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        地耳草總黃酮提取工藝優(yōu)化與含量測(cè)定

        2021-03-09 02:09:50莫婷婷陸梅元趙鳳仙
        湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年3期
        關(guān)鍵詞:粉末藥材黃酮

        吳 冰,莫婷婷,陸梅元,曾 超,趙鳳仙

        (1.柳州市中醫(yī)醫(yī)院,廣西 柳州 545001;2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,南寧 530023;3.廣西壯族自治區(qū)食品藥品審評(píng)查驗(yàn)中心,南寧 530029)

        地耳草是藤黃科金絲桃屬地耳草(Hypericum ja?ponicumThumb.)的全草,具有保護(hù)肝臟、提高免疫、抗腫瘤等功效[1,2]。地耳草腫瘤抑制作用是其重要的研究方向,其提取物對(duì)前列腺癌、結(jié)腸癌細(xì)胞以及白血病有抑制作用[3]。地耳草主要含有黃酮類、間苯三酚衍生物和吡喃酮類化學(xué)成分[2,4,5]。

        現(xiàn)代研究表明[6-8],黃酮類化合物具有抗氧化、清除自由基、降血脂改善心肌供血等作用[9],還具有抗腫瘤、抗心血管疾病、抗感染和抗病毒等藥理作用[10-12]。目前,國內(nèi)對(duì)地耳草總黃酮含量測(cè)定的相關(guān)研究較少,為保證其藥材質(zhì)量及臨床療效,本試驗(yàn)建立了地耳草總黃酮的含量測(cè)定方法,為建立地耳草藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。研究將同時(shí)對(duì)12 批不同產(chǎn)地的地耳草進(jìn)行總黃酮含量測(cè)定,為地耳草藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供一定的參考價(jià)值,也為研究地耳草藥材的質(zhì)量控制新方法奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 試藥

        蘆丁(批號(hào):195106),純度>98%,購于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司;其余試驗(yàn)所用試劑均為分析純。藥材來源見表1,經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部副主任中藥師曾超鑒定為藤黃科金絲桃屬地耳草的全草,經(jīng)54 ℃烘干,備用。

        表1 不同產(chǎn)地地耳草樣品的來源

        1.2 儀器

        UV1780 型紫外-可見分光光度計(jì),島津公司;XS105D 十萬分之一天平,梅特勒-托利多稱重設(shè)備系統(tǒng)有限公司;KQ5200B 超聲波清洗儀,昆山市超聲儀器有限公司;DFT-1000 高速萬能打粉機(jī),溫嶺市林大機(jī)械有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取105 ℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品6.32 mg,加65%乙醇溶解,定容至25 mL 容量瓶中,搖勻,制成濃度為0.252 8 mg/mL的對(duì)照品溶液。

        1.3.2 供試品溶液制備 取藥材粉末約1.0 g,精密稱定,置錐形瓶中,加75%乙醇30 mL 稱定重量,回流提取0.5 h,再稱定重量,用65%乙醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,過濾,精密量取續(xù)濾液1 mL 置25 mL 容量瓶中,即得供試品溶液。

        1.3.3 線性方程的制定 分別取對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL 于 10 mL 容量瓶中,加5%亞硝酸鈉0.4 mL,放置6 min 后,加10%硝酸鋁0.4 mL,放置6 min,再加4%氫氧化鈉4 mL,加水至刻度,搖勻,放置10 min,然后在510 nm 測(cè)定吸光度[13]。

        1.3.4 單因素試驗(yàn) 分別考察提取方法、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取體積、提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響。

        1.3.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 地耳草中提取總黃酮的方法主要有有機(jī)溶劑提取法。根據(jù)查閱的相關(guān)文獻(xiàn)和《中國藥典》2015 年版[14,15],試驗(yàn)最終采取乙醇為溶劑進(jìn)行提取,根據(jù)單因素考察結(jié)果分析,設(shè)置乙醇體積分?jǐn)?shù)(65%、75%、85%)、料液比(1∶20、1∶30、1∶40)(g/mL)、提取時(shí)間(0.5、1.0、1.5)設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)(表2),使用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定地耳草總黃酮含量。

        表2 L9(34)正交試驗(yàn)因素與水平

        2 結(jié)果與分析

        2.1 線性方程

        以吸光度對(duì)濃度做線性方程,方程為y=8.697 2x-0.006 5,R2=0.999 2,在 0.012 6~0.101 1 mg/mL 濃度與吸光度有良好的線性關(guān)系。

        2.2 方法學(xué)考察

        2.2.1 精密度試驗(yàn) 精密稱取廣西富川縣產(chǎn)的地耳草藥材粉末約1.0 g 制備供試品溶液,于510 nm 波長處連續(xù)6 次測(cè)定其吸光度,結(jié)果RSD為1.02%,表明該方法精密度良好。

        2.2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取廣西富川縣產(chǎn)的地耳草藥材粉末約1.0 g 制備供試品溶液,于510 nm 波長處分別在0、20、40、60、80、100、120 min 測(cè)定吸光度,計(jì)算藥材的RSD值為2.15%,表明吸光度在120 min內(nèi)基本不變,樣品在120 min 內(nèi)穩(wěn)定。

        2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取廣西富川縣產(chǎn)的地耳草藥材樣品6 份,每份藥材粉末約1.0 g 制備供試品溶液,于510 nm 波長處平行測(cè)定其吸光度,計(jì)算地耳草藥材的平均含量為31.28 mg/g,RSD值為2.56%,表明該方法重復(fù)性良好。

        2.2.4 加樣回收率試驗(yàn) 稱取地耳草莖藥材粉末6份,每份約0.5 g,精密稱定,精密加入蘆丁對(duì)照品溶液15.64 mg 制備供試品溶液,于510 nm 波長處平行測(cè)定其吸光度,計(jì)算總黃酮的含量(表3)。由表3 可知,平均回收率為99.61%,RSD值為2.43%(n=6),表明該方法回收率良好。

        表3 加樣回收率試驗(yàn)(n=6)

        2.3 單因素考察

        2.3.1 提取方法的考察 取廣西富川縣的地耳草藥材粉末約1.0 g,精密稱定,置錐形瓶中,提取時(shí)間1 h、30 mL、65%乙醇為提取條件,分別采用超聲提取法、回流提取法和浸漬法對(duì)藥材進(jìn)行總黃酮提取。結(jié)果表明,回流提取法的提取率最高,故而選擇回流提?。▓D1)。

        圖1 提取方法對(duì)總黃酮提取率的影響

        2.3.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)的考察 取藥材粉末約1.0 g,精密稱定,置錐形瓶中,采用回流提取法提取時(shí)間1 h,以30 mL 35%、45%、55%、65%、75%和85%乙醇對(duì)藥材總黃酮提取率做單因素試驗(yàn),結(jié)果表明,75%乙醇回流提取地耳草藥材總黃酮的提取率最高(圖2)。

        圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響

        2.3.3 提取體積的考察 取藥材粉末約1.0 g,精密稱定,置錐形瓶中,采用回流提取法提取時(shí)間1 h,以 10、20、30、40、50 和 60 mL 75% 乙醇對(duì)藥材總黃酮提取率做單因素試驗(yàn),結(jié)果表明,提取體積為30 mL 的提取率最高(圖3)。

        圖3 提取體積對(duì)總黃酮提取率的影響

        2.3.4 提取時(shí)間考察 取藥材粉末約1.0 g,精密稱定,置錐形瓶中,采用回流提取法以75%乙醇30 mL,考察提取時(shí)間為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h 對(duì)藥材總黃酮提取率的影響,結(jié)果表明,提取時(shí)間為1.0 h 的提取率最高(圖4)。

        圖4 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

        2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

        根據(jù)正交設(shè)計(jì)助手軟件、試驗(yàn)方差分析結(jié)果可知,乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮的提取工藝有顯著性影響,而提取體積和提取時(shí)間無顯著性差異,且各影響因素的強(qiáng)弱為乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)>料液比(B)>提取時(shí)間(C),對(duì)地耳草總黃酮含量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素是乙醇體積分?jǐn)?shù),提取體積和提取時(shí)間沒有顯著性意義,因此最理想的提取方案是A2B2C2,即75%乙醇、料液比1∶30、回流提取1.0 h 提取效果最佳(圖5)。

        2.5 樣品含量測(cè)定

        精密稱取每個(gè)產(chǎn)地的地耳草藥材粉末3 份,每份約1.0 g,置錐形瓶中制備供試品溶液,測(cè)定總黃酮含量,結(jié)果見表6。

        表4 正交試驗(yàn)結(jié)果

        表5 正交試驗(yàn)方差分析

        表6 不同產(chǎn)地的地耳草藥材總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

        3 小結(jié)與討論

        試驗(yàn)以地耳草為研究對(duì)象,考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取體積和提取時(shí)間3 個(gè)影響因素,采用回流提取法,利用正交試驗(yàn)方法來優(yōu)選地耳草總黃酮的最佳提取工藝,確定影響地耳草總黃酮提取工藝的主要因素是溶劑體積分?jǐn)?shù)、提取體積和提取時(shí)間等。地耳草的最佳提取工藝為回流提取,乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%,料液比1∶30,提取1.0 h。

        在相同試驗(yàn)條件下,加入同體積、同體積分?jǐn)?shù)的乙醇可能會(huì)出現(xiàn)提取率不一致的狀況。具體原因可能是由于地耳草藥材粉末接觸乙醇的溶劑面積不一樣。但是在加入相同質(zhì)量地耳草的情況下,加入乙醇的量越多,提取率越高,呈正相關(guān)關(guān)系。除此之外,還可以考察更多的因素,如提取溫度、提取溶劑、溶劑pH 和提取次數(shù)等,且每個(gè)因素也可以通過單因素試驗(yàn)確定更好的試驗(yàn)水平,再通過正交試驗(yàn)優(yōu)選出提取率更佳的方案。

        不同產(chǎn)地地耳草中總黃酮含量差異較大,廣西富川縣產(chǎn)的地耳草總黃酮含量最高,其次是廣西賀州市和廣西昭平縣,而廣西合浦縣和廣西北海市產(chǎn)的地耳草總黃酮含量較低。可能是由于不同地域、不同氣候、不同土壤以及不同的采摘季節(jié)影響而產(chǎn)生的結(jié)果。

        地耳草自然資源豐富,在臨床中應(yīng)用廣泛。通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),目前對(duì)地耳草總黃酮的研究還較少,為保障其臨床用藥合理、安全、有效,本研究通過正交試驗(yàn)篩選出地耳草總黃酮的最佳提取工藝,為進(jìn)一步研究、開發(fā)地耳草的藥用資源提供科學(xué)依據(jù)。

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