夏霜莉，王 維，張冰琳，廖 陳，林 青，代 蓉

云南中醫(yī)藥大學 藥理教研室，云南 昆明 650500

缺血性腦卒中（ischemic stroke）的發(fā)病率占所有腦血管疾病的60%～80%，具有較高的致殘率和致死率，嚴重危害了人類的健康[1-2]。腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemic reperfusion injury，CIRI）是IS 后重要的病理損傷之一，涉及氧化應(yīng)激損傷、血腦屏障破壞、能量代謝異常和離子代謝紊亂等一系列復(fù)雜的病理過程[3-4]。課題組前期研究表明，天麻總酚（total polyphenols ofGastrodia elata，TPGE）中的多個酚性成分存在協(xié)同增效的作用，可通過干預(yù)CIRI 病理過程中的炎癥反應(yīng)、神經(jīng)細胞凋亡、神經(jīng)修復(fù)、血管新生等環(huán)節(jié)改善腦微環(huán)境[5-9]。由此可見，從單一角度去研究TPGE 抗CIRI 的作用難以完整地闡釋其作用機制。隨著近年來基因組學、轉(zhuǎn)錄組學、蛋白組學等組學技術(shù)的迅速發(fā)展，研究更注重生物系統(tǒng)的整體性，以反映機體在病理狀態(tài)以及藥物干預(yù)之后整體狀態(tài)的變化?；谥兴幎喑煞?、多靶點的特點，本研究借助轉(zhuǎn)錄組測序（RNA sequencing，RNA-seq）技術(shù)從基因水平進行研究，探尋正常、病變以及藥物干預(yù)后組織中的差異表達基因，并對測序結(jié)果進行生物信息學分析及驗證，以期闡明TPGE 改善CIRI 預(yù)后的可能靶基因及相關(guān)通路，進而闡明TPGE 治療CIRI 的分子作用機制。

1 材料

1.1 動物

成年SPF 級雄性SD 大鼠，體質(zhì)量250～300 g，8～10 周齡，共30 只，由成都達碩實驗動物有限公司提供，許可證號SCXK（川）2015-030。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，自由進食進水，室溫22～26 ℃，濕度55%，定時通風換氣，模擬標準晝夜系統(tǒng)即12 h 光照/12 h 黑夜。實驗中所有操作均獲得云南中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會的批準（批準號R-06202003）。

1.2 藥品、試劑

天麻購自云南省昭通市彝良縣原生態(tài)天麻種植專業(yè)合作社，經(jīng)云南中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室張潔副教授鑒定為蘭科植物天麻Gastrodia elataBlume 的干燥塊莖；腦中動脈栓塞/再灌注損傷（ middle cerebral artery embolization/reperfusion injury，MCAO/R）線栓（批號2838-50/A4，北京西濃科技有限公司）；異氟烷（批號2017180101，瑞沃德生命科技有限公司）；TRIzol（批號T101100，上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司公司）；三氯甲烷（批號0706106，上海申博化工）；異丙醇（批號20170901，天津市風船化學試劑科技有限公司）；RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號R123-01，賽默飛世爾科技公司）；定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）檢測試劑盒（批號31598800，Roche 公司）。

1.3 儀器

Illumina HiSeq 6000 型測序儀（美國Illumina公司）；Centrifuge 5424 R 型低溫離心機（德國Eppendorf 公司）；Agilent Technologies 型生物分析儀2100 系統(tǒng)（美國CA 公司）；V1824301 型小動物麻醉機（美國Matrx 公司）；Microm HM 型石蠟切片機（日本Thermo 公司）；Ti-S 倒置顯微鏡（日本尼康公司）；XS125A 型賽多利斯分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

2 方法

2.1 TPGE 的制備及劑量設(shè)置

取干燥天麻500 g 粉碎，置于回流冷凝裝置中，用3 倍生藥量95%乙醇溶液浸取3 次，浸取時間為2、1、0.5 h，合并3 次濾液，回收乙醇，得總浸膏即為TPGE（經(jīng)HPLC 測得天麻素質(zhì)量分數(shù)為0.35%，對羥基苯甲醇質(zhì)量分數(shù)為0.46%）。前期藥效學實驗分為TPGE 高（7.29 g/kg）、低（1.74 g/kg）2 個劑量組，連續(xù)ig 給予TPGE 14 d 后，結(jié)果顯示高劑量組具有顯著抗CIRI 的作用。故本實驗選擇7.29 g/kg 劑量，按提取率3.6%折算得本實驗TPGE的劑量為262.3 mg/kg。

2.2 模型的制備[10-11]

大鼠ip 10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，翻正反射消失后仰臥固定于手術(shù)臺，手術(shù)過程中用智能恒溫控制儀維持大鼠肛溫37 ℃，頸部剃毛并進行常規(guī)消毒，在頸正中偏左0.5 cm 處縱切口長約1.5 cm，分離右側(cè)頸總動脈，栓線經(jīng)頸總動脈、頸內(nèi)動脈插入大腦中動脈，微遇阻力時停止，栓線插入深度為18～20 mm，記錄大鼠腦缺血開始時間，缺血2 h 后，將線栓緩慢拔出以恢復(fù)缺血區(qū)供血造成再灌注，涂抹青霉素后縫合傷口。假手術(shù)組不插入線栓，其余手術(shù)操作相同。在缺血及再灌注期間保持室溫在25～30 ℃。

2.3 分組與給藥

將SD 大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、TPGE組（262.3 mg/kg），每組10 只，于再灌注后6 h 首次ig 給予TPGE，給藥體積均為1 mL/100 g 體質(zhì)量，1 次/d，連續(xù)14 d，假手術(shù)組與模型組ig 給予同體積溶媒。30 只動物均進行神經(jīng)行為學評分，其中每組隨機選擇3 只大鼠進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，每組隨機選擇4 只大鼠進行qPCR 實驗驗證。

2.4 神經(jīng)行為學評分

依據(jù) Longa 5 分法[11]、改良神經(jīng)功能（neurological severity scores，NSS）評分法[12]、平衡木行走實驗、攀繩實驗和步態(tài)分析[13-16]，對大鼠神經(jīng)功能及神經(jīng)損害程度進行評分。

2.5 RNA-seq 轉(zhuǎn)錄組測序分析

麻醉后頸椎脫臼處死大鼠，手術(shù)獲取各組大鼠缺血半球腦組織（含大鼠海馬、紋狀體、皮層區(qū)域），采用TRIzol 裂解液提取總RNA，利用RNA 6000 Nano kit檢測試劑盒對所提RNA的濃度和純度進行檢測，RNA 濃度和純度質(zhì)檢合格后，通過Oligo 磁珠富集帶有poly A 尾的mRNA，以片段化的mRNA為模板，合成雙鏈cDNA，對cDNA 進行末端修復(fù)、加A 尾并連接測序接頭，進行片段大小選擇，通過PCR 實驗富集得到最終的cDNA 文庫。最后在流動槽的各通道中加入cDNA 文庫，使用Illumina HiSeq 6000 測序儀進行測序分析，計算質(zhì)量分值。

2.6 基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析

對轉(zhuǎn)錄組測序的原始數(shù)據(jù)（raw data）進行過濾，篩選得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)信息，設(shè)定閾值為顯著性水平P＜0.05 和差異倍數(shù)︱log2Fold change︱≥2，對9個樣品中的mRNA 進行差異基因的篩選。以大鼠全基因組為背景和參照，以P＜0.05 為標準，對差異基因進行GO 富集分析和KEGG 代謝通路富集分析，從而獲取關(guān)鍵通路信息，并通過R 語言將相關(guān)信息進行可視化。

2.7 qPCR 驗證檢測

取各組大鼠缺血半球腦組織標本，液氮速凍，?80 ℃保存至使用。用qPCR 驗證預(yù)測的關(guān)鍵差異基因：Toll 樣受體9（Toll-like receptor 9，TLR9），髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88），核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB），腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α），單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1），白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β），白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6），自噬相關(guān)基因Becn-1、P62，凋亡調(diào)節(jié)因子LC-3、LC3 I/II，半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Caspase-3）和Bcl 2 相關(guān)X 凋亡調(diào)節(jié)因子（Bcl 2 associated X apoptosis regulator，Bax）。根據(jù)試劑盒說明書操作，使用TRIzol 提取腦組織中的總RNA，隨后進行逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。以 3-磷酸甘油醛脫氫酶（ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)源性參照基因，定量檢測目的基因的表達水平。各引物序列見表1。反應(yīng)條件為95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，反應(yīng)完畢，使用2-ΔΔCt法計算各基因的相對表達量。

3 結(jié)果

3.1 TPGE 對MCAO/R 模型大鼠行為學的影響

實驗結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠再灌注14 d Longa 5 分法、NSS 評分、平衡木行走實驗、攀繩實驗、步態(tài)分析實驗評分均升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01、0.001）；與模型組比較，TPGE 組再灌注14 d Longa 5 分法、NSS 評分、平衡木行走實驗、攀繩實驗、步態(tài)分析實驗評分均降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05、0.01），提示TPGE 可改善CIRI 引起的神經(jīng)功能損傷，恢復(fù)大鼠平衡能力，減輕恢復(fù)早期對稱自體感覺缺失情況，提高大鼠恢復(fù)期前肢的運動協(xié)調(diào)能力（表2）。

3.2 RNA-seq 轉(zhuǎn)錄組測序分析

3.2.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估 本實驗所建立的測序文庫中，9 個樣品的原始數(shù)據(jù)在4.5×107～6.1×107，總計5.01×108。每個cDNA 文庫平均獲得5.5×107個原始數(shù)據(jù)，對應(yīng)于73.99 Gb 的原始數(shù)據(jù)。經(jīng)過原始數(shù)據(jù)過濾后，約有4.95×108（98.9%）的原始數(shù)據(jù)作為高質(zhì)量的讀段（clean reads）被保留下來。9 個樣品的reads差異較小，質(zhì)量值≥20 的堿基所占百分比（Q20）≥97.43%，質(zhì)量值≥30 的堿基所占百分比（Q30）≥92.82%，表明測序結(jié)果較好，可用于后續(xù)的分析（表3）。

表1 待測靶基因引物序列Table 1 Primer sequences of target genes to be measured

表2 TPGE 對MCAO/R 模型大鼠行為學的影響 (±s,n=10)Table 2 Effects of TPGE on behavioral change in MCAO/R model rats (±s,n=10)

表2 TPGE 對MCAO/R 模型大鼠行為學的影響 (±s,n=10)Table 2 Effects of TPGE on behavioral change in MCAO/R model rats (±s,n=10)

與假手術(shù)組比較：??P＜0.01 ???P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01??P < 0.01 ???P < 0.001 vs sham group; *P < 0.05 **P < 0.01 vs model group

組別 Longa 5 分法 改良神經(jīng)功能評分 平衡木行走實驗 攀繩實驗 步態(tài)分析實驗假手術(shù) 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00模型 1.60±0.70??? 8.60±1.35??? 4.70±0.95??? 1.30±1.06?? 1.60±0.84???TPGE 0.40±0.52** 6.00±0.67** 1.80±1.03** 0.00±0.00* 0.10±0.32**

表3 各樣本cDNA 文庫測序數(shù)據(jù)Table 3 Sequencing data of each sample cDNA library

3.2.2 差異基因分析 采用DEseq 軟件，篩選出具有統(tǒng)計學意義的差異表達基因（︱log2Fold change︱≥2，P＜0.05）。數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明（表4、5 和圖1），與假手術(shù)組比較，模型組顯著上調(diào)的差異基因為561 個，顯著下調(diào)的差異基因為120 個；與模型組比較，TPGE 組顯著上調(diào)的差異基因為10個，顯著下調(diào)的差異基因為126 個。

表4 基因表達整體水平變化Table 4 Changes in overall level of gene expression

表5 TPGE 治療CIRI 大鼠部分顯著表達的差異基因Table 5 Some different significantly expressed genes in CIRI rats treated with TPGE

圖1 差異表達的mRNA 火山圖Fig.1 mRNA volcanogram of differential expression

3.3 GO 和KEGG 富集分析

對篩選出的136 個差異基因進行GO 和KEGG富集分析，并設(shè)置P＜0.05 為篩選標準。GO 富集分析主要包括生物過程、細胞組分和分子功能，結(jié)果顯示主要富集在免疫系統(tǒng)過程（immune system process）、炎癥反應(yīng)（inflammatory response）、調(diào)節(jié)刺激反應(yīng)（regulation of response to stimulus）、調(diào)控腫瘤壞死因子的產(chǎn)生（regulation of tumor necrosis factor production）和調(diào)控Toll 樣受體信號通路（regulation of Toll-like receptor signaling pathway）（圖2）。KEGG 主要富集在NOD 樣受體信號通路（NOD-like receptor signaling pathway）、Toll 樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway）、趨化因子信號通路（chemokine signaling pathway）和腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway），見圖2。

圖2 TPGE 干預(yù)后差異基因的GO (A) 和KEGG (B) 富集分析Fig.2 Enrichment analysis of GO (A) and KEGG (B) of differential genes after TPGE intervention

3.4 TPGE 對MCAO/R 模型大鼠關(guān)鍵基因mRNA表達的影響

給予TPGE 14 d 后，以GAPDH為內(nèi)參，采用qPCR 法對轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果的TLR-MyD88/NF-κB/TNF-α 通路中7 個炎癥關(guān)鍵基因TLR9、MyD88、NF-κB、TNF-α、MCP-1、IL-1β、IL-6及與自噬相關(guān)的Becn-1、P62、LC-3、LC3-I/II及凋亡相關(guān)的Caspase-3、Bax關(guān)鍵基因進行mRNA 表達水平的驗證。結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，模型組TLR9、MyD88、NF-κB、TNF-α、MCP-1、IL-1β、IL-6、Becn-1、P62、LC-3、LC3-I/II、Caspase-3、BaxmRNA 的表達上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05、0.01、0.001、0.000 1）；與模型組比較，TPGE可降低MyD88、NF-κB、TNF-α、MCP-1、IL-1β、P62、LC-3、LC3-I/II、BaxmRNA 的表達，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05、0.01、0.001、0.000 1），TLR9、IL-6、Becn-1、Caspase-3mRNA 的表達有下降趨勢，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表6。

表6 TPGE 對MCAO/R 模型大鼠關(guān)鍵基因mRNA 表達的影響 (±s，n=4)Table 6 Effects of TPGE on mRNA expression of key genes in MCAO/R model rats (±s，n=4)

表6 TPGE 對MCAO/R 模型大鼠關(guān)鍵基因mRNA 表達的影響 (±s，n=4)Table 6 Effects of TPGE on mRNA expression of key genes in MCAO/R model rats (±s，n=4)

與假手術(shù)組比較：?P＜0.05 ??P＜0.01 ???P＜0.001 ????P＜0.000 1；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001 ****P＜0.000 1?P < 0.05 ??P < 0.01 ???P < 0.001 ????P < 0.000 1 vs sham group; *P < 0.05 **P < 0.01 ***P < 0.001 ****P < 0.000 1 vs model group

基因 假手術(shù) 模型 TPGE TLR9 1.00±0.00 3.28±3.23? 2.13±1.02 MyD88 1.00±0.00 1.40±0.42? 0.94±0.35*NF-κB 1.00±0.00 2.25±0.87??? 1.35±0.82**TNF-α 1.00±0.00 1.66±0.70? 0.72±0.10**MCP-1 1.00±0.00 3.01±1.80?? 1.43±0.93**IL-1β 1.00±0.00 39.8±2.71???? 1.32±0.30****IL-6 1.00±0.00 2.48±1.11??? 2.29±0.84 Becn-1 1.00±0.00 2.07±0.98?? 1.56±0.33 P62 1.00±0.00 1.54±0.54?? 1.10±0.20**LC-3 1.00±0.00 2.95±0.26???? 1.88±0.53****LC3-I/II 1.00±0.00 1.39±0.40?? 0.96±0.15***Caspase-3 1.00±0.00 2.92±1.50??? 2.38±0.64 Bax 1.00±0.00 2.45±1.06???? 1.49±0.22**

4 討論

MCAO/R 模型可引起大鼠海馬、紋狀體、皮層等區(qū)域的神經(jīng)元損傷，導(dǎo)致感覺運動功能障礙，可模擬人CIRI 時感覺運動能力損傷，通過行為學評價可評估大鼠的感覺運動功能，預(yù)測腦損傷程度并進行藥效評價[17]。Longa 5 分法可從整體上反映動物神經(jīng)損傷程度，進行定性和半定量的評價，結(jié)合平衡木行走實驗、攀繩實驗、步態(tài)分析實驗行為學評分可判斷運動功能的整合性、協(xié)調(diào)性，綜合評價感覺運動能力。本實驗觀察TPGE 對MCAO/R 模型大鼠干預(yù)14 d 的作用，與模型組比較，TPGE 組Longa 5 分法、NSS 評分法、平衡木行走實驗、攀繩實驗、步態(tài)分析實驗行為學評分顯著降低（P＜0.05、0.01），表明TPGE 可減輕MCAO/R 模型大鼠的神經(jīng)元損傷，促進運動功能恢復(fù)。

轉(zhuǎn)錄組學能從整體水平上探索細胞中所有基因轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律，通過基因表達比較正常、病變以及藥物干預(yù)后的組織中大量相關(guān)基因的差異表達，以明確藥物的主要作用靶點。本實驗采用RNA-seq 高通量測序技術(shù)對假手術(shù)組、模型組、TPGE 干預(yù)14 d 組大鼠腦組織進行轉(zhuǎn)錄組測序，確定了在TPGE 作用下CIRI 大鼠缺血側(cè)腦組織較為全面、動態(tài)的基因含量變化過程。通過對模型組與假手術(shù)組及TPGE 組與模型組數(shù)據(jù)進行深度挖掘分析，在2 個組合的差異表達基因中，找到了136 個重疊基因，對這些差異基因進行GO 功能注釋和KEGG 通路富集分析，結(jié)果表明，模型組與假手術(shù)組比較，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析共篩選出681 個差異表達基因，其中顯著上調(diào)的差異基因為561 個，顯著下調(diào)的差異基因為120 個；TPGE 干預(yù)后，可回調(diào)136個差異基因，其中，顯著下調(diào)的差異基因為126 個，顯著上調(diào)的差異基因為10 個，分析得到Itgam、Tnfsf13b、Itgb2、Cd86、Cxcl16、Cxcl10、Irf7、Tlr4、Csf2rb、Csf3r、TLR9等核心差異基因；差異基因顯著富集于炎癥反應(yīng)、凋亡反應(yīng)，趨化因子、腫瘤壞死因子、Toll 樣受體等信號通路，提示TPGE 可能通過調(diào)控TLR9、MyD88、NF-κB等多個基因參與CIRI 后炎癥、凋亡、自噬等修復(fù)過程。

已有的大量研究表明炎性損傷在CIRI 的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用[18-19]。過度炎癥反應(yīng)是缺血后腦損傷重要的病理生理機制，腦缺血后小膠質(zhì)細胞被激活，局部趨化因子、黏附分子及炎癥因子表達上調(diào)促進了缺血性損傷向炎癥性損傷轉(zhuǎn)化[20]。近年研究發(fā)現(xiàn)，先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs）通過參與炎癥反應(yīng)介導(dǎo)了缺血性損傷，TLR9 是Toll 樣受體家族的重要成員，定位在細胞內(nèi)的內(nèi)涵體膜上，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中TLR9 主要表達于小膠質(zhì)細胞，TLR9 可通過Toll/IL-1 受體結(jié)構(gòu)域結(jié)合MyD88 銜接子樣接頭蛋白MAL（也稱為TI-RAP），從而識別和募集MyD88，使 IL-1 受體相關(guān)激酶（IL-1 receptorassociated kinases，IRAKs）磷酸化，然后與下游的腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（tumor necrosis factor receptor associated factor 6，TRAF6）相互識別作用，從而激活NF-κB 信號通路，促進NF-κB 進入細胞核，增加促炎基因的轉(zhuǎn)錄與表達，促進炎癥因子如TNF-α、IL-1 和IL-6 的釋放，啟動并放大炎癥反應(yīng)[20-23]。上調(diào)的炎癥因子反過來可刺激NF-κB 的再次活化，引起炎性損傷，導(dǎo)致細胞凋亡，從而進一步加重腦損傷，因此應(yīng)用藥物抑制由于腦梗死導(dǎo)致的NF-κB 相關(guān)信號通路的激活，可減輕過度炎癥反應(yīng)所引起的神經(jīng)元損傷[21-23]。本研究選取TLR-MyD88/NF-κB/TNF-α 通路中7 個關(guān)鍵基因TLR9、MyD88、NF-κB、TNF-α、MCP-1、IL-1β、IL-6及與自噬相關(guān)的Becn-1、P62、LC-3、LC3-I/II及凋亡相關(guān)的Caspase-3、Bax關(guān)鍵基因進行qPCR 驗證。結(jié)果表明，模型組與假手術(shù)組相比TLR9、MyD88、NF-κB、TNF-α、MCP-1、IL-1β、IL-6mRNA 表達升高，提示MCAO/R 模型大鼠TLRs/NF-κB 信號通路被激活，引起了過度炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腦缺血損傷；TPGE 干預(yù)后MyD88、NF-κB、TNF-α、MCP-1、IL-1βmRNA 的表達顯著減少，TLR9、IL-6mRNA 的表達有下降的趨勢，提示TPGE 可通過抑制MyD88/NF-κB/TNF-α 信號通路減少相關(guān)炎癥因子在缺血腦組織中的表達，發(fā)揮腦保護作用。MyD88上游的TLR9水平只有下降的趨勢，因TLR2、3、4、7、9都可通過MyD88 依賴性和非依賴性信號傳導(dǎo)途徑激活腦缺血后的炎癥通路，驗證與分析的差異表明存在作用于其他TLRs的可能性，后續(xù)將繼續(xù)進行研究。

腦缺血后炎癥反應(yīng)與細胞自噬和凋亡之間存在密切聯(lián)系，多種TLR 通過連接蛋白MyD88 的配體在誘發(fā)炎癥反應(yīng)的同時，能夠誘導(dǎo)細胞自噬，自噬激活對CIRI 的作用是雙向的，在腦缺血的最初階段，自噬作為一種修復(fù)機制，被激活以后可以消除在神經(jīng)元細胞內(nèi)積累的受損蛋白。然而，自噬被過度激活后，可促進細胞凋亡[22-23]。損傷變性、壞死或者凋亡的細胞這些危險信號刺激NF-κB 的再次活化，形成惡性循環(huán)[24-25]。Becn-1、P62、LC3是參與自噬的關(guān)鍵蛋白，調(diào)節(jié)自噬小體的形成和發(fā)展，是自噬檢測的重要指標。LC3 包括LC3-I 和LC3-II 兩種存在形式，LC3-I 與LC3-II 的比值改變可間接判斷自噬是否發(fā)生，其比值下降提示自噬活性減弱；反之則說明自噬活性增強[26]。Bax 是促凋亡蛋白，可使線粒體的通透性增加，進而釋放細胞色素C 進入細胞質(zhì)，最終激活Caspase-3 后造成細胞凋亡。Caspase 家族是凋亡過程中最重要的蛋白酶，凋亡的最后實施是通過Caspase 的激活引發(fā)的“瀑布式”的級聯(lián)反應(yīng)而實現(xiàn)的，而Caspase-3 是Caspase 級聯(lián)反應(yīng)中下行的最重要的凋亡執(zhí)行蛋白酶，在不同程序啟動的細胞凋亡過程中起最后的“觸發(fā)點”作用[27]。激活的Caspase-3 可以通過裂解DNA 依賴的蛋白激酶、細胞骨架蛋白及其他Caspase相關(guān)底物蛋白等機制，改變細胞結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致細胞凋亡的發(fā)生，加重了CIRI 的病理過程[28]。本研究結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，模型組Becn-1、P62、LC-3、LC3-I/II、Caspase-3、BaxmRNA 的表達上調(diào)；與模型組相比較，TPGE 可顯著降低P62、LC-3、LC3-I/II、BaxmRNA 的表達，Becn-1、Caspase-3的表達有下降的趨勢，提示TPGE 能夠減輕由CIRI激活的自噬效應(yīng)，抑制神經(jīng)細胞凋亡，結(jié)合TPGE可抑制MyD88/NF-κB/TNF-α信號通路的作用機制，提示其作用可能與抑制該信號通路相關(guān)。

綜上所述，研究表明TPGE 具有抗大鼠CIRI的作用，轉(zhuǎn)錄組學特征提示其抗CIRI 的關(guān)鍵差異基因及信號通路主要集中在炎癥反應(yīng)、自噬與凋亡、免疫應(yīng)答過程，通過干預(yù)MyD88/NF-κB/TNF-α信號通路介導(dǎo)發(fā)揮作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突