張曉霞,張 琪,張皖靜,趙悅琪,吳文靜,楊 丹,許 燕,趙 凱3

(1 上海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海200234;2 上海博滿生物科技有限公司,上海201106;3上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所,上海201106)

豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus type,PCV)為圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬(Circovirus genus)的成員[1-2]。該病毒有兩個(gè)血清型,即豬圓環(huán)病毒1 型(PCV1)和豬圓環(huán)病毒2 型(PCV2)[3]。通常認(rèn)為,PCV1 不具致病性,但PCV2 具有致病性,是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome,PMWS)的主要病原[4]。PCV2 主要破壞豬的免疫系統(tǒng),造成機(jī)體免疫抑制,抵抗力降低,產(chǎn)生其他病原微生物的繼發(fā)感染[5-6]。PCV2 也與豬的其他多種臨床疾病密切相關(guān)[7-8]。自1997年在加拿大首次報(bào)道PMWS 以來(lái),PCV2 流行范圍不斷擴(kuò)大,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[9-11]。PCV2 感染豬的初期診斷與病豬的淘汰是PMWS 防治的關(guān)鍵,開發(fā)豬的PCV2 的定性、定量快速檢測(cè)方法很有必要。

目前,PCV2 的檢測(cè)技術(shù)主要有免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)和分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)。免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)、單層過(guò)氧化物酶試驗(yàn)(IPMA)等。其中,ELISA、IFA 和IPMA 主要用于PCV2 血清的檢測(cè)[12-13]。PCV2 的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)中最常見的是PCR 技術(shù),但常規(guī)PCR 一般只能定性,不能定量?；蛐酒ㄟ^(guò)熒光染料信號(hào)強(qiáng)度來(lái)推算每個(gè)探針對(duì)應(yīng)的樣品量,但是定量效果不好[14]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)(Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQPCR)是以定性PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的,是目前敏感性最高的核酸檢測(cè)和定量技術(shù)。FQ-PCR 技術(shù)是根據(jù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理,在PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR 進(jìn)程,最后通過(guò)Ct 值(Cycle threshod,循環(huán)閾值)和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板的起始濃度進(jìn)行定量[15-16]。Ct 值是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。每個(gè)模板的Ct 值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系,且起始拷貝數(shù)越多,Ct 值越小[17-19]。熒光定量PCR 靈敏度高、特異性強(qiáng)、無(wú)污染、快速、準(zhǔn)確,在臨床檢驗(yàn)及生命科學(xué)研究方面具有重要的意義[20-22]。本實(shí)驗(yàn)室已建立了PCV2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)方法,該方法已被美國(guó)佐治亞疾控中心所采用,且已經(jīng)研制出PCV2 熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒。本研究通過(guò)熒光定量PCR 技術(shù)對(duì)試劑盒主要原材料進(jìn)行優(yōu)化,以期為后續(xù)藥證申報(bào)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒來(lái)源

PCV2 毒株,由本實(shí)驗(yàn)室保存。陽(yáng)性參考品:PCV2 病毒培養(yǎng)液;陰性參考品:豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒(PRRSV)和豬瘟病毒(SFV),均由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑

熒光定量PCR 試劑盒原材料用的Taq 酶和PCR 反應(yīng)緩沖液兩者為配套試劑,共購(gòu)置3 套,Group 1:Taq DNA Polymerase(with PCR Reaction Buffer)(上海博彩生物科技有限公司);Group 2:Ex Taq?HotStar version(with PCR Reaction Buffer)[Takara 寶生物工程(上海)有限公司];Group 3:Ex Taq?(with PCR Reaction Buffer)[Takara 寶生物工程(上海)有限公司]。Uracil-DNA-Glycosylase(UDG)酶購(gòu)置于3 家公司,Group 1:上海博彩生物科技有限公司;Group 2:南京諾唯贊生物科技有限公司;Group 3:北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。熒光定量PCR 引物和TaqMan 探針由上海生工生物技術(shù)有限公司合成;病毒基因組DNA∕RNA 提取試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 引物和探針設(shè)計(jì)

以PCV2(BJ0804 株)ORF2 基因(GenBank 登錄號(hào)為EU921257.1)序列作為靶序列(全長(zhǎng)149 bp),使用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物和探針,使用Oligo DNAMAN 4.0 和Primer Analysis 進(jìn)行序列比對(duì)分析。引物與探針信息見表1。

表1 PCV2 引物和探針序列Table 1 Sequence of primers and probe of PCV2

1.4 PCV2 熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒使用方法

體系配置間:在此房間完成熒光定量PCR 總體系的配置。具體如下:于1.5 mL 離心管中加入Premix(內(nèi)含10 ×Buffer、dNTPs、MgCl2、Taq 酶、UDG 酶和Rox 矯正染料)11.9 μL,Primer1 和Primer2 各0.9 μL,Probe 0.4 μL,用滅菌雙蒸水補(bǔ)至20 μL。渦旋混勻,瞬時(shí)離心,然后將配置好的總體系分裝到8 連PCR 排管中。所有的熒光定量PCR 反應(yīng)均平行重復(fù)3 次。此房間不能放置陽(yáng)性模板或PCR 反應(yīng)產(chǎn)物。

模板間:將配好的PCR 體系在模板間加入模板DNA∕參考品∕對(duì)照品∕待檢樣品5 μL,立即蓋嚴(yán)管蓋,瞬離,避免產(chǎn)生氣泡。模板要按照拷貝數(shù)從低到高的順序依次加入且此房間不能放置PCR 體系配制的原料。

擴(kuò)增間:熒光定量PCR 反應(yīng)的擴(kuò)增程序?yàn)?7 ℃5 min;94 ℃預(yù)變性10 min;94 ℃變性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸31 s(此階段收集熒光信號(hào)),45個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增結(jié)果分析。

1.5 試劑盒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照的制備

陽(yáng)性對(duì)照是含有PCV2 靶基因片段的質(zhì)粒,用分光光度計(jì)測(cè)定其含量,并根據(jù)病毒學(xué)方法計(jì)算出質(zhì)粒濃度對(duì)應(yīng)的拷貝數(shù)。質(zhì)粒做10 倍梯度稀釋后作為模板進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增。

1.6 空白對(duì)照的制備

空白對(duì)照為無(wú)RNA 酶的無(wú)菌水。用移液器量取1 mL 的DEPC,補(bǔ)純化水至1000 mL,混勻,121 ℃、20 min 滅菌,室溫保存。

1.7 陽(yáng)性參考品、最低檢測(cè)限參考品和精密性參考品的制備

分取200 μL 已滅活的PCV2 病毒培養(yǎng)液的母液,按照病毒基因組DNA∕RNA 提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行核酸提取。按10 倍系列梯度稀釋,梯度為10-1至10-9,稀釋后分別進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè)。

1.8 Taq 酶和熒光定量PCR 反應(yīng)緩沖液的優(yōu)選試驗(yàn)

將3 家公司生產(chǎn)的Taq 酶和熒光定量PCR 反應(yīng)緩沖液,與UDG 酶按照供應(yīng)商說(shuō)明書進(jìn)行配制,分別加入濃度為1 ×107拷貝∕mL 和1 ×104拷貝∕mL PCV2 病毒DNA,按照設(shè)定程序進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè),重復(fù)3 次。評(píng)價(jià)3 家公司的Taq 酶和PCR 反應(yīng)緩沖液對(duì)PCR 反應(yīng)的影響。

1.9 UDG 酶的優(yōu)選試驗(yàn)

將3 家公司生產(chǎn)的UDG 酶與Taq 酶和PCR 反應(yīng)緩沖液按照供應(yīng)商說(shuō)明書進(jìn)行配制,分別加入含dUTP的PCV2 DNA 擴(kuò)增產(chǎn)物(濃度分別為1 ×107拷貝∕mL、1 ×106拷貝∕mL、1 ×105拷貝∕mL、1 ×104拷貝∕mL和1×103拷貝∕mL)或陽(yáng)性對(duì)照,按照說(shuō)明書設(shè)定程序進(jìn)行熒光PCR 檢測(cè),重復(fù)3 次。

1.10 陽(yáng)性對(duì)照

將PCV2 的質(zhì)粒按10 倍系列梯度稀釋,梯度為10-1至10-9,稀釋后分別進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果中Ct 值范圍為25—30 對(duì)應(yīng)的濃度梯度的PCV2 病毒質(zhì)粒等體積混合后為陽(yáng)性對(duì)照。置于-20 ℃條件下保存,長(zhǎng)期保存則置于-70 ℃條件下。

1.11 陽(yáng)性參考品、最低檢測(cè)限參考品和精密性參考品試驗(yàn)

將PCV2 的核酸DNA 按10 倍系列梯度稀釋,梯度為10-1至10-9,稀釋后分別進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增檢測(cè),重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 Taq 酶和熒光定量PCR 反應(yīng)緩沖液的優(yōu)選試驗(yàn)

如表2 所示,當(dāng)樣本濃度為106拷貝∕μL 時(shí),Group 1、Group 2 和Group 3 的Ct 值沒有顯著性差異,Group 2 的熒光增長(zhǎng)值高于Group 1 和Group 3;樣本濃度為102拷貝∕μL 時(shí),Group 1、Group 2 的Ct 值沒有顯著性差異,Group 2 的熒光增長(zhǎng)值高于Group 1,Group 3 未獲得Ct 值且無(wú)熒光增長(zhǎng)值。綜上,Group 2 的產(chǎn)品試劑效果最佳。

表2 3 家公司Taq 酶和PCR 反應(yīng)緩沖液的優(yōu)選Table 2 Optimization of Taq enzyme and PCR reaction buffer from three companies

2.2 UDG 酶的優(yōu)選試驗(yàn)

PCR 產(chǎn)物受污染會(huì)造成假陽(yáng)性。如表3 所示,根據(jù)熒光定量PCR 擴(kuò)增結(jié)果的Ct 值判斷,無(wú)論是含有dUTP 的高濃度PCR 產(chǎn)物還是低濃度PCR 產(chǎn)物,Group 1、Group 2 和Group 3 均能有效消除污染,之間沒有顯著性變化,綜合考慮質(zhì)量和價(jià)格因素,選擇Group 1。

表3 3 家公司UDG 酶的比對(duì)優(yōu)選Table 3 Comparison and optimization of UDG enzymes from three companies

2.3 陽(yáng)性參考品、最低檢測(cè)限參考品和精密性參考品試驗(yàn)

如圖1A 所示,檢測(cè)結(jié)果中Ct 值范圍為20—25 對(duì)應(yīng)的濃度梯度的PCV2 病毒核酸提取液等體積混合后作為陽(yáng)性參考品。檢測(cè)結(jié)果中Ct 值范圍為30—35 對(duì)應(yīng)的濃度梯度的PCV2 病毒核酸提取液等體積混合后作為最低檢測(cè)限參考品。檢測(cè)結(jié)果中Ct 值范圍為20—25 對(duì)應(yīng)的濃度梯度的PCV2 的病毒培養(yǎng)液(工作液)等體積混合后作為精密性參考品。以上參考品置于-20 ℃保存,長(zhǎng)期保存置于-70 ℃。

2.4 陰性參考品試驗(yàn)

對(duì)陰性參考品、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè),結(jié)果如圖1B 所示,陽(yáng)性對(duì)照有典型的S 型擴(kuò)增曲線、陰性參考品和陰性對(duì)照均無(wú)擴(kuò)增,說(shuō)明PRV、PRRSV、SFV 病毒與PCV2 病毒均無(wú)交叉反應(yīng)。

圖1 陽(yáng)性參考品、最低檢測(cè)限參考品、精密性參考品和陰性參考品的熒光定量PCR 擴(kuò)增Fig.1 Fluorescent quantitation PCR amplification of positive reference,the lowest detection limit reference,precision reference and negative reference

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)選擇不同的靶序列并設(shè)計(jì)了不同的引物和探針來(lái)檢測(cè)PCV2,發(fā)現(xiàn)已建立的熒光定量PCR 檢測(cè)方法PCV2 的檢測(cè)率比普通PCR 高18%。這不僅提供了一種快速定量檢測(cè)PCV2 的方法,也可應(yīng)用于評(píng)價(jià)PCV2 疫苗。

本研究對(duì)比了3 家公司生產(chǎn)的Taq 酶、PCR 反應(yīng)緩沖液試劑,結(jié)果表明Takara 寶生物工程(上海)有限公司生產(chǎn)的Taq 酶、PCR 反應(yīng)緩沖液的試劑擴(kuò)增效果最佳;在3 家公司生產(chǎn)的UDG 酶試劑的比對(duì)研究中,上海博彩生物科技有限公司所生產(chǎn)的UDG 酶的質(zhì)量和價(jià)格最優(yōu),能夠有效消除污染;在試劑盒參考品研究中,對(duì)陽(yáng)性參考品、最低檢測(cè)限參考品、精密性參考品進(jìn)行制備和定值,保證試劑盒在檢測(cè)應(yīng)用中的參照標(biāo)準(zhǔn)和靈敏度,使這種檢測(cè)方法更加標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范化;在試劑盒陰性參考品研究中,設(shè)置了PRV、PRRSV、SFV 3個(gè)病毒和陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行熒光定量PCR 試驗(yàn),結(jié)果顯示陰性參考品無(wú)交叉反應(yīng),說(shuō)明陰性參考品具有優(yōu)良的特異性;在試劑盒的質(zhì)控品研究中設(shè)置了陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照,保證試劑盒的質(zhì)量控制。下一步將會(huì)繼續(xù)進(jìn)行該試劑盒穩(wěn)定性、生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系、參考值、分析性能評(píng)估、臨床考核等等方面的研究。該研究可為業(yè)內(nèi)同行藥證申報(bào)提供參考。