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        天麻病害發(fā)生與其真菌群落結構變化關系研究

        2021-03-09 02:36:40柏秋月鄧百萬解修超張彩妮劉蘭蘭袁敏謙
        河南農業(yè)科學 2021年1期
        關鍵詞:病株塊莖天麻

        柏秋月,鄧百萬,解修超,張彩妮,劉蘭蘭,袁敏謙

        (陜西理工大學 生物科學與工程學院/陜西省食藥用菌工程技術研究中心,陜西 漢中 723001)

        天麻(GastrodiaelataBl.)屬蘭科多年生草本植物,其塊莖具有較高的藥用及保健價值,是主產于中國的名貴中藥材[1]。近年來,市場對天麻的需求量日益增長,天麻產業(yè)迅猛發(fā)展。陜西省漢中市是我國天麻最大的適生區(qū)和主產區(qū)之一,天麻種植是當地農業(yè)的支柱產業(yè)。然而,漢中地處暖溫帶和亞熱帶氣候的過渡帶,降水量大且持續(xù)時間長,導致天麻病害加重[2]。研究表明,天麻病害主要由真菌、細菌、病毒等引起[3],植物內微生物群落組成變化也可影響植物的健康。熊城[4]對天麻內生真菌進行了初步分離鑒定,柳靖婷[5]對天麻內生菌與病原菌之間的相互作用進行了分析,研究均表明,植物內微生物群落組成發(fā)生變化可影響天麻的健康,而病原微生物是導致天麻病害發(fā)生的重要原因。迄今為止,尚未有預防和控制天麻病害發(fā)生的有效方法[6]。馮嘉云[7]對植物內的微生物群落進行了分析,結果表明,當植物體內的有益真菌數量減少時,植物更容易受到雜菌的侵染從而發(fā)生病害;當有益菌菌群種類和數量保持穩(wěn)定時,植物能夠健康生長,說明植物體內真菌群落結構的組成對植物的正常生長和健康狀態(tài)具有重要作用。因此,研究天麻內真菌群落結構對預防天麻病害、實現天麻綠色栽培十分必要。

        近年來,主要依靠傳統(tǒng)的可培養(yǎng)方法對引起天麻病害的微生物進行研究,但傳統(tǒng)培養(yǎng)法受培養(yǎng)條件和營養(yǎng)供給等方面的限制[8],存在培育的物種較少[9]等缺點,無法全面揭示病株天麻內微生物群落組成。隨著微生物培養(yǎng)技術的發(fā)展,高通量測序在微生物菌群研究方面表現出越來越突出的優(yōu)勢,其可以直接在分子層面進行測序,檢測出植物組織中難以培養(yǎng)的菌屬[10-12],全面揭示植株內微生物群落的組成。鑒于此,基于傳統(tǒng)培養(yǎng)法和高通量測序技術,對采集于漢中市鎮(zhèn)巴縣的紅稈健株天麻和病株天麻的塊莖進行真菌菌群結構和多樣性研究,旨在揭示天麻病害發(fā)生的原因,為天麻病害防控提供理論依據。

        1 材料和方法

        1.1 樣品采集

        天麻樣品于2019年4月采集于陜西省鎮(zhèn)巴縣白河村(108°02′E、32°48′N,海拔1 244 m)。樣品分為2組:①無黑斑、無腐爛、表面光潔的天麻塊莖(健株,如圖1a所示,編號記為JK1、JK2、JK3),②出現黑斑,腐爛的天麻塊莖(病株,如圖1b所示,箭頭指向病害部位,編號記為ZB1、ZB2、ZB3)。

        1.2 傳統(tǒng)培養(yǎng)分析方法

        1.2.1 天麻樣品可培養(yǎng)真菌的分離純化 取健株和病株天麻塊莖,超純水沖洗30 min,洗凈泥沙,放入超凈工作臺進行無菌操作。在75%乙醇溶液中浸泡30 s后,無菌水沖洗3~4次,放于無菌濾紙上吸干塊莖表面多余的水分,再于0.1%的氯化汞溶液中浸泡5 min,無菌水沖洗5~6次,置于墊有滅菌濾紙的平皿上。用解剖刀將天麻塊莖切成厚度約2 mm、長寬各約5 mm的薄片,接種于PDA平板,每皿接種1片,置于28 ℃條件下培養(yǎng)[13]。

        1.2.2 天麻樣品可培養(yǎng)真菌的形態(tài)學鑒定 將純化的菌株轉接到察氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)3~5 d,采用棉蘭染色法在光學顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)和大小,并參考《真菌鑒定手冊》[14]對其進行基本的分類鑒定。

        1.2.3 天麻樣品可培養(yǎng)真菌的ITS分子鑒定 將PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)的真菌菌絲體利用CTAB法提取DNA,并采用真菌通用引物ITS-1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS-4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進行擴增。PCR反應體系(50 μL):2×TaqMaster Mix 25 μL,10 μmoL/L上、下游引物各2 μL,模板DNA 1 μL,ddH2O補至50 μL。PCR反應條件: 94 ℃預變性5 min;94 ℃變性1 min,58 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,36個循環(huán);72 ℃延伸10 min。4 ℃保存,備用[15]。PCR產物送上海生工生物工程有限公司測序,測序結果進行BLAST比對,并提交至NCBI,利用Mega 7.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹[16]。

        1.3 天麻樣品內真菌的高通量測序分析

        1.3.1 天麻樣品內真菌總DNA提取及高通量測序 采用上海生工生物工程有限公司的OMEGA試劑盒E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit進行文庫構建,構建的文庫利用Qubit定量和檢測合格后,利用Illumina Miseq測序平臺對真菌翻譯間隔序列ITS1—ITS2區(qū)進行雙末端測序[17]。

        1.3.2 高通量測序數據分析 將得到的原始圖像數據文件經CASAVA堿基識別(Base calling)分析轉化為原始數據,使用Usearch去除序列中的非擴增區(qū)域序列,而后對序列進行錯誤校正,并調用Uchime鑒定嵌合體,隨后與數據庫進行對比檢測并去除嵌合體序列[18-19],得到有效數據(Clean reads)。將得到的有效數據按照序列間的距離進行聚類,通常以97%的一致性將序列聚類成為OTUs(Operational tabxonomic units),最后用Mothur等軟件對OTUs序列進行分析。

        2 結果與分析

        2.1 天麻樣品中可培養(yǎng)真菌的分離與鑒定

        通過可培養(yǎng)法共分離55株菌,其中從健株天麻塊莖樣品分離得到19株真菌,病株天麻塊莖樣品分離得到36株真菌,利用分子生物學方法進行鑒定,以ITS1和ITS4引物進行擴增,得到長度約為800 bp的擴增片段,測序后提交至GenBank數據庫中,進行序列分析和相似性比較,取相似性大于99%的序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹以確定所分離菌株的系統(tǒng)分類地位[20]。結果如圖2和圖3所示,健株與病株天麻塊莖內真菌群落結構存在顯著差異,健株分離得到的19株真菌屬于2個門6個目8個屬,病株分離得到的36株真菌屬于3個門7個目10個屬。

        對分離的不同菌屬的菌株結合形態(tài)學方法進行觀察,結果如表1所示,從健株和病株天麻塊莖中分離的真菌歸為3門14屬,其中肉座菌屬(Hypocrea)、毛殼屬(Cheatomium)、木霉屬(Trichoderma)、莖點霉屬(Phoma)只在健株天麻中分離到,且其所有菌屬的菌株數量相差很小,分布較均勻;而枝孢屬(Cladosporium)、鏈格孢屬(Alternaria)、孢盤菌屬(Botrytis)、多孔菌屬(Pycnoporus)、栓菌屬(Trametes)只在病株天麻中分離得到,且病株的優(yōu)勢菌屬為鐮刀菌屬(Fusarium),占比高達44.4%。根據國輝[21]、翟鳳艷等[22]研究可知,枝孢屬、鏈格菌屬、鐮刀菌屬均為植物致病菌,說明天麻發(fā)生病害后病株中致病真菌數量增加,真菌群落結構發(fā)生了改變。

        表1 天麻真菌種類及形態(tài)學特征Tab.1 Species and morphological characteristics of endophytic fungi in Gastrodia elata

        續(xù)表1 天麻真菌種類及形態(tài)學特征Tab.1(Continued) Species and morphological characteristics of endophytic fungi in Gastrodia elata

        2.2 基于高通量測序分析的天麻樣品內真菌多樣性

        2.2.1 天麻樣品真菌檢測及多樣性分析 在群落生態(tài)學中研究微生物多樣性,可以通過單樣品的多樣性分析(Alpha多樣性)反映微生物群落的豐度和多樣性[23]。本試驗采用稀釋曲線(Rarefaction curve)及多樣性指數(Diversity index)分析樣本的多樣性。稀釋曲線是采用對測序序列進行隨機抽樣的方法,以抽到的序列數與它們所能代表的相應指數構建曲線。當曲線趨于平坦時,說明測序數據量合理,更多的數據只會產生少量新的OTUs。本試驗對天麻健株(JK)和病株(ZB)樣本所有有效序列計算后的Shannon指數稀釋曲線如圖4所示,隨著抽樣序列數的增多,健株天麻(JK)和病株天麻(ZB)的Shannon指數逐漸增加,最后趨于穩(wěn)定,說明2組樣本中真菌的文庫覆蓋率均較高,本次測序結果基本能代表樣本的真實情況。且由圖4可知,健株天麻的3個樣品香濃指數差異較小,病株天麻樣品ZB2和ZB3的香濃指數遠高于天麻健株的任意一樣品,而樣品ZB1香濃指數較低可能是由于取樣時未取到病害部位,從而使得其指數低于JK2。

        利用軟件Usearch在97%相似度下將測序得到的序列進行聚類,6個樣品共產生1 692個OTUs,每個樣品測序得到的序列數量、OTUs數量及香濃指數見表2。Simpson指數反映天麻病害和健康狀態(tài)下真菌物種的多樣性,數值越小多樣性越高。Chao1和ACE指數反映天麻病害和健康狀態(tài)下真菌物種豐度,數值越大豐度越高[24]。由表2可知,健株天麻與病株天麻中真菌群落多樣性存在一定差異。其中,健株天麻的各樣品多樣性指數差異較小,病株天麻的各樣品多樣性指數相差較大。3個病株樣品的Simpson指數均較低,說明天麻病害狀態(tài)下的真菌物種多樣性均高于健康狀態(tài)下的天麻,病株樣品中ZB2樣品的OTUs數量最多,Chao1和ACE指數最高,表明所有樣品中ZB2真菌菌群最豐富,能最全面地代表天麻病株的群落結構。

        表2 天麻樣品的多樣性指數Tab.2 Diversity index of each Gastrodia elata sample

        2.2.2 天麻內真菌在門和屬水平上的群落組成 將上述聚類得到的1 692個OTUs的代表序列與NCBI數據庫代表序列進行BLASTn比對,進行物種注釋,共涵蓋49個屬(圖5),選擇2組天麻豐度差異較大的8門33屬進行對比分析(表3),由表3和圖5可知,從天麻中分離的真菌主要以子囊菌門(Ascomycota)為主,其次為擔子菌門(Basidiomycota);健株天麻組和病株天麻組的菌屬類別相差較大,其中,除未分類真菌外,土赤殼屬(Ilyonectria)、木霉屬、鐮刀菌屬、被孢霉屬(Mortierella)、unclassifiedCercozoa在2組天麻樣品中均存在,且木霉屬菌株屬于生防菌,其在健株內的豐度高于病株。鐮刀菌屬菌株屬于植物病原菌,其在病株中的豐度是健株的4.3倍,病株中的鐮刀菌屬菌株數量遠多于健株,這與傳統(tǒng)培養(yǎng)法的結果一致。而土赤殼屬在2種樣品中均為優(yōu)勢菌屬,豐度高達14%以上,但此菌屬菌株在傳統(tǒng)培養(yǎng)法中未分離出來,這可能是由于培養(yǎng)法所用的培養(yǎng)基無法提供其所需的營養(yǎng),導致土赤殼屬菌株難以生長。而Trichocladium、Tetracladium、喬氏桿菌屬(Gyoerffyella)、未分類傘形霉屬(unclassifiedSordariomycetes)、地絲霉屬(Geomyces)、Macrocystidia等菌屬只在健株中分析到,且其中的優(yōu)勢菌屬有Macrocystidia,豐度高達17.01%,但該菌屬真菌不屬于植物生防菌;未分類柔膜菌屬(unclassifiedHelotiales)、Menispora、Dactylonectria、粉紅螺旋聚孢霉屬(Clonostachys)等菌屬只在病株中分析到, 其中未分類柔膜菌屬真菌豐度達到了9.81%,且未分類柔膜菌屬真菌為植物致病菌,因此,天麻病株所擁有的某些特有菌群可能具有一定的致病性,這些特有菌群可能是天麻發(fā)生病害的原因。

        2.2.3 健株天麻與病株天麻真菌結構的相似性分析 采用R軟件進行PCoA分析簡化數據,每個圖標(圖6)代表1個樣本,兩點之間距離越近,表明2個樣本之間的微生物群落結構相似性越高,差異性越小,坐標軸括號中的百分比代表對應主成分所能解釋的原始數據中差異的比例。從圖6可知,第1坐標軸(PCoA1)的貢獻值為42.0%,第2坐標軸(PCoA2)的貢獻值為29.0%,第3坐標軸(PCoA3)的貢獻值為18.0%。病株天麻組3個樣本相似性較高,而與健株天麻組的距離較遠,說明2組的真菌群落相似性較低,這可能是由于天麻產生病害后改變了原有的微生物群落結構,從而導致2組樣品的真菌群落相似性較低。

        表3 健株與病株天麻中真菌屬級分類單元的豐度Tab.3 Abundance of fungal genus taxa in healthy and diseased Gastrodia elata

        3 結論與討論

        本研究綜合傳統(tǒng)培養(yǎng)法和高通量測序技術2種方法研究發(fā)現,健株與病株天麻塊莖中真菌群落組成存在顯著差異,兩者真菌群落結構相似性低。傳統(tǒng)培養(yǎng)法結果表明,從不同健康狀態(tài)的天麻中共分離得到55株真菌,屬于14個屬,天麻中真菌多樣性表現為病株天麻組>健株天麻組,從健株天麻組中分離的每種真菌數量相差較小,菌群處于一個較平衡的狀況,而從病株天麻組中分離的各菌屬菌株數量不均勻,其中鐮刀菌屬、鏈格孢屬、青霉屬、枝孢屬菌株數量占比較大,鐮刀菌屬數量占比高達44.4%,為優(yōu)勢菌屬。沈清清等[25]研究表明,鐮刀菌屬是造成多種藥用植物根腐病的主要病原菌;王淑琴等[26]報道,鏈格菌屬能侵染植物,造成黑斑病。因此,推斷天麻內各真菌種群豐度發(fā)生變化導致了天麻病害的發(fā)生。

        與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比,高通量測序更全面地展現了健株和病株天麻塊莖內的真菌群落。結果顯示,從天麻中共分析得到49個屬,1 692個OTUs,但病株天麻組>健株天麻組,真菌結構相似性較低,菌屬類別存在明顯差異。其中,除未分類真菌外,土赤殼屬、木霉屬等5個屬在2組樣品中均存在,土赤殼屬占比最大且屬于植物致病菌,此菌屬在病株中的豐度高出健株3.6個百分點,進一步證明天麻發(fā)生病害后致病菌豐度升高。柔膜菌屬(Helotiales)和鐮刀菌屬均為植物致病菌,本試驗中天麻病株中鐮刀菌屬真菌豐度是健株的4.3倍,未分類柔膜菌屬真菌只存在于病株中,且豐度達到了9.81%,這3個屬可能會導致天麻發(fā)生病害。因此,患病天麻內真菌群落結構發(fā)生改變是天麻發(fā)生病害的重要特征。

        研究天麻不同狀態(tài)下的真菌群落組成,可為探索天麻內是否存在拮抗微生物提供新的線索。木霉屬真菌因其在生物防治中的應用潛力而備受關注,在本研究中,木霉屬真菌在病株天麻和健株天麻中的豐度分別為4.63%和6.01%,菌株數量差異明顯,進一步說明天麻發(fā)生病害與其真菌群落的組成有關,該研究結果有助于分離天麻內的優(yōu)勢益生菌,通過添加益生菌可進一步驗證天麻患病的原因,為綠色防控天麻病害提供新思路。

        本研究采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法和高通量測序技術結合的方式,更清楚地了解了健株天麻和病株天麻內真菌群落的組成與差異,其中病株天麻塊莖內真菌種群的豐度上升和致病菌屬相對豐度的增加,改變了天麻內部原有的真菌群落結構,從而導致了天麻病害的發(fā)生。因此,患病天麻植株內的真菌群落結構發(fā)生改變是天麻發(fā)生病害的原因。

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