吳 冰，莫婷婷，陸梅元，曾 超，趙鳳仙

（1.柳州市中醫(yī)醫(yī)院，廣西 柳州 545001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530023；3.廣西壯族自治區(qū)食品藥品審評(píng)查驗(yàn)中心，南寧 530029）

地耳草是藤黃科金絲桃屬地耳草（Hypericum ja?ponicumThumb.）的全草，具有保護(hù)肝臟、提高免疫、抗腫瘤等功效［1，2］。地耳草腫瘤抑制作用是其重要的研究方向，其提取物對(duì)前列腺癌、結(jié)腸癌細(xì)胞以及白血病有抑制作用［3］。地耳草主要含有黃酮類、間苯三酚衍生物和吡喃酮類化學(xué)成分［2，4，5］。

現(xiàn)代研究表明［6-8］，黃酮類化合物具有抗氧化、清除自由基、降血脂改善心肌供血等作用［9］，還具有抗腫瘤、抗心血管疾病、抗感染和抗病毒等藥理作用［10-12］。目前，國內(nèi)對(duì)地耳草總黃酮含量測(cè)定的相關(guān)研究較少，為保證其藥材質(zhì)量及臨床療效，本試驗(yàn)建立了地耳草總黃酮的含量測(cè)定方法，為建立地耳草藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。研究將同時(shí)對(duì)12 批不同產(chǎn)地的地耳草進(jìn)行總黃酮含量測(cè)定，為地耳草藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供一定的參考價(jià)值，也為研究地耳草藥材的質(zhì)量控制新方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試藥

蘆丁（批號(hào)：195106），純度>98%，購于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司；其余試驗(yàn)所用試劑均為分析純。藥材來源見表1，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部副主任中藥師曾超鑒定為藤黃科金絲桃屬地耳草的全草，經(jīng)54 ℃烘干，備用。

表1 不同產(chǎn)地地耳草樣品的來源

1.2 儀器

UV1780 型紫外-可見分光光度計(jì)，島津公司；XS105D 十萬分之一天平，梅特勒-托利多稱重設(shè)備系統(tǒng)有限公司；KQ5200B 超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；DFT-1000 高速萬能打粉機(jī)，溫嶺市林大機(jī)械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取105 ℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品6.32 mg，加65%乙醇溶解，定容至25 mL 容量瓶中，搖勻，制成濃度為0.252 8 mg/mL的對(duì)照品溶液。

1.3.2 供試品溶液制備 取藥材粉末約1.0 g，精密稱定，置錐形瓶中，加75%乙醇30 mL 稱定重量，回流提取0.5 h，再稱定重量，用65%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液1 mL 置25 mL 容量瓶中，即得供試品溶液。

1.3.3 線性方程的制定 分別取對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL 于 10 mL 容量瓶中，加5%亞硝酸鈉0.4 mL，放置6 min 后，加10%硝酸鋁0.4 mL，放置6 min，再加4%氫氧化鈉4 mL，加水至刻度，搖勻，放置10 min，然后在510 nm 測(cè)定吸光度［13］。

1.3.4 單因素試驗(yàn) 分別考察提取方法、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取體積、提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響。

1.3.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 地耳草中提取總黃酮的方法主要有有機(jī)溶劑提取法。根據(jù)查閱的相關(guān)文獻(xiàn)和《中國藥典》2015 年版［14，15］，試驗(yàn)最終采取乙醇為溶劑進(jìn)行提取，根據(jù)單因素考察結(jié)果分析，設(shè)置乙醇體積分?jǐn)?shù)（65%、75%、85%）、料液比（1∶20、1∶30、1∶40）（g/mL）、提取時(shí)間（0.5、1.0、1.5）設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)（表2），使用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定地耳草總黃酮含量。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 線性方程

以吸光度對(duì)濃度做線性方程，方程為y=8.697 2x-0.006 5，R2=0.999 2，在 0.012 6～0.101 1 mg/mL 濃度與吸光度有良好的線性關(guān)系。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 精密度試驗(yàn) 精密稱取廣西富川縣產(chǎn)的地耳草藥材粉末約1.0 g 制備供試品溶液，于510 nm 波長處連續(xù)6 次測(cè)定其吸光度，結(jié)果RSD為1.02%，表明該方法精密度良好。

2.2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取廣西富川縣產(chǎn)的地耳草藥材粉末約1.0 g 制備供試品溶液，于510 nm 波長處分別在0、20、40、60、80、100、120 min 測(cè)定吸光度，計(jì)算藥材的RSD值為2.15%，表明吸光度在120 min內(nèi)基本不變，樣品在120 min 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取廣西富川縣產(chǎn)的地耳草藥材樣品6 份，每份藥材粉末約1.0 g 制備供試品溶液，于510 nm 波長處平行測(cè)定其吸光度，計(jì)算地耳草藥材的平均含量為31.28 mg/g，RSD值為2.56%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4 加樣回收率試驗(yàn) 稱取地耳草莖藥材粉末6份，每份約0.5 g，精密稱定，精密加入蘆丁對(duì)照品溶液15.64 mg 制備供試品溶液，于510 nm 波長處平行測(cè)定其吸光度，計(jì)算總黃酮的含量（表3）。由表3 可知，平均回收率為99.61%，RSD值為2.43%（n=6），表明該方法回收率良好。

表3 加樣回收率試驗(yàn)（n=6）

2.3 單因素考察

2.3.1 提取方法的考察 取廣西富川縣的地耳草藥材粉末約1.0 g，精密稱定，置錐形瓶中，提取時(shí)間1 h、30 mL、65%乙醇為提取條件，分別采用超聲提取法、回流提取法和浸漬法對(duì)藥材進(jìn)行總黃酮提取。結(jié)果表明，回流提取法的提取率最高，故而選擇回流提?。▓D1）。

圖1 提取方法對(duì)總黃酮提取率的影響

2.3.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)的考察 取藥材粉末約1.0 g，精密稱定，置錐形瓶中，采用回流提取法提取時(shí)間1 h，以30 mL 35%、45%、55%、65%、75%和85%乙醇對(duì)藥材總黃酮提取率做單因素試驗(yàn)，結(jié)果表明，75%乙醇回流提取地耳草藥材總黃酮的提取率最高（圖2）。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響

2.3.3 提取體積的考察 取藥材粉末約1.0 g，精密稱定，置錐形瓶中，采用回流提取法提取時(shí)間1 h，以 10、20、30、40、50 和 60 mL 75% 乙醇對(duì)藥材總黃酮提取率做單因素試驗(yàn)，結(jié)果表明，提取體積為30 mL 的提取率最高（圖3）。

圖3 提取體積對(duì)總黃酮提取率的影響

2.3.4 提取時(shí)間考察 取藥材粉末約1.0 g，精密稱定，置錐形瓶中，采用回流提取法以75%乙醇30 mL，考察提取時(shí)間為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h 對(duì)藥材總黃酮提取率的影響，結(jié)果表明，提取時(shí)間為1.0 h 的提取率最高（圖4）。

圖4 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)正交設(shè)計(jì)助手軟件、試驗(yàn)方差分析結(jié)果可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮的提取工藝有顯著性影響，而提取體積和提取時(shí)間無顯著性差異，且各影響因素的強(qiáng)弱為乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）>料液比（B）>提取時(shí)間（C），對(duì)地耳草總黃酮含量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素是乙醇體積分?jǐn)?shù)，提取體積和提取時(shí)間沒有顯著性意義，因此最理想的提取方案是A2B2C2，即75%乙醇、料液比1∶30、回流提取1.0 h 提取效果最佳（圖5）。

2.5 樣品含量測(cè)定

精密稱取每個(gè)產(chǎn)地的地耳草藥材粉末3 份，每份約1.0 g，置錐形瓶中制備供試品溶液，測(cè)定總黃酮含量，結(jié)果見表6。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果

表5 正交試驗(yàn)方差分析

表6 不同產(chǎn)地的地耳草藥材總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)以地耳草為研究對(duì)象，考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取體積和提取時(shí)間3 個(gè)影響因素，采用回流提取法，利用正交試驗(yàn)方法來優(yōu)選地耳草總黃酮的最佳提取工藝，確定影響地耳草總黃酮提取工藝的主要因素是溶劑體積分?jǐn)?shù)、提取體積和提取時(shí)間等。地耳草的最佳提取工藝為回流提取，乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%，料液比1∶30，提取1.0 h。

在相同試驗(yàn)條件下，加入同體積、同體積分?jǐn)?shù)的乙醇可能會(huì)出現(xiàn)提取率不一致的狀況。具體原因可能是由于地耳草藥材粉末接觸乙醇的溶劑面積不一樣。但是在加入相同質(zhì)量地耳草的情況下，加入乙醇的量越多，提取率越高，呈正相關(guān)關(guān)系。除此之外，還可以考察更多的因素，如提取溫度、提取溶劑、溶劑pH 和提取次數(shù)等，且每個(gè)因素也可以通過單因素試驗(yàn)確定更好的試驗(yàn)水平，再通過正交試驗(yàn)優(yōu)選出提取率更佳的方案。

不同產(chǎn)地地耳草中總黃酮含量差異較大，廣西富川縣產(chǎn)的地耳草總黃酮含量最高，其次是廣西賀州市和廣西昭平縣，而廣西合浦縣和廣西北海市產(chǎn)的地耳草總黃酮含量較低。可能是由于不同地域、不同氣候、不同土壤以及不同的采摘季節(jié)影響而產(chǎn)生的結(jié)果。

地耳草自然資源豐富，在臨床中應(yīng)用廣泛。通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前對(duì)地耳草總黃酮的研究還較少，為保障其臨床用藥合理、安全、有效，本研究通過正交試驗(yàn)篩選出地耳草總黃酮的最佳提取工藝，為進(jìn)一步研究、開發(fā)地耳草的藥用資源提供科學(xué)依據(jù)。