徐 寧，劉木華，袁海超，黃雙根，王 曉，趙進(jìn)輝*，陳 健，王 婷，胡 圍，宋怡欣

1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院/生物光電及應(yīng)用重點(diǎn)試驗(yàn)室，江西 南昌 330045 2. 江西省果蔬菜后處理關(guān)鍵技術(shù)與質(zhì)量安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江西 南昌 330045

引 言

磺胺二甲嘧啶(sulfadimidine,SM-2)和磺胺吡啶(sulfapyridine,SPD)都屬于磺胺類藥物，是人工合成的價(jià)格低、性質(zhì)穩(wěn)定、應(yīng)用簡(jiǎn)單的抗菌藥[1]，對(duì)許多病菌均有抑制作用，對(duì)細(xì)菌感染性疾病能產(chǎn)生一定的預(yù)防和治療作用[2]。很多養(yǎng)殖戶為了提高動(dòng)物對(duì)疾病的預(yù)防能力，在飼養(yǎng)過(guò)程中常將此類抗生素添加到飼料中[3]。每年，磺胺類藥物的使用量都非?？捎^，例如2018年養(yǎng)殖使用的獸用抗菌藥中，磺胺類藥物制劑數(shù)量最多，多達(dá)38種，但是此類抗生素在動(dòng)物體內(nèi)代謝較慢、容易累積，進(jìn)而導(dǎo)致禽肉體內(nèi)殘留量過(guò)高[4]，如果人們長(zhǎng)期食用此類禽肉，殘留的抗生素將會(huì)隨著禽肉進(jìn)入體內(nèi)、產(chǎn)生積累，將嚴(yán)重影響人體健康，甚至對(duì)血液系統(tǒng)或者免疫系統(tǒng)造成損壞[5]。

目前常用的磺胺類抗生素殘留檢測(cè)方法包括： 固相萃取—高效液相色譜[6]、高效液相色譜-熒光檢測(cè)[7]、酶聯(lián)免疫法[8]等。上述方法雖然能檢測(cè)磺胺類抗生素的殘留，但是對(duì)樣品的前處理要求較高，檢測(cè)過(guò)程相對(duì)比較復(fù)雜，不能同時(shí)滿足快速、高效的檢測(cè)要求。隨著生活水平的提高，人們對(duì)食品安全問(wèn)題越來(lái)越重視，需要有一種方法能夠快速檢測(cè)食品是否安全。因此，快速檢測(cè)雞肉中磺胺類抗生素殘留的方法具有重要的研究?jī)r(jià)值。

本研究采用的表面增強(qiáng)拉曼光譜(surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)是一種檢測(cè)速度快、敏感性高、樣品制備簡(jiǎn)單的新技術(shù)，它能將原始拉曼光譜增強(qiáng)105～106倍。因此，SERS技術(shù)常被運(yùn)用到食品的快速檢測(cè)中。例如馬海寬[9]運(yùn)用SERS技術(shù)，用乙酸乙酯提取某些干擾物質(zhì)，用銀膠作為增強(qiáng)基底，對(duì)魚肉中磺胺類抗生素的殘留進(jìn)行快速檢測(cè)，確定了磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶的最低檢測(cè)限分別為0.16和0.59 mg·L-1。有研究以金溶膠為表面增強(qiáng)活性基底，運(yùn)用SERS技術(shù)對(duì)兩類硝基呋喃類藥物進(jìn)行快速鑒別,確定了鑒別峰為1 420和1 456 cm-1，最低檢測(cè)限為5 ppm。韓斯琴高娃[10]運(yùn)用SERS技術(shù)檢測(cè)牛奶中SM-2的殘留，確定了SM-2在牛奶中的拉曼特征峰以及最低檢測(cè)限。雖然目前已有運(yùn)用SERS技術(shù)檢測(cè)食品中磺胺類抗生素的研究，但一般用來(lái)檢測(cè)是否存在某一種抗生素的殘留。同時(shí)檢測(cè)多種磺胺類抗生素的殘留一般運(yùn)用固相萃取、高效液相等相關(guān)方法[11-12]，未見運(yùn)用SERS技術(shù)鑒別雞肉中SM-2和SPD兩種磺胺類抗生素殘留的研究。本研究以金溶膠為增強(qiáng)基底，NaCl溶液為活性劑采集雞肉的SERS譜，實(shí)現(xiàn)快速鑒別雞肉中殘留的兩種抗生素，即： SPD和SM-2。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

DXRTM顯微拉曼光譜儀(美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司)； T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)； JK-50B超聲波清洗器(合肥金尼克機(jī)械制造有限公司)； FA1004B電子天平(北京科偉永興儀器有限公司)； ZNCL-T智能恒溫磁力攪拌器(鄭州市亞榮儀器有限公司)； FD-1A-50真空冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康試驗(yàn)儀器有限公司)。

三水合四氯金酸(≥49.0%，西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司)； SM-2(純度99.4%，英國(guó)政府化學(xué)家試驗(yàn)室)； SPD(純度99.4%，英國(guó)政府化學(xué)家試驗(yàn)室)； 檸檬酸三鈉和氯化鈉(NaCl)，分析純，購(gòu)于西隴化工股份有限公司。

1.2 方法

(1)標(biāo)準(zhǔn)溶液(SM-2溶液、SPD溶液)的配制： 將25 mg標(biāo)準(zhǔn)品溶解于500 mL超純水，得到兩種50 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。利用此標(biāo)準(zhǔn)溶液配制其他不同濃度的SM-2溶液、SPD溶液和SM-2+SPD混合溶液。

(2)雞肉預(yù)處理： 先將雞胸肉(購(gòu)于江西省南昌華潤(rùn)萬(wàn)家超市)放在冰箱冷凍(溫度為-20 ℃)5 h，用切片機(jī)切片，然后放在真空冷凍干燥器中干燥48 h，取出備用。分別用SM-2標(biāo)準(zhǔn)溶液、SPD標(biāo)準(zhǔn)溶液、SPD+SM-2混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和超純水浸泡干燥后的雞胸肉，然后晾干，得到三類加標(biāo)的雞肉樣本： 含SM-2的雞肉、含SPD的雞肉、含SM-2+SPD的雞肉，和一類未加標(biāo)的雞肉樣本： 不含SPD和SM-2的雞肉(即空白雞肉)。試驗(yàn)共得到400個(gè)樣本用來(lái)進(jìn)行分類鑒別，其中，267個(gè)樣本作為訓(xùn)練集，133個(gè)樣本作為測(cè)試集。

(3)金溶膠的制備[13]： 參考Frens方法制備高分散性的金溶膠，以三水合四氯金酸為金源，通過(guò)改變還原劑檸檬酸鈉的加入量來(lái)改變金溶膠粒徑大小。分別將四個(gè)含有100 mL濃度為1 mmol·L-1四氯金酸溶液的圓底燒瓶放至智能恒溫磁力攪拌器中加熱，當(dāng)四氯金酸溶液沸騰時(shí)分別迅速加入3.5，3.7，3.9和4.1 mL濃度為1%的檸檬酸三鈉溶液，打開旋轉(zhuǎn)按鈕，帶動(dòng)圓底燒瓶中的攪拌子劇烈旋轉(zhuǎn)，15分鐘后，取出圓底燒瓶，將金溶膠倒入燒杯中冷卻至室溫。上述步驟共制得4種粒徑不同的金溶膠。

(4)紫外-可見光譜： 取1 mL樣本(金溶膠或金溶膠+SPD+SM-2+NaCl溶液)，加3 mL超純水稀釋，用紫外分光光度計(jì)對(duì)稀釋后的樣本采集400～900 nm范圍的紫外-可見光譜。

(5)拉曼光譜： 將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的雞肉樣本放到載玻片上，把500 μL金溶膠和100 μL NaCl溶液一起加入微型離心管，震蕩后滴加到雞肉上，并將載玻片放到載玻臺(tái)上，吸附5 min后，用DXRTM顯微拉曼光譜儀采集拉曼光譜。用于優(yōu)化試驗(yàn)的樣本每個(gè)采集5次，取其平均值作為該樣本的拉曼光譜。用于分類鑒別的樣本每個(gè)采集一次作為該樣本的拉曼光譜。

顯微拉曼光譜儀的參數(shù)設(shè)置： 激光能量： 20 mW； 采集曝光時(shí)間： 10 s； 預(yù)覽采集時(shí)間： 10 s； 樣品曝光： 10次； 背景曝光： 16次，選擇SERS研究范圍為400～1 800 cm-1。

(6)樣本的優(yōu)化試驗(yàn)： 采用單因素實(shí)驗(yàn)方法對(duì)試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，其中包括金溶膠粒徑(通過(guò)改變檸檬酸鈉的量控制)、金溶膠加入量、NaCl溶液加入量以及吸附時(shí)間，通過(guò)比較937和1 188 cm-1處的SERS信號(hào)強(qiáng)度來(lái)確定最優(yōu)試驗(yàn)條件。

制備金溶膠的檸檬酸鈉加入量的優(yōu)化： 分別將500 μL用3.5，3.7，3.9和4.1 mL檸檬酸鈉制備的金溶膠與100 μL NaCl溶液混合均勻后滴加到放在載玻片上的含SM-2+SPD的雞肉上，然后將載玻片放到載玻臺(tái)上，吸附5 min后，采集拉曼光譜。每個(gè)樣本采集5次，取其平均值作為該樣本的拉曼光譜。比較937和1 188 cm-1處的SERS信號(hào)強(qiáng)度。

金溶膠加入量的優(yōu)化： 分別將400，450，500和550 μL的金溶膠與100 μL NaCl溶液混合均勻后滴加到放在載玻片上的含SM-2+SPD的雞肉上，然后將載玻片放到載玻臺(tái)上，吸附5 min后，采集拉曼光譜。每個(gè)樣本采集5次，取其平均值作為該樣本的拉曼光譜。比較937和1 188 cm-1的SERS信號(hào)強(qiáng)度。

NaCl溶液加入量的優(yōu)化： 將500 μL金溶膠分別與50，100，150和200 μL NaCl溶液混合均勻后滴加到放在載玻片上的含SM-2+SPD的雞肉上，然后將載玻片放到載玻臺(tái)上，吸附5 min后，采集拉曼光譜。每個(gè)樣本采集5次，取其平均值作為該樣本的拉曼光譜。比較937和1 188 cm-1的SERS信號(hào)強(qiáng)度。

吸附時(shí)間的優(yōu)化： 將500 μL金溶膠與100 μL NaCl溶液混合均勻后滴加到放在載玻片上的含SM-2+SPD的雞肉上，然后將載玻片放到載玻臺(tái)上，分別吸附1，5，10和15 min后，采集拉曼光譜。每個(gè)樣本采集5次，取其平均值作為該樣本的拉曼光譜。比較937和1 188 cm-1處的SERS信號(hào)強(qiáng)度。

(7)數(shù)據(jù)處理方法： 首先采用自適應(yīng)迭代懲罰最小二乘法(air-PLS)、歸一化和二階導(dǎo)數(shù)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。然后用主成分分析(principal component analysis，PCA)提取特征向量，以前四個(gè)PCA得分值作為支持向量機(jī)(support vector machine，SVM)分類模型的輸入值建立基于C-SVC類型的SVM分類模型，對(duì)樣本進(jìn)行分類鑒別。

2 結(jié)果與討論

2.1 金溶膠活性基底的紫外-可見吸收光譜分析

增強(qiáng)基底的性質(zhì)是影響SERS信號(hào)強(qiáng)度的重要因素之一，增強(qiáng)基底的制作方法、制作材料以及外界條件等諸多因素都可能影響增強(qiáng)基底的性質(zhì)，以致SERS信號(hào)強(qiáng)度發(fā)生改變[14]。常用的增強(qiáng)基底主要有金溶膠和銀溶膠，由于金溶膠制備簡(jiǎn)單，且具有良好的增強(qiáng)性能，所以本試驗(yàn)采用金溶膠作為增強(qiáng)基底。

分別采集金溶膠、金溶膠+SPD+SM-2+NaCl的紫外-可見光譜，得到圖1中的曲線a和曲線b。由曲線a可知，加入3.7 mL檸檬酸鈉制備的金溶膠的最大吸收峰在555 nm處，在其他位置沒(méi)有出現(xiàn)明顯的吸收峰，說(shuō)明金溶膠在其他地方?jīng)]有發(fā)生明顯的凝聚[15]。對(duì)比曲線a和曲線b，當(dāng)金溶膠中加入SPD+SM-2混合溶液和NaCl溶液后，由于SPD分子、SM-2分子或Cl-與金納米粒子相結(jié)合，使得納米粒子表面等離子體共振性質(zhì)發(fā)生改變，從而改變了金納米粒子尺寸或聚集狀態(tài)，從而導(dǎo)致了吸收峰發(fā)生紅移，峰形變寬[16]。

圖1 金溶膠(a)和金溶膠+SM-2+SPD+NaCl(b)的 紫外-可見吸收光譜圖

2.2 樣本的SERS光譜特征分析

采集SPD標(biāo)準(zhǔn)品和SM-2標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼光譜，結(jié)果如圖2曲線a和b所示。對(duì)金溶膠+NaCl溶液、SM-2水溶液+金溶膠+NaCl溶液、SPD水溶液+金溶膠+NaCl溶液和SM-2+SPD水溶液+金溶膠+NaCl溶液進(jìn)行測(cè)定，得到的SERS光譜分別如圖3曲線a，b，c和d所示。由圖2曲線a可知，SPD標(biāo)準(zhǔn)品在548，569，726，824，943，1 031和1 450 cm-1處有的特征峰。由圖3曲線c可知，SPD水溶液+金溶膠+NaCl溶液在569，820，946和1 455 cm-1處有突出的特征峰，同時(shí)圖3曲線d在569，946和1 455 cm-1處有突出的特征峰，而曲線a在這些位移處沒(méi)有突出的特征峰。將SPD標(biāo)準(zhǔn)品配制成水溶液并加入金溶膠與NaCl溶液后，由于SPD分子或Cl-1與金溶膠結(jié)合，產(chǎn)生了表面等離子體共振，使得943和1 450 cm-1處的特征峰發(fā)生了紅移，紅移至946和1 455 cm-1。因此，可以根據(jù)569，946和1 455 cm-1處是否有突出的特征峰來(lái)判斷水溶液中是否存在SPD抗生素的殘留。

由圖2曲線b可知，SM-2標(biāo)準(zhǔn)品在578，825，1 188，1 385和1 594 cm-1處有突出的特征峰。由圖3曲線b可知，SM-2水溶液+金溶膠+NaCl溶液在823，1 178，1 378和1 590 cm-1處有突出的特征峰，同時(shí)圖3曲線d在1 178，1 378和1 590 cm-1處有突出的特征峰，而曲線a在這些位移處并沒(méi)有突出的特征峰。將SM-2配制成水溶液并加入金溶膠與NaCl溶液后，由于SM-2分子或Cl-1與金溶膠結(jié)合，產(chǎn)生了表面等離子體共振，使1 188，1 385和1 594 cm-1處的特征峰發(fā)生了藍(lán)移。因此，可以根據(jù)1 178，1 378和1 590 cm-1處是否有突出的特征峰來(lái)判斷水溶液中是否有SM-2抗生素的殘留。由于圖3曲線d在822 cm-1處有突出的特征峰，曲線b823 cm-1處和曲線c820 cm-1處都有突出的特征峰，因此無(wú)法確定水溶液中822 cm-1處的特征峰究竟是SPD的特征峰，還是SM-2的特征峰。

圖2 SPD標(biāo)準(zhǔn)品(a)和SM-2標(biāo)準(zhǔn)品(b)的SERS圖Fig.2 The SERS of SPD (a) and SM-2 (b)

圖3 金溶膠+NaCl溶液(a)，SM-2水溶液+金溶膠+NaCl溶液(b)，SPD水溶液+金溶膠+NaCl溶液(c)和SM-2+SPD水溶液+金溶膠+NaCl溶液(d)的SERS圖

分別對(duì)空白雞肉、含SM-2的雞肉、含SPD的雞肉和對(duì)含SM-2和SPD的雞肉進(jìn)行SERS信號(hào)的采集，分別如圖4中曲線a—d所示。比較曲線a，b，c和d，曲線d在697，823，937，1 078，1 188和1 271 cm-1處有突出的特征峰，而曲線a在這些位置并沒(méi)有特征峰，因此這些峰可能是抗生素的特征峰。觀察曲線b可知，在823，1 188，1 220和1 271 cm-1處有明顯的特征峰，而曲線a在這些位置沒(méi)有明顯的特征峰，因此根據(jù)曲線b和d可知823，1 188和1 271 cm-1處的峰可能是SM-2的特征峰。但是由圖2和圖3可知，SM-2標(biāo)準(zhǔn)品的特征峰在825，1 188，1 385和1 594 cm-1處，SM-2水溶液的特征峰在1 178，1 378和1 590 cm-1處，因此可以確定1 188 cm-1處的特征峰為SM-2在雞肉中的特征峰。觀察曲線c可知，在697，937和1 078 cm-1處有明顯的特征峰，而曲線a中這些位置并沒(méi)有特征峰，同時(shí)與圖2、圖3比較可以確定，SPD分子與金溶膠、NaCl溶液或者雞肉相互影響，使得SPD在雞肉中的拉曼特征峰發(fā)生藍(lán)移，由946 cm-1藍(lán)移至 937 cm-1處。因此，可用1 188 cm-1處的特征峰用來(lái)判別雞肉中是否含有SM-2的殘留，937 cm-1處的特征峰來(lái)判別雞肉中是否含有SPD的殘留。

圖4 空白雞肉+金溶膠+NaCl溶液(a)，含SM-2的雞肉+金溶膠+NaCl溶液(b)，含SPD的雞肉+金溶膠+NaCl溶液(c)和含SPD+SM-2的雞肉+金溶膠+NaCl溶液(d)

2.3 SERS信號(hào)檢測(cè)條件的優(yōu)化

單因素實(shí)驗(yàn)方法用來(lái)對(duì)試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，因?yàn)?37和1 188 cm-1處的拉曼特征峰可以判定SPD和SM-2在雞肉中的殘留，所以本試驗(yàn)選擇通過(guò)比較937和1 188 cm-1處的SERS信號(hào)強(qiáng)度來(lái)確定最優(yōu)試驗(yàn)條件。

金溶膠的粒徑大小對(duì)SERS信號(hào)的增強(qiáng)效果有著顯著的差異。本試驗(yàn)制備了四種不同粒徑的金溶膠，分別將四種金溶膠作為活性基底，對(duì)雞肉的SERS信號(hào)進(jìn)行采集。由圖5可知，937和1 188 cm-1處的SERS信號(hào)強(qiáng)度隨著檸檬酸鈉加入量的增加而增強(qiáng)。當(dāng)檸檬酸鈉加入量為3.7 mL時(shí)，SERS信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到最大，隨著檸檬酸鈉加入量的繼續(xù)增加，SERS信號(hào)強(qiáng)度減弱。因此對(duì)于測(cè)定雞肉中SM-2和SPD的殘留的SERS檢測(cè)，檸檬酸鈉加入量為3.7 mL時(shí)的金溶膠的增強(qiáng)效果更強(qiáng)。當(dāng)檸檬酸鈉加入量繼續(xù)增加時(shí)，可能由于SPD和SM-2分子與金溶膠納米粒子的表面發(fā)生了吸附或結(jié)合，改變了金溶膠納米粒子的表面等離子體共振性質(zhì)，降低了金溶膠的增強(qiáng)效果[17]，因此SERS信號(hào)強(qiáng)度減弱。由圖可知，當(dāng)檸檬酸鈉加入量達(dá)到3.9 mL，然后繼續(xù)增加，1 188 cm-1處的SERS信號(hào)強(qiáng)度有所提高，但是還是明顯低于用3.7 mL檸檬酸鈉制備的金溶膠的SERS信號(hào)強(qiáng)度。本試驗(yàn)采用加入3.7 mL檸檬酸鈉制備的金溶膠作為活性增強(qiáng)基底。

SERS效應(yīng)主要是由吸附在粗糙的金溶膠納米粒子表面的待測(cè)分子產(chǎn)生電磁效應(yīng)和化學(xué)效應(yīng)所引起，因此只有部分附著在金溶膠表面活性位置的待測(cè)分子才能產(chǎn)生增強(qiáng)效應(yīng)，金溶膠的加入量會(huì)影響SERS信號(hào)強(qiáng)度[18]。本試驗(yàn)分別將待測(cè)物中加入不同量的金溶膠(400，450，500和550 μL)，采集待測(cè)物進(jìn)行SERS信號(hào)。通過(guò)比較SERS信號(hào)強(qiáng)度來(lái)確定金溶膠最佳加入量，結(jié)果如圖6所示。當(dāng)金溶膠加入量增加時(shí)，937 cm-1處的拉曼信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)。當(dāng)金溶膠加入量達(dá)到450 μL時(shí)，SERS信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到最高，當(dāng)金溶膠的量繼續(xù)增加時(shí)，SERS信號(hào)強(qiáng)度降低。1 188 cm-1處的SERS信號(hào)強(qiáng)度變化由圖6可知，SERS信號(hào)強(qiáng)度隨著金溶膠加入量的增加而呈上升趨勢(shì)，500 μL時(shí)SERS信號(hào)達(dá)到最強(qiáng)，繼續(xù)增加金溶膠SERS信號(hào)呈下降趨勢(shì)。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是隨著金溶膠納米粒子的增加，待測(cè)分子不斷吸附在金溶膠納米顆粒表面活性位置，使SERS效應(yīng)不斷增強(qiáng)，當(dāng)金溶膠納米粒子繼續(xù)增多后，待測(cè)分子與金溶膠納米粒子的體積比減小，SERS信號(hào)強(qiáng)度降低。由圖6可知，當(dāng)金溶膠加入量為450 μL時(shí)，937 cm-1處的SERS強(qiáng)度最強(qiáng)，而金溶膠加入量為500 μL時(shí)，1 188 cm-1處的SERS強(qiáng)度才能達(dá)到最強(qiáng)，確定一個(gè)金溶膠加入量不能保證兩個(gè)特征峰的SERS信號(hào)強(qiáng)度同時(shí)達(dá)到最強(qiáng)，因此只能選擇一個(gè)相對(duì)效果更好的金溶膠加入量。觀察圖6中兩條曲線可知，937 cm-1處的SERS信號(hào)強(qiáng)度整體比1 188 cm-1處的SERS信號(hào)強(qiáng)度高。因此，如果選擇450 μL為最優(yōu)金溶膠加入量，當(dāng)SM-2濃度較低時(shí)，1 188 cm-1處的SERS信號(hào)可能無(wú)法采集到。但是如果選擇500 μL為最優(yōu)金溶膠加入量，對(duì)1 188 cm-1處的SERS信號(hào)增強(qiáng)效果最好，并且937 cm-1處的SERS信號(hào)強(qiáng)度要高于1 188 cm-1處的SERS信號(hào)強(qiáng)度。因此，雞肉中只要含有SPD，937 cm-1處的SERS信號(hào)一定能采集到。因此，選擇最優(yōu)金溶膠加入量為500 μL。

圖5 檸檬酸鈉加入量對(duì)SERS信號(hào)的影響Fig.5 The effect of sodium citrate amount on SERS signal

圖6 金溶膠加入量對(duì)SERS信號(hào)的影響Fig.6 The effect of gold nanoparticles amount on SERS signal

圖7 NaCl溶液加入量對(duì)SERS信號(hào)影響Fig.7 The effect of NaCl solution amount on SERS signal

采集含SPD和SM-2雞肉的SERS信號(hào)時(shí)，吸附在金溶膠納米粒子表面的SPD和SM-2分子產(chǎn)生的SERS效應(yīng)很難直接被顯微拉曼光譜儀器檢測(cè)到。當(dāng)加入一定量的活性劑NaCl溶液時(shí)，SERS效應(yīng)能被檢測(cè)到。因此，本試驗(yàn)選擇NaCl溶液作為活性劑。對(duì)加入不同量NaCl溶液(50，100，150和200 μL)的待測(cè)物進(jìn)行SERS信號(hào)的采集，試驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。937和1 188 cm-1處拉曼特征峰顯示，當(dāng)不斷增加NaCl溶液加入量時(shí)，SERS信號(hào)不斷增強(qiáng)。這是因?yàn)镃l-1會(huì)使金納米粒子產(chǎn)生凝聚，使局域電磁場(chǎng)增強(qiáng)，從而使SERS不斷增強(qiáng)[19]。當(dāng)NaCl溶液的加入量為100 μL時(shí)，1 188 cm-1處的SERS信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到最強(qiáng)，而937 cm-1處的SERS信號(hào)強(qiáng)度還在持續(xù)增強(qiáng)，當(dāng)NaCl溶液加入量為150 μL時(shí)，SERS信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到最強(qiáng)。這是因?yàn)镃l-促進(jìn)了待測(cè)分子與金溶膠納米粒子之間的吸附作用，從而使SERS信號(hào)得到增強(qiáng)，但是加入過(guò)量的NaCl溶液后，Cl-過(guò)多，加劇金溶膠納米粒子的凝聚作用而產(chǎn)生沉淀，導(dǎo)致SERS效應(yīng)減弱。NaCl溶液加入量為100和150 μL對(duì)937 cm-1處的SERS信號(hào)強(qiáng)度影響不大，但是當(dāng)NaCl溶液加入量為150 μL時(shí)，1 188 cm-1處的SERS信號(hào)強(qiáng)度相比加入量為100 μL時(shí)的信號(hào)強(qiáng)度急劇減小。因此，本研究確定NaCl溶液的最佳加入量為100 μL。

按照以上試驗(yàn)，得到金溶膠最佳加入量為500 μL，NaCl溶液最佳加入量為100 μL，將這兩種溶液一起加入到微型離心管中，震蕩后滴加到待測(cè)物上，采集待測(cè)物進(jìn)行SERS信號(hào)的。由圖8可知，雞肉對(duì)金溶膠和NaCl溶液混合物的吸附時(shí)間不同會(huì)對(duì)SERS信號(hào)的強(qiáng)度產(chǎn)生影響，并且當(dāng)吸附時(shí)間為5 min時(shí)，SERS信號(hào)最強(qiáng)。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是吸附時(shí)間過(guò)短，不能使待測(cè)分子與金溶膠納米粒子充分吸附，吸附時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使金溶膠納米粒子凝聚過(guò)度從而產(chǎn)生沉淀。因此，選擇最佳的吸附時(shí)間為5 min。

圖8 吸附時(shí)間對(duì)SERS信號(hào)的影響Fig.8 The effect of adsorption time on SERS signal

2.4 前處理方法的選擇

為了提高預(yù)測(cè)模型的分類精度，在主成分分析之前對(duì)原始拉曼光譜進(jìn)行了前處理。選擇了三種常見的前處理方法： air-PLS、歸一化和二階導(dǎo)數(shù)對(duì)原始試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行前處理。Air-PLS在不改變有效特征峰的前提下扣除熒光等背景信號(hào)，以消除干擾。歸一化主要是把數(shù)據(jù)變成[0,1]之內(nèi)的小數(shù)，不僅不改變數(shù)與數(shù)之間的相對(duì)關(guān)系，同時(shí)使數(shù)據(jù)可比性更強(qiáng)，數(shù)據(jù)分析更加方便。表1列出了PCA-SVM結(jié)合三種前處理方法對(duì)測(cè)試集(n=133)分類正確和錯(cuò)誤的個(gè)數(shù)。由表1可知，對(duì)于三組不同的前處理方法，PCA-SVM模型對(duì)測(cè)試集分類精度分別為64.66%，85.71%和93.23%。其中，以air-PLS+歸一化+二階導(dǎo)數(shù)作為前處理方法的分類精度最高。因此，選擇air-PLS+歸一化+二階導(dǎo)數(shù)作為本研究的前處理方法。

2.5 基于PCA的特征參數(shù)提取

在損失較少信息的前提下，PCA利用降維的中心思想，把多個(gè)指標(biāo)轉(zhuǎn)換成幾個(gè)綜合指標(biāo)的多元統(tǒng)計(jì)方法[20]。對(duì)經(jīng)過(guò)前處理的SERS信號(hào)進(jìn)行主成分分析，繪制前四個(gè)主成分的PCA得分值如圖9所示，PC1—PC2，PC1—PC3和PC1—PC4能將含SM-2+SPD的雞肉區(qū)分出來(lái)，PC2—PC3能將不含兩種抗生素的雞肉區(qū)分出來(lái),但是沒(méi)有一組得分圖能將含SM-2的雞肉或?qū)⒑琒PD的雞肉區(qū)分出來(lái)。因此，在選擇前四個(gè)PCA得分值作為分類模型的輸入值的基礎(chǔ)上還要利用SVM來(lái)擴(kuò)大四類雞肉樣本之間的差異，以便更有效地進(jìn)行分類。

表1 基于PCA-SVM的三種前處理方法對(duì)測(cè)試集雞肉中殘留的SM-2和SPD的分類結(jié)果Table 1 Results of classification of SM-2 and SPD in chicken based on PCA-SVM with three pretreatment methods for test set

圖9 訓(xùn)練集前四個(gè)主成分分析的得分圖Fig.9 PCA score plots of first four principal componentsfor Raman spectra of training set

2.6 基于SVM的雞肉中SM-2和SPD分類結(jié)果

用SVM對(duì)三類加標(biāo)的雞肉和空白雞肉進(jìn)行分類。選擇C-SVC作為分類模型的類型，選擇多項(xiàng)式為分類模型的核函數(shù)，以前四個(gè)PCA得分值作為SVM分類模型的輸入值。由于懲罰參數(shù)c和核參數(shù)g對(duì)分類模型的性能有很大的影響，利用SVM中的自動(dòng)優(yōu)化功能確定了最佳的c和g分別為0.01和0.1。

SVM分類模型結(jié)合三種前處理方法得到測(cè)試集不同加標(biāo)雞肉的敏感性和特異性如表2所示。經(jīng)過(guò)air-PLS+歸一化前處理后，分類鑒別的敏感性的范圍為51.61%～76.47%，特異性的范圍為81.37%～96.97%，其中空白雞肉的敏感性和特異性最強(qiáng)，分別為76.47%和96.97%，含SPD雞肉的敏感性和特異性最低，分別為51.61%和81.37%。經(jīng)過(guò)air-PLS+二階導(dǎo)數(shù)前處理后，分類鑒別的敏感性范圍為70.59%～100%，特異性范圍為86.73%～100%，其中含SM-2雞肉的敏感性最高為100%，空白雞肉的特異性最高為100%。經(jīng)過(guò)air-PLS+歸一化+二階導(dǎo)數(shù)前處理后，分類鑒別的敏感性范圍為77.42%～100%，特異性范圍為96%～99.02%。其中含SM-2+SPD雞肉的敏感性最高，為100%，含SPD雞肉的敏感性最低，為77.42%。對(duì)于特異性而言，含SPD雞肉的特異性最高，為99.02%，含SM-2雞肉的特異性最低，為96%。綜合考慮，結(jié)合air-PLS+歸一化+二階導(dǎo)數(shù)前處理方法而建立的C-SVC分類模型能夠更加精確地鑒別四種雞肉。

表2 不同預(yù)處理方法建立的PCA-SVM模型對(duì)測(cè)試集不同加標(biāo)雞肉鑒別的敏感性和特異性Table 2 Sensitivity and specificity of PCA-SVM model established by different pretreatmentmethods for identification of chicken with different labeling in test set

3 結(jié) 論

建立了一種運(yùn)用SERS技術(shù)快速鑒別雞肉中兩種磺胺類抗生素(即： SM-2和SPD)的方法，直接對(duì)雞肉進(jìn)行檢測(cè)，不再需要制備雞肉提取液，節(jié)省了大量前處理時(shí)間，提高了檢測(cè)效率。結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)的條件進(jìn)行優(yōu)化，得到了最佳試驗(yàn)條件。在采用三種前處理方法的基礎(chǔ)上，結(jié)合PCA和SVM建立了PCA-SVM分類模型，實(shí)現(xiàn)了對(duì)雞肉中存在的SM-2和SPD的快速分類鑒別，分類精度可以達(dá)到93.2%以上，測(cè)試集中含SM-2+SPD雞肉的敏感度最高達(dá)到100%，含SPD雞肉的特異性最高達(dá)到99.02%。因此，本方法能夠滿足對(duì)雞肉中SM-2和SPD兩種抗生素殘留的快速鑒別，并且應(yīng)用SERS技術(shù)和分類建模方法可能開發(fā)出一種快速篩選的工具供需要者使用。