孫計(jì)平，陳 飛，李雪君，孫 煥，李旭輝

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 煙草研究所/黃淮煙區(qū)煙草病蟲(chóng)害綠色防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 許昌 461000)

煙蚜是世界性害蟲(chóng)，寄主植物非常廣泛，主要有茄科、豆科、十字花科、菊科等植物[1]。煙蚜是煙草的主要害蟲(chóng)之一，近年來(lái)危害程度呈上升趨勢(shì)。煙蚜分泌的“蜜露”甜而黏，常誘發(fā)煙葉產(chǎn)生 “煤污病”，使煙葉表面變黑，影響煙葉品質(zhì)，此外，煙蚜還傳播黃瓜花葉病病毒(CMV)和馬鈴薯Y病毒(PVY)等多種病毒病，造成的損失大于直接危害[2]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，施用化學(xué)農(nóng)藥見(jiàn)效快，是煙農(nóng)防治煙蚜的重要手段[3]，但隨著農(nóng)藥用量的增加，蚜蟲(chóng)容易產(chǎn)生抗藥性，還會(huì)增加農(nóng)民負(fù)擔(dān)、造成環(huán)境污染。在煙葉生產(chǎn)上，防治蚜蟲(chóng)最有效的方法是推廣抗蚜蟲(chóng)品種。周婷婷等[4]采用葉碟法研究了煙蚜對(duì)20個(gè)煙草品種的取食選擇性，認(rèn)為煙蚜成蟲(chóng)的選擇性在不同煙草品種間差異明顯，同時(shí)認(rèn)為葉綠素和可溶性蛋白含量低的煙草品種抗蚜性強(qiáng)。

關(guān)于煙草品種抗蚜機(jī)制的研究較少，不同煙草品種遭受昆蟲(chóng)侵襲時(shí)可能會(huì)誘導(dǎo)不同的信號(hào)途徑來(lái)抵御其侵食。茉莉酸是重要的植物激素，也是植物抗蟲(chóng)的主要信號(hào)分子，在植物防御昆蟲(chóng)中發(fā)揮著重要作用[5-7]，刺吸式口器和咀嚼式口器昆蟲(chóng)取食煙草時(shí)，煙草體內(nèi)的一氧化氮信號(hào)分子和茉莉酸的含量會(huì)發(fā)生顯著變化。趙麗艷[8]研究發(fā)現(xiàn)，蚜蟲(chóng)取食小麥激活了茉莉酸信號(hào)傳導(dǎo)途徑。王祎等[9]研究認(rèn)為，供鉀充足條件下，小麥?zhǔn)艿窖料x(chóng)危害后體內(nèi)茉莉酸含量顯著提高。黃智鴻等[10]研究認(rèn)為，榆癭蚜取食榆樹(shù)葉片后，可激活榆樹(shù)體內(nèi)茉莉酸信號(hào)傳導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)榆樹(shù)葉片茉莉酸含量增加。煙草葉片受到昆蟲(chóng)咬食后茉莉酸含量顯著增加，噴施外源茉莉酸能顯著提高煙草品種的抗蚜性[11-12]，但煙草植株受到蚜蟲(chóng)侵襲后，體內(nèi)茉莉酸含量變化的相關(guān)研究較少。鑒于此，對(duì)不同煙草品種進(jìn)行蚜蟲(chóng)抗性鑒定，并比較不同煙蚜抗性品種接種蚜蟲(chóng)前后煙株茉莉酸含量的變化，以期揭示不同煙草品種對(duì)蚜蟲(chóng)的防御響應(yīng)機(jī)制，并為煙草抗蚜材料的進(jìn)一步應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

12個(gè)供試煙草品種具體見(jiàn)表1，均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所提供。

1.2 不同煙草品種的抗蚜性鑒定

2019年3月，在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所育苗大棚，采用漂浮育苗培育煙苗，每個(gè)煙草品種90株。

1.2.1 煙蚜對(duì)不同煙草品種的選擇性 煙苗培養(yǎng)至5～6片真葉時(shí)取樣，采用葉碟法[4,14]，試驗(yàn)容器為長(zhǎng)方形白色透明塑料盒，長(zhǎng)40 cm、寬30 cm、高13 cm，塑料盒底部鋪1層2 cm厚的浸水脫脂棉，上面覆蓋1層濾紙進(jìn)行保濕，每個(gè)煙草品種取20 cm2左右的完整葉片1片，按編號(hào)順序擺放一圈，于中間放置120頭無(wú)翅4齡成蚜(按每個(gè)品種10頭計(jì)算)，然后用防蟲(chóng)網(wǎng)(孔徑0.15 mm)封口。試驗(yàn)重復(fù)3次。分別于接蟲(chóng)后2、4、8、24 h調(diào)查每片葉子上的蚜蟲(chóng)數(shù)量，盡量輕拿輕放，不影響蚜蟲(chóng)取食。每個(gè)品種煙蚜數(shù)量取4次調(diào)查數(shù)據(jù)的平均值，煙蚜數(shù)量與感蟲(chóng)對(duì)照品種SpeightG-28相比，即為該品種的煙蚜選擇性蚜量比i1。

表1 參試品種 Tab.1 Test varieties

1.2.2 煙蚜在不同煙草品種上的繁殖特性 參考專(zhuān)利《一種煙蚜在不同煙草品種上的繁殖力鑒定方法》[15]，并略有改動(dòng)。煙苗培養(yǎng)至3～4片真葉時(shí)，移栽到花盆中培養(yǎng)，每盆1株，每個(gè)品種20盆，花盆直徑10 cm、高10 cm，漂浮育苗基質(zhì)與土按1∶1混合成培養(yǎng)土。緩苗7 d后，每個(gè)品種選取9盆長(zhǎng)勢(shì)一致的壯苗用于比較煙蚜在不同煙草品種上的繁殖特性試驗(yàn)，剩余煙苗繼續(xù)培養(yǎng)，用于茉莉酸含量測(cè)定。煙蚜在不同煙草品種上的繁殖特性測(cè)定：每株接種1頭4齡無(wú)翅成蚜作為母蚜。試驗(yàn)在光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行，設(shè)置環(huán)境條件：光照L∶D=14∶10，溫度白天25 ℃，夜晚20 ℃，相對(duì)濕度60%～80%。1～30 d每天觀(guān)察1次，分別調(diào)查母蚜在每個(gè)煙草品種上的產(chǎn)蚜數(shù)量，記錄后每天將所產(chǎn)幼蚜移去，記錄母蚜死亡情況，直至所有試驗(yàn)?zāi)秆了劳鰹橹梗囼?yàn)結(jié)束。分別統(tǒng)計(jì)煙蚜在每個(gè)品種每株上的繁殖總量。每個(gè)品種上煙蚜繁殖總量與對(duì)照品種SpeightG-28煙蚜繁殖總量相比，即為該品種的煙蚜繁殖量蚜量比i2。

煙草品種抗蚜性評(píng)價(jià)參考《煙草品種抗蟲(chóng)性評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)程》[16]：高抗(i≤0.25)、抗(0.251.25)?？寡林笖?shù)i取i1和i2的均值[17]。

1.3 煙株茉莉酸含量對(duì)接種蚜蟲(chóng)的響應(yīng)

漂浮育苗培育煙苗，6～7片真葉時(shí)取樣，每個(gè)品種選擇有代表性9株接種蚜蟲(chóng)，每株接種4齡無(wú)翅成蚜20頭，接蟲(chóng)前和接蟲(chóng)后5 h分別取煙葉樣品并用錫箔紙包裹，于液氮中冷凍，-80 ℃保存。3株混合取樣作為1個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)3次重復(fù)。

茉莉酸含量測(cè)定參考任琴等[18]的方法，略作修改：稱(chēng)取0.1 g煙葉樣本，在液氮中充分研磨；加入1 mL 80%甲醇提取液,置于-20 ℃冰箱中過(guò)夜；然后于4 ℃、8 000 r/min離心1 h，取上清液，過(guò)C-18固相萃取柱。過(guò)柱后的樣本真空干燥或氮?dú)獯蹈?，保存?zhèn)溆茫簧蠙C(jī)前加入pH值為7.4的 PBS緩沖液(1 mL定容)。混勻后在室溫條件下放置30 min，然后4 ℃離心(8 000 r/min、15 min)，取上清液并暫時(shí)保存于4 ℃冰箱，采用超高效液相色譜測(cè)定[9]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007和DPS 14.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用LSD法進(jìn)行差異性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同煙草品種的煙蚜抗性分析

由表2可見(jiàn)，煙蚜成蟲(chóng)對(duì)不同煙草品種的選擇差異較大，豎把老母雞2113的煙蚜選擇性蚜量比為0.25，說(shuō)明煙蚜對(duì)其選擇性低；其次為茄棵和胎里肥2411，煙蚜選擇性蚜量比分別為0.36和0.37；王坡二煙蚜選擇性蚜量比為0.46，說(shuō)明煙蚜對(duì)其選擇性也較低。煙蚜對(duì)豎把老母雞2113、茄棵、胎里肥2411和王坡二4個(gè)品種的選擇性極顯著低于其他品種。務(wù)川黑煙、紅縣鄉(xiāng)大葉煙、MC Nair和Vesta 33等4個(gè)品種煙蚜選擇性蚜量比在0.60～0.70；螺絲頭2474和云煙97的煙蚜選擇性蚜量比較高，與前期研究結(jié)果[17]一致，中煙100煙蚜選擇性蚜量比略高于對(duì)照SpeightG-28。

煙蚜在不同煙草品種上的繁殖量差異較大，螺絲頭2474上的煙蚜繁殖量最多，煙蚜繁殖量蚜量比為1.56，極顯著高于其他品種；其次為云煙97，煙蚜繁殖量蚜量比為1.34；煙蚜在務(wù)川黑煙繁殖量較少，蚜量比為0.50；煙蚜在王坡二上繁殖量最少，蚜量比為0.47，極顯著低于其他品種；豎把老母雞2113、茄棵、胎里肥2411、紅縣鄉(xiāng)大葉煙、MC Nair和Vesta 33等6個(gè)品種繁殖量蚜量比在0.54～0.77，在參試材料中繁殖量居中。

煙蚜在不同煙草品種上的存活時(shí)間差異較大，比較來(lái)看，煙蚜在SpeightG-28葉片上的存活時(shí)間最長(zhǎng)，其次為云煙97，煙蚜在王坡二上的存活時(shí)間最短。

根據(jù)煙草品種抗蟲(chóng)性評(píng)價(jià)方法，參考抗蚜指數(shù)和煙蚜存活時(shí)間，判定王坡二、豎把老母雞2113、茄棵和胎里肥2411為抗蚜品種；務(wù)川黑煙、紅縣鄉(xiāng)大葉煙、MC Nair和Vesta 33為中抗煙蚜品種；中煙100為感蚜品種；云煙97和螺絲頭2474為高感蚜蟲(chóng)品種。

表2 不同煙草品種蚜蟲(chóng)抗性比較Tab.2 Comparison of Myzus persicae(Sulzer) resistance in different tobacco varieties

2.2 不同抗蚜性煙草品種接種蚜蟲(chóng)前后煙株茉莉酸含量的變化

不同煙草品種接種蚜蟲(chóng)前后的茉莉酸含量見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，所有煙草品種接蚜蟲(chóng)后茉莉酸含量均表現(xiàn)為極顯著增加。

接蟲(chóng)前各煙草品種的茉莉酸含量整體表現(xiàn)為抗蚜>中抗>感蚜>高感，且抗蚜品種茉莉酸含量極顯著高于其他品種，中抗品種茉莉酸含量極顯著高于感蚜和高感品種。接種煙蚜后各煙草品種茉莉酸含量仍表現(xiàn)為抗蚜>中抗>感蚜>高感。茄棵在所有參試品種中茉莉酸含量在接蟲(chóng)前后均最高，接蟲(chóng)前顯著高于其他品種，接蟲(chóng)后極顯著高于其他品種。

不同煙草品種受蚜蟲(chóng)侵襲后茉莉酸含量增加量不同，由圖2可見(jiàn)，茄棵、胎里肥2411、豎把老母雞2113和王坡二4個(gè)抗蚜煙草品種受到蚜蟲(chóng)侵襲后茉莉酸含量增加較多，均超過(guò)150 ng/g，其中以茄棵茉莉酸含量增加最多，其次為胎里肥2411，這2個(gè)品種茉莉酸增加量顯著高其他品種，4個(gè)抗蟲(chóng)品種茉莉酸增加量極顯著高于中抗品種、感蟲(chóng)品種和高感品種；中抗品種茉莉酸增加量極顯著高于感蟲(chóng)品種和高感品種；感蟲(chóng)和高感品種茉莉酸增加量差異較小，中煙100和云煙97顯著低于螺絲頭2474，其他感蚜材料間差異不顯著。

不同煙草品種受到蚜蟲(chóng)侵襲后茉莉酸含量增幅不同，抗蚜品種茉莉酸含量增幅在40%左右，其中以茄棵和胎里肥2411增幅最高，極顯著高于其他品種；感蚜品種茉莉酸含量增幅在10%左右，極顯著低于抗蚜和中抗品種。

2.3 煙草品種蚜蟲(chóng)抗性與煙葉茉莉酸含量的相關(guān)分析

由表3可見(jiàn)，煙蚜選擇性蚜量比、煙草品種抗蚜指數(shù)與煙草茉莉酸含量、接蟲(chóng)后茉莉酸增加量和增加幅度均有較好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)均大于0.80；煙蚜繁殖量蚜量比與接蟲(chóng)前后茉莉酸含量、茉莉酸增加量和增幅的相關(guān)系數(shù)在0.70～0.75。

表3 煙草品種抗蚜性與煙葉茉莉酸含量相關(guān)性分析Tab.3 Correlation analysis of aphid resistance and jasmonate content in tobacco varieties

3 結(jié)論與討論

植物遭受到害蟲(chóng)侵襲后，通過(guò)啟動(dòng)體內(nèi)防御反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生系統(tǒng)誘導(dǎo)抗性，茉莉酸是普遍存在于高等植物體內(nèi)的內(nèi)源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，與植物的抗逆性密切相關(guān)[19]，茉莉酸最重要的作用就是傷口誘導(dǎo)防御響應(yīng)[20]，在昆蟲(chóng)取食后，植物體內(nèi)茉莉酸含量明顯增加，番茄茉莉酸合成缺失的突變體易受到害蟲(chóng)咬食[21]。前期很多研究認(rèn)為，茉莉酸途徑是植物防御咀嚼式昆蟲(chóng)的主要途徑[19-21]，煙草天蛾幼蟲(chóng)取食后，煙草內(nèi)源茉莉酸含量升高了9倍[22]。趙麗艷[8]研究發(fā)現(xiàn)，蚜蟲(chóng)取食小麥既激活了茉莉酸介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，也激活了水楊酸介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，二者之間存在協(xié)同作用，茉莉酸與水楊酸信號(hào)傳導(dǎo)途徑起主導(dǎo)作用的時(shí)間段可能不同[23]。王祎等[9]研究認(rèn)為，麥管長(zhǎng)蚜取食高鉀小麥激活了其體內(nèi)的茉莉酸信號(hào)傳導(dǎo)途徑。煙草的抗蚜性是煙草對(duì)蚜蟲(chóng)的一種可遺傳的防御反應(yīng)，不同煙草品種抗蚜性差異較大。應(yīng)用外源茉莉酸和茉莉酸甲酯能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生生物堿、蛋白酶抑制劑、多酚氧化酶等對(duì)害蟲(chóng)有趨避和妨礙行為的化合物，干擾昆蟲(chóng)的行為[24]，但采用外施茉莉酸方式提高植物抗蟲(chóng)性成本較高。在遇到蚜蟲(chóng)侵襲條件下，煙草品種內(nèi)源茉莉酸含量變化的研究鮮有報(bào)道。本研究選用不同煙草品種為試驗(yàn)材料，煙蚜選擇性試驗(yàn)和繁殖量試驗(yàn)結(jié)果表明，云煙97、螺絲頭2474為高感蚜蟲(chóng)品種，中煙100和SpeightG-28為感蚜蟲(chóng)品種，這和本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果[17]一致，和邱睿等[13]、周婷婷等[4]的研究結(jié)果也基本一致；通過(guò)前期大量種質(zhì)資源抗蚜性篩選，進(jìn)一步鑒定出茄棵、胎里肥2411、豎把老母雞2113和王坡二4個(gè)品種為抗蚜材料；務(wù)川黑煙、紅縣鄉(xiāng)大葉煙、MC Nair和Vesta 33煙蚜抗性為中抗。茉莉酸含量分析結(jié)果表明，不同煙草品種內(nèi)源茉莉酸含量差異較大，抗蚜品種茉莉酸含量極顯著高于中抗品種和感蚜品種；接種蚜蟲(chóng)后，12個(gè)參試煙草品種茉莉酸含量均表現(xiàn)為極顯著增加，不同煙草品種茉莉酸含量增加量差異也較大，4個(gè)抗蚜蟲(chóng)品種茉莉酸增加量極顯著高于中抗品種、感蚜品種和高感品種；中抗品種茉莉酸增加量極顯著高于感蟲(chóng)品種和高感品種；抗蚜品種受到蚜蟲(chóng)侵襲后茉莉酸含量增幅也明顯高于其他品種。不同煙草品種抗蚜指數(shù)與茉莉酸含量及增加量、增幅的相關(guān)分析表明，煙草品種煙蚜選擇性和抗蚜指數(shù)均與煙草內(nèi)源茉莉酸含量有較好的相關(guān)性，且與蚜蟲(chóng)侵襲后茉莉酸增加量和增幅也有較好的相關(guān)性，茉莉酸含量可以作為煙草品種抗蚜鑒定的生理指標(biāo)。