周津 王代芳

摘 要：利用磁珠的分離與富集作用，以血糖儀為檢測器，建立一種檢測甲基對硫磷的便攜式傳感器。結(jié)果顯示：在1～316 nmol/L范圍內(nèi)血糖儀信號減弱值與目標濃度的對數(shù)值呈良好的線性關(guān)系，檢測限為1 nmol/L。該傳感器便攜可行，靈敏度高，重復性好，為有機磷農(nóng)藥甲基對硫磷的篩查提供了一種新方法。

關(guān)鍵詞：磁珠;血糖儀;有機磷農(nóng)藥甲基對硫磷

中圖分類號：X832;TP212 文獻標識碼：A 文章編號：1003-5168（2021）19-0037-03

Abstract： Based on the separation and enrichment of magnetic beads， a portable sensor was developed for the determination of Methyl Parathion by blood glucose meter. The results showed a good linear relationship in the range of 1～316 nmol/L， with a detection limit of 1 nmol/L. The sensor is portable， feasible， high sensitivity and good repeatability. It provides a new method for the screening of organophosphorus pesticide methyl parathion.

Keywords： PMPs;personal glucose meters;parathion methyl

有機磷農(nóng)藥甲基對硫磷在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的廣泛使用，導致農(nóng)作物中存在不同程度的農(nóng)藥殘留[1]。目前，常規(guī)的檢測方法[2-4]多使用氣相色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法以及液相色譜-質(zhì)譜法等，需要專門的儀器設(shè)備及標準品，對技術(shù)要求較高、檢測周期較長、檢測成本較高，不適合現(xiàn)場快速檢測及大批量樣品的快速篩查。血糖儀具有體積小便攜、檢測成本低、定量準確以及操作簡便等優(yōu)點，是比較成功的便攜式儀器[5]。本文以磁珠作為信號放大系統(tǒng)，血糖儀作為檢測器，構(gòu)建一種快速篩查有機磷農(nóng)藥甲基對硫磷的便攜式傳感器。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑。蔗糖（阿爾法埃莎中國有限公司）;Sulfo-SMCC、TCEP、蔗糖轉(zhuǎn)化酶和吐溫-20（西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司）;磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉（分析純，上海化學試劑公司）;鏈霉親和素修飾的磁性納米粒子（SA-PMPs）（美國普洛麥格公司）;本實驗用水為18.2 MΩ的超純水。

DNA均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成及純化（中國上海），序列如下（從左到右：5’到3’）：

3’-生物素修飾的捕獲DNA：

ATACCAGCTTATTCAATTGTGCAGGGGGAGGGGGATGGTGGCTCGCGGTGCGTGCGTGGTGGCTGTAGATAGTAAGTGCAATCTAAAAAAAAA-Biotin

3’-巰基修飾的信號DNA：

TGAATAAGCTGGTATAAAAAA-SH

1.1.2 儀器。Milli-Q超純水系統(tǒng)（Millipore，Bedford，USA）;PHS-3C型精密酸度計（上海大普儀器有限公司）;FINNPIPETTE可調(diào)式移液器（上海熱電儀器有限公司）;TGL-16型臺式高速冷凍離心機（湘儀離心機儀器有限公司）;羅氏羅康全血糖儀及其配套試紙Roche ACCU-CHEK? Active羅氏羅康全活力2型（德國羅氏診斷產(chǎn)品有限公司）。

1.1.3 溶液的配制。緩沖溶液A：0.1 mol/L氯化鈉，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液，pH為7.4，0.05%的吐溫-20;緩沖溶液B：0.1 mol/L氯化鈉，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液，pH為7.4;蔗糖溶液：1.0 mol/L的蔗糖溶液用緩沖溶液A配制并儲存于4 ℃待用。

1.2 方法

1.2.1 捕獲探針（CP-PMPs）的制備。首先移取0.6 mL濃度為1 mg/mL的修飾有鏈霉親和素的磁珠（SA-PMPs），用緩沖溶液B洗滌3次后重新溶解于0.6 mL的緩沖溶液B中。加入生物素修飾的捕獲DNA[6]并將混合物置于搖床上在室溫振蕩1 h，然后用緩沖溶液B洗滌磁珠3次并溶解于適量緩沖溶液B中，配制成終濃度為20 μmol/L的捕獲探針母液（CP-PMPs）。由于鏈霉親和素和生物素之間具有強親和力的特異性結(jié)合作用[7]，因此修飾有生物素的捕獲DNA能被固定結(jié)合在修飾有鏈霉親和素的磁珠SA-PMPs表面。隨后，用磁鐵吸附混合溶液中捕獲DNA與SA-PMPs反應所生成的磁珠復合物，并進一步用緩沖溶液B洗滌此磁珠復合物3次。最后，將洗滌后的磁珠復合物重新分散于緩沖溶液B中并儲存于4 ℃待用。

1.2.2 信號探針（SP-酶）的制備。根據(jù)文獻報道的方法[8]合成蔗糖轉(zhuǎn)化酶標記的信號探針（SP-invertase）。制備步驟簡述如下：首先，移取30 μL濃度為100 μmol/L的巰基修飾的信號DNA溶解于超純水;其次，加入2 μL濃度為3 mmol/L的TCEP和20 μL的pH為5.5、濃度為10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液，將混合溶液在室溫下反應1 h;最后，將反應混合物用緩沖溶液A透析得到活化后巰基修飾的信號DNA。為了使蔗糖轉(zhuǎn)化酶鍵合到信號DNA上，移取800 μL濃度為10 mg/mL的蔗糖轉(zhuǎn)化酶溶液，并稱取1 mg的Sulfo-SMCC同時加入緩沖溶液B中，將其混合并渦旋5 min后，將混合物置于搖床上在室溫下振蕩1 h。隨后用離心機進行離心分離，除去未溶解的Sulfo-SMCC。取上清液中用Sulfo-SMCC修飾后的蔗糖轉(zhuǎn)化酶溶液與上述活化后的信號DNA在室溫下混合孵化48 h。為了移去未反應的信號DNA，將混合溶液用緩沖溶液A透析得到純化后的信號探針（SP-invertase）。

1.2.3 目標物的檢測。取適量信號探針（SP-invertase）和捕獲探針（CP-PMPs）加入緩沖溶液B（pH為7.4）中，配成捕獲探針和信號探針終濃度為4 μmol/L、總體積為30 μL的測試溶液。在體系中，捕獲探針與信號探針首先組裝形成蔗糖轉(zhuǎn)化酶標記的DNA-PMPs。在沒有目標物甲基對硫磷存在的條件下，蔗糖轉(zhuǎn)化酶直接組裝到磁珠上，用磁鐵分離出體系中的磁珠-蔗糖轉(zhuǎn)化酶復合物。使用50 μL緩沖溶液B進一步洗滌固定在磁珠表面的蔗糖轉(zhuǎn)化酶復合物3次，并將其最終溶解于10 μL的緩沖溶液B中，然后向上述溶液中小心加入20 μL濃度為1.0 mol/L的蔗糖溶液，并在室溫下孵化20 min。體系中蔗糖轉(zhuǎn)化酶催化蔗糖水解生成葡萄糖，并能被血糖儀檢測到。此時，檢測到的血糖儀信號高，同時可觀察到血糖試紙背面的比色窗口顏色發(fā)生明顯的變化。當體系中加入不同濃度的目標物甲基對硫磷并在黑暗處于室溫條件下孵化1 h后，目標物與捕獲探針之間發(fā)生強有力的特異性結(jié)合，同時將信號探針從捕獲探針上解離下來。相同方法操作后，檢測到的血糖儀信號低，同時可觀察到血糖試紙背面的比色窗口顏色未發(fā)生明顯變化。需要注意的是，在到達20 min時立即將測試溶液置于100 ℃水浴鍋中滅活。采集在加入目標物有機磷農(nóng)藥前后血糖儀信號的變化數(shù)據(jù)用于定量分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應時間的影響

考察探針與目標物甲基對硫磷的特異性結(jié)合時間（0～1.5 h）對血糖儀信號減弱值[ΔS]的影響。當反應1 h之后體系的[ΔS]趨于穩(wěn)定，故本實驗選取反應時間為1 h，結(jié)果如圖1所示。

2.2 反應溫度的影響

考察酶催化反應溫度（25～60 ℃）對血糖儀信號增強值[ΔS]的影響。如圖2所示，當酶催化反應溫度低于45 ℃時，酶催化效果隨溫度上升而增強，并在45 ℃時達到最佳酶催化效果;在超過45 ℃后，酶催化效果大幅下降，說明高溫可能會使酶部分失活，不利于酶催化反應的進行。因此，本實驗選擇反應溫度為45 ℃。

2.3 探針濃度的影響

考察0～6.0 μmol/L探針的反應濃度對血糖儀信號增強值[ΔS]的影響。如圖3所示，選擇探針濃度分別為1.0 μmol/L、2.0 μmol/L、3.0 μmol/L、4.0 μmol/L、5.0 μmol/L和6.0 μmol/L。

2.4 校準曲線

在選定實驗條件下，在1～316 nmol/L的范圍內(nèi)，血糖儀信號減弱值[ΔS]與目標物濃度的對數(shù)值呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為[ΔS=3.894? 5lgC+8.614 2]，相關(guān)系數(shù)為0.998 8，檢出限可達1 nmol/L（圖4），低于很多文獻報道的方法。選擇目標物甲基對硫磷濃度為100 nmol/L時，重復制備5組傳感器進行平行實驗得到的相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）為4.8%，表明該傳感器具有良好的重現(xiàn)性。

3 結(jié)語

有機磷農(nóng)藥甲基對硫磷作為廣譜殺蟲劑引起了廣泛的關(guān)注與研究。本實驗構(gòu)建了一種基于血糖儀的便攜式傳感器，利用磁珠構(gòu)建信號放大系統(tǒng)，實現(xiàn)對低濃度有機磷農(nóng)藥甲基對硫磷的快速檢測，為農(nóng)藥殘留的快速篩查與檢測提供了一種新方法。

參考文獻：

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