 統(tǒng)計分析方法對各組樣本的物種組成和群落結構進行差異顯著性檢驗,對組間的物種豐度數(shù)據(jù)進行假設檢驗得到P值,根據(jù)P值篩選出分組樣本間屬水平上具有顯著性差異的物種,對每一個物種的相對豐度進行標準化處理得到Z值,并據(jù)此繪制MetaStat 熱圖。

1.4 統(tǒng)計分析

用SPSS 16.0 軟件對4 組樣品的α 多樣性指數(shù)進行單因素方差分析(ANOVA),當P＜0.05 時則差異顯著。

2 結果與分析

2.1 冷鮮雞表面和內(nèi)部組織中細菌菌群結構的多樣性分析

對4 組樣品進行α多樣性分析,Good’s Coverage 指數(shù)為0.993—0.997,表明測序深度已基本覆蓋樣品中所有物種,測序結果能反映不同處理下5個冷鮮雞樣品中細菌菌群的組成情況。4個α多樣性指數(shù)的方差分析結果均表明,冷鮮雞肉冷藏初期(0 d)表面(E0)和內(nèi)部(I0)的菌群多樣性無顯著差異;冷藏3 d 后,樣品表面(E3)和內(nèi)部(I3)的菌群多樣性也無顯著差異(表1)。因此,用α多樣性分析評估雞肉表面和內(nèi)部組織中細菌菌群的豐富度和多樣性時,在冷藏過程中的2個取樣時間點上,內(nèi)部和表面的細菌菌群無顯著性差異。

表1 冷藏初期和冷藏3 d 時雞肉產(chǎn)品表面及內(nèi)部組織中細菌的α 多樣性指數(shù)Table 1 The α diversity indices of bacterial community isolated from surface and internal of cold storage chicken samples at the 0 and 3rd day

進而用β多樣性分析評價樣品間的微生物組成差異度,不同樣品的細菌群落結構組成越相似,則樣品間的距離越近。從不同分組間的聚散程度來看,I0 組和E0 組相比,95%置信橢圓范圍更大,說明冷鮮雞肉在冷藏初期,內(nèi)部組織中細菌的菌群結構差異比表面細菌菌群要大;冷藏3 d 后,E3 組的5個樣品間的距離較為接近,95%置信橢圓的范圍小于I3 組的置信橢圓范圍(圖1),說明冷藏3 d后5個雞肉樣品表面細菌的群落結構趨于一致,而內(nèi)部組織的細菌群落仍有差異。因此,用β多樣性分析法比較雞肉表面和內(nèi)部組織中細菌菌群的組成時,在兩個取樣時間點上均存在差異。

圖1 冷藏期間冷鮮雞肉表面和內(nèi)部菌群的PCoA 分析Fig.1 The principle co-ordinates analysis for bacterial community isolated from surface and internal of cold storage chicken samples

2.2 冷鮮雞表面和內(nèi)部組織中細菌菌群結構的差異

在菌屬水平上對菌群結構進行分析,結果表明,I0、E0、I3 和E3 組各注釋出456、363、457 和169個屬。假單胞菌屬(Pseudomonasspp.)、發(fā)光桿菌屬(Photobacteriumspp.)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacterspp.)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonasspp.)、弓形桿菌屬(Arcobacterspp.)、乳桿菌屬(Lactobacillusspp.)、不動桿菌屬(Acinetobacterspp.)、擬桿菌屬(Bacteroidesspp.)、羅斯氏菌屬(Roseburiaspp.)和梭桿菌屬(Fusobacteriumspp.)為主要優(yōu)勢菌屬(圖2)。其中,在冷鮮雞樣品儲藏初期內(nèi)部組織中較多存在的寡養(yǎng)單胞菌屬、弓形桿菌屬、乳桿菌屬、羅斯氏菌屬和梭桿菌屬并不在已報道的冷鮮雞表面主要菌屬[11]之列,進一步說明冷鮮雞產(chǎn)品表面細菌菌群與內(nèi)部組織中的細菌菌群組成結構可能存在差異。

圖2 冷藏期間冷鮮雞肉表面和內(nèi)部菌群在屬水平上的分布Fig.2 Genus distribution of bacterial community isolated from surface and internal of cold storage chicken samples

進而用MetaStat 法分析各組間豐度具有差異的菌屬,發(fā)現(xiàn)I0 組菌群結構有顯著不同的聚類,在冷藏初期,其中的假單胞屬菌(P＜0.01)和環(huán)絲菌屬(Brochothrixspp.)(P＜0.05)的相對豐度顯著低于表面菌群(E0 組),擬普雷沃菌屬(Alloprevotellaspp.)、阿克曼氏菌屬(Akkermansiaspp.)和Romboutsiaspp.的相對豐度顯著高于E0 組(P＜0.05)(圖2,E0 vs I0)。冷藏3 d 后,內(nèi)部組織細菌(I3 組)中的環(huán)絲菌屬的相對豐度顯著低于表面菌群(E3 組)(P＜0.01),而克雷伯氏菌屬(Klebsiellaspp.)(P＜0.01)、乳桿菌屬(Lactobacillusspp.)(P＜0.01)、Romboutsiaspp.(P＜0.05)和鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonasspp.)(P＜0.05)顯著高于表面菌群(E3 組)(圖3,E3 vs I3)。

圖3 冷鮮雞肉樣品表面和內(nèi)部菌群豐度的MetaStat 統(tǒng)計分析Fig.3 The MetaStat hotmap of bacterial community isolated from surface and internal of cold storage chicken samples

假單胞菌屬和環(huán)絲菌屬是雞肉腐敗過程中的主要污染菌屬[12-13],易在加工過程中污染肉類[14],因此在肉品表面的污染程度較內(nèi)部更嚴重。值得注意的是,假單胞菌是雞肉產(chǎn)品攜帶細菌的優(yōu)勢菌屬,在冷藏初期,其在雞肉表面和內(nèi)部的相對豐度分別為6.14%和33.12%(圖2),所以它的顯著差異會導致雞肉產(chǎn)品表面和內(nèi)部細菌菌群結構的差別。乳桿菌屬細菌盡管在真空包裝的冷鮮雞中曾有分離到[15],但在冷鮮雞表面菌群的多樣性分析研究中并不屬優(yōu)勢菌屬[11,16-17]。本研究中,乳桿菌屬在I0 組中的相對豐度排名第5(圖2),成為優(yōu)勢菌屬之一,盡管在冷藏3 d 后其相對豐度有所降低,但內(nèi)部組織中的相對豐度仍顯著高于表面菌群,可能是其在有氧條件下不易生長造成的。5 種非優(yōu)勢菌群中,克雷伯氏菌屬(Klebsiellaspp.)是一種人畜共患的條件致病菌[18],本研究發(fā)現(xiàn)其在雞肉內(nèi)部組織中的相對豐度高于表面,一方面有待更多的樣本進行驗證,另一方面提示應對雞肉產(chǎn)品充分加熱以保障其食用安全性;鞘氨醇單胞菌屬在冷藏初期內(nèi)部和外部均存在,隨著冷藏天數(shù)的增加,優(yōu)勢菌的快速繁殖,相對豐度下降,與已有的結果一致[19];此外,擬普雷沃菌屬、阿克曼氏菌屬和Romboutsia屬在雞肉中的研究較少,多報道于腸道來源[20-21],它們在雞肉表面和內(nèi)部的豐度差異是否與其生長特性有關,還有待進一步研究。

2.3 冷鮮雞冷藏過程中表面和內(nèi)部細菌的變化

冷鮮雞表面和內(nèi)部菌群在冷藏3 d 后豐度發(fā)生顯著變化的菌屬分別有8 種(圖3,E0 vs E3)和3 種(圖3,I0 vs I3)。在冷藏過程中豐度顯著變化的9個細菌屬中,環(huán)絲菌屬因其能適應低溫的環(huán)境,是冷藏雞肉中的優(yōu)勢腐敗菌[13],得以在冷藏雞肉的表面和內(nèi)部均顯著增殖;在雞肉表面和內(nèi)部均顯著減少的菌屬僅有Romboutsia屬一種,它是近幾年才開始研究的一種細菌屬,通常在人體腸道中發(fā)現(xiàn),被認為與患者的健康狀況有關,是潛在的腸道生物標志物[22]。此外,假單胞菌屬僅在雞肉內(nèi)部顯著增殖,而弓形桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬(Lactococcusspp.)、黃桿菌屬(Flavobacteriumspp.)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumspp.)和Lachnoclostridium屬僅在雞肉表面顯著降低。因此,冷藏期間冷鮮雞表面和內(nèi)部菌群豐度的變化趨勢有所不同。有報道表明:冷鮮雞冷藏過程中乳球菌屬細菌的相對豐度降低[23],與本研究結果不一致,是否由于取樣部位的不同而導致結果的不同,還需進一步驗證。此外,隨著冷藏時間的延長直至腐敗,雞肉表面和內(nèi)部細菌的變化差異尚需研究。

3 結論與討論

本研究用高通量測序技術比較了冷藏0 d 和3 d 的冷鮮雞表面及內(nèi)部細菌菌群結構,通過α多樣性分析未發(fā)現(xiàn)冷鮮雞表面和內(nèi)部組織中細菌菌群的多樣性有顯著差異,但β多樣性分析結果表明,在冷藏期間的兩個取樣時間點上,雞肉表面和內(nèi)部組織中細菌菌群的組成均存在差異。用MetaStat 法分析表明,優(yōu)勢菌屬中的假單胞菌屬和環(huán)絲菌屬在雞肉品表面的污染程度較內(nèi)部嚴重,而乳桿菌屬在內(nèi)部組織中的相對豐度顯著高于表面菌群;此外,克雷伯氏菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、擬普雷沃菌屬、阿克曼氏菌屬和Romboutsia屬等5個非優(yōu)勢菌屬的細菌在雞肉內(nèi)部組織中的相對豐度顯著高于表面。冷鮮雞不同部位的細菌菌群增殖趨勢分析結果表明,雞肉表面細菌在冷藏3 d 后僅有與腐敗相關的優(yōu)勢菌屬假單胞菌的豐度顯著升高,另有弓形桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、黃桿菌屬、慢生根瘤菌、lachnoclostridium屬和Romboutsia屬等7個屬的細菌的豐度顯著降低;雞肉內(nèi)部菌群中,與腐敗相關的假單胞菌和環(huán)絲菌屬顯著增殖,僅有Romboutsia屬1個菌屬顯著降低。

綜上,冷鮮雞肉產(chǎn)品表面和內(nèi)部組織中細菌菌群的結構及增殖趨勢存在差異,在研究和監(jiān)測中,應根據(jù)目標菌的污染來源而對雞肉產(chǎn)品的表面或內(nèi)部肌肉組織加以區(qū)分采樣。