張 瑩,傅 靜,王孝勛,鐘秋節(jié),俞 鵬
(廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,南寧 530200)
把天門為豆科胡枝子屬植物美麗胡枝子(Les?pedeza formosa)的根,又名三妹木、謀見亮[1],廣泛分布于廣西、廣東、陜西、江蘇、甘肅、浙江、安徽、江西、湖北、福建、臺灣、四川、貴州、云南等省區(qū)[2]。廣西主產(chǎn)于柳州、梧州、桂林、南寧等地,是瑤族地區(qū)的民間常用藥[1]。中醫(yī)認為其味微辛澀,性微溫,具有活血散瘀、消腫止痛之功,主治跌打腫痛、風濕骨痛、肺癰[3]。瑤醫(yī)認為把天門具有清熱涼血、活血散瘀、消腫止痛、利尿、止血、潤肺、祛風濕的功效;主要用于風濕骨痛、關(guān)節(jié)痛、腰腿痛、跌打損傷、骨折、脫臼等癥[1]。目前國內(nèi)外學(xué)者對美麗胡枝子化學(xué)成分的研究較少,僅有Li 等[4]從安徽產(chǎn)美麗胡枝子根皮中分離得到2 個新的黃酮類成分,命名為Lespedezaflava?none F和Lespedezaflavanone G。吳和珍等[5]研究發(fā)現(xiàn)湖北產(chǎn)美麗胡枝子的根皮中含有槲皮苷。傅靜等[6]建立了廣西產(chǎn)美麗胡枝子莖葉的HPLC 指紋圖譜,采用對照品指認了3 個黃酮類成分,分別為夏佛塔苷、牡荊素及異牡荊素。現(xiàn)代藥理試驗表明,黃酮類化合物具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗心律失常、抗心肌缺血、降壓等作用[7],療效顯著。本試驗首次采用系統(tǒng)預(yù)試驗法對把天門的化學(xué)成分進行較全面的研究,建立其總黃酮含量測定的方法,為其活性成分的開發(fā)利用提供依據(jù)。
把天門藥材于2018 年4 月至2019 年8 月采自廣西壯族自治區(qū)不同市縣,共10 批,經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基教授鑒定為豆科胡枝子屬植物美麗胡枝子的根,標本存于廣西壯瑤藥重點實驗室,樣品信息見表1。蘆丁對照品,中國食品藥品檢定研究院,批號:100080-201811;95%乙醇、石油醚(60~90 ℃)、氯仿、醋酐、氨水、鹽酸、濃硫酸、氫氧化鉀、氫氧化鈉、碘化鉍鉀、α-萘酚、茚三酮、三氯化鐵、鎂粉、磷鉬酸、冰乙酸等均為分析純,水為去離子水,其余試劑自制。
HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋,常州國華電器有限公司;BP211D 型電子分析天平,德國賽多利斯公司;ZF-20C 型暗箱三用紫外分析儀,上海精密儀器儀表有限公司;RS-232 精密電子天平,丹納赫西特傳感工業(yè)控制天津有限公司;UV-2600 紫外可見分光光度計,島津儀器蘇州有限公司。
表1 把天門樣品信息
1.3.1 化學(xué)成分預(yù)試驗
1)水供試液的制備。取把天門藥材粉末10 g,置于250 mL 錐形瓶中,加去離子水100 mL,室溫浸泡24 h,過濾出約20 mL 濾液檢測氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)。將剩余的冷水浸泡液連同殘渣置于60 ℃左右水浴加熱30 min,趁熱過濾,濾液檢測糖、多糖、有機酸、皂苷、苷類、酚類、鞣質(zhì)[8]。
2)乙醇供試液、酸水供試液的制備。稱取把天門藥材粉末10 g,置于250 mL 錐形瓶中,加95%乙醇100 mL,水浴加熱回流1 h,稍冷后加入去離子水使其含醇量為70%。冷卻至室溫,過濾,濾液分成2份,一份濾液濃縮成膏狀,加5%鹽酸5 mL 使溶解,過濾,酸水溶液用于生物堿的定性檢測。另一份濾液用于黃酮、酚類、蒽醌、內(nèi)酯、香豆素、強心苷、萜類、甾體、有機酸、酚類等化合物的定性檢測[8]。
3)石油醚供試液的制備。取把天門藥材粉末1 g,置于50 mL 錐形瓶中,加石油醚(60~90 ℃)10 mL,室溫浸泡3 h,過濾,濾液用于油脂、揮發(fā)油檢測[8]。
1.3.2 總黃酮含量測定
1)對照品溶液的制備。精密稱取120 ℃干燥至恒重的蘆丁對照品10 mg,置于50 mL 容量瓶中,加70%乙醇定容,搖勻,即得濃度為0.200 mg/mL 的蘆丁對照品溶液。
2)供試品溶液的制備。取把天門藥材粉末約0.5 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,精密加入70%乙醇20 mL,稱重,回流提取60 min,冷卻至室溫,稱重,用相應(yīng)溶劑補足減失的重量,過濾,濾液即為供試品溶液。
3)測定方法。精密移取供試品溶液1 mL,置于100 mL 容量瓶中,加1%三氯化鋁溶液1 mL,加去離子水定容,搖勻,放置20 min,以相應(yīng)溶劑為空白,于波長275 nm 處測定吸光度。
2.1.1 線性關(guān)系考察 精密吸取蘆丁對照品溶液(0.200 mg/mL)0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL,分別置于25 mL容量瓶中,按確定的顯色條件顯色,以相應(yīng)溶劑為對照,于275 nm 波長處測定吸光度。以對照品溶液的吸光度為縱坐標、濃度為橫坐標,繪制標準曲線。計算得到回歸方程為Y=35.142 2X+0.040 645 3,r=0.999 6,表明蘆丁在 0.004~0.040 mg/mL 呈良好的線性關(guān)系。
2.1.2 精密度試驗 精密量取供試品溶液(BTM-2)1 mL,置于100 mL 容量瓶中,按確定的測定方法測定吸光度,重復(fù)測定6 次,記錄供試品溶液的吸光度,RSD為0.06%,說明儀器精密度良好。
2.1.3 穩(wěn)定性試驗 精密量取供試品溶液(BTM-2)1 mL,置于100 mL 容量瓶中,按確定的測定方法每隔10 min 進行1 次吸光度測定,記錄120 min 內(nèi)供試品溶液的吸光度,RSD為1.06%,表明供試品溶液在120 min 內(nèi)穩(wěn)定。
2.1.4 重復(fù)性試驗 取同一批(BTM-2)藥材粉末0.5 g,平行6份,制備供試品溶液,分別取供試品溶液1 mL,置于100 mL容量瓶中,按確定的測定方法測定吸光度,記錄供試品溶液的吸光度,計算把天門總黃酮的含量,RSD為0.15%,說明該方法重復(fù)性良好。
2.1.5 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的藥材(BTM-2)粉末6 份,各0.25 g,分別加入蘆丁對照品15.965 0 mg,制備供試品溶液。移取供試品溶液1 mL,置于100 mL 容量瓶中,按確定的測定方法測定吸光度,計算總黃酮含量,結(jié)果平均加樣回收率為95.29%,RSD為0.65%(表2)。
水提取液檢測結(jié)果顯示,把天門含有糖、多糖、苷類、有機酸、酚類、鞣質(zhì)類,可能含有皂苷,不含氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)(表3)。乙醇提取液檢測結(jié)果表明,把天門含有有機酸、酚類、鞣質(zhì)類、黃酮類、蒽醌類,可能含有強心苷,不含生物堿、植物甾醇、三萜類、內(nèi)酯、香豆素(表4)。石油醚提取液檢測結(jié)果顯示,把天門不含揮發(fā)油及油脂類,結(jié)果見表5。
取10 批次把天門藥材樣品,制備供試品溶液,按確定的方法測定供試品溶液的吸光度,計算把天門總黃酮的含量,結(jié)果見表6。
化學(xué)成分預(yù)試驗表明,本品可能含有黃酮、糖、多糖、苷類、有機酸、酚類、鞣質(zhì)、蒽醌等成分類型。總黃酮含量測定試驗中比較了直接測定法[9]、硝酸鋁比色法和三氯化鋁比色法3 種方法。結(jié)果表明,硝酸鋁比色法中,供試品溶液加入4%氫氧化鈉溶液立即出現(xiàn)絮狀沉淀,與胡文波等[10]研究時發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象相同,且對照品和供試品溶液的最大吸收波長相差甚遠;三氯化鋁比色法測定時,溶液澄清且穩(wěn)定性好,供試品溶液與蘆丁對照品溶液在275 nm 左右有最大吸收,故選擇三氯化鋁比色法為總黃酮含量測定的顯色方法??疾炝巳然X顯色劑的濃度、用量、顯色時間等因素,最終確定顯色方法為1%AlCl3乙醇溶液1 mL,加水定容,搖勻,放置20 min;通過單因素及正交試驗確定最佳的提取工藝為取把天門樣品0.5 g,加70%乙醇20 mL,提取60 min。結(jié)果表明,蘆丁對照品溶液濃度在0.004~0.040 mg/mL呈良好的線性關(guān)系,回歸方程為Y=35.142 2X+0.040 645 3(r=0.999 6),10 批把天門藥材中總黃酮含量在31.84~75.85 mg/g。試驗確定了瑤藥材把天門含有的化學(xué)成分,為進一步研究其活性成分及開發(fā)利用提供了依據(jù)。
表2 加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)
表3 水提取液預(yù)試結(jié)果
表4 乙醇提取液預(yù)試結(jié)果
表5 石油醚提取液預(yù)試結(jié)果
表6 10 批次把天門藥材總黃酮含量測定結(jié)果(X±SD,n=3)