張 麗，趙忠濤，顧 靜

（江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212400）

近年來，由銅、鉛等重金屬所造成的農(nóng)業(yè)環(huán)境污染變得越來越嚴重。重金屬進入土壤后難以被生物降解，除了不可逆轉(zhuǎn)和長期性外，其隱蔽性和潛伏性更強，從而使凈化和修復受污染的土壤變得很困難。因此，人類的生存環(huán)境和生態(tài)環(huán)境的健康發(fā)展嚴重地受到了重金屬污染的影響［1］。

重金屬銅是植物生長必不可少的重要微量元素，它是某些氧化還原酶如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、細胞色素氧化酶和蛋白質(zhì)的關(guān)鍵組成成分。因此，銅較大地影響著發(fā)生在植物體內(nèi)的氧化還原過程。在植物的葉綠體中銅也廣泛存在，其主要作用是參與植物的光合作用［2］。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，銅鹽還是一種重要的農(nóng)藥和殺菌劑，在植物的生長發(fā)育中起著重要的作用。在正常情況下，植物對銅的吸收主要是通過受代謝控制的主動吸收過程來實現(xiàn)。但是，當土壤中重金屬銅濃度超過一定值時，會對植物產(chǎn)生一定的毒性和負面影響。輕則使植物的新陳代謝過程受到干擾，將阻止植物的正常生長和發(fā)育，重則會導致植物的老化和凋亡。土壤中重金屬銅造成的污染可以通過使用草坪進行修復，這樣土壤不僅可以得到凈化，而且對人類的生產(chǎn)條件和生活環(huán)境也有著有益的影響［3］。為此，本研究通過分析不同濃度銅對潤草1 號生化指標的影響，以期為制定中國重金屬污染地區(qū)土壤中重金屬銅的含量標準，以及為開發(fā)利用潤草1 號修復被重金屬銅污染的土壤、草坪綠地建設和規(guī)劃提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用的材料為潤草1 號，是中國廣泛栽培的一種早熟禾品種，由鎮(zhèn)江潤祥園林科技發(fā)展有限公司培育及提供。選用經(jīng)過烘干滅菌后的3～5 mm 直徑的細沙為培養(yǎng)基質(zhì)。重金屬銅添加形式為 CuSO4·5H2O，分析純。

1.2 試驗設計

將沙子過 5 mm 目篩后，用 2%（V/V）HNO3溶液浸泡過夜，并用去離子水洗凈，然后洗凈的沙子放在托盤里置于干燥箱中，在105 ℃條件下烘干1 h 滅菌，再在80 ℃條件下烘干約3 h 至恒重。分別稱重6 kg沙子，裝入25個塑料花盆，所用花盆的上口直徑為25.8 cm、下口直徑為16.3 cm、高為22.5 cm。試驗時，以不添加重金屬銅的處理方法作為對照，并將重金屬銅的脅迫濃度設定為5、10、20、50、100 mg/kg（以Cu2+計量重金屬銅的脅迫濃度），每處理重復4 次。

根據(jù)預設的重金屬銅的脅迫濃度，在每個花盆中添加5 種不同濃度的重金屬銅溶液各1 000 mL。每天噴施適量的去離子水，使每個花盆的重量保持不變。平衡2 周后，在每個花盆中添加Hoagland 營養(yǎng)液20 mL。潤草1 號種子在去離子水中浸泡24 h后，再在每個花盆中播種300 粒。每天繼續(xù)噴施適量的去離子水，以確保每個花盆的重量保持不變。室溫25 ℃左右培養(yǎng)，每日光照8 h，全天通氣。種植1 個月后，分別取樣分析。

1.3 測定方法

采用考馬斯亮藍法測定潤草1 號葉片中總蛋白質(zhì)的含量；采用蒽酮法測定潤草1 號葉片中可溶性糖的含量；潤草1 號葉片中SOD 的活性和POD 的活性采用試劑盒法測定。測定時所使用的主要儀器是UV-2100 紫外/可見分光光度計。

2 結(jié)果與分析

2.1 重金屬銅脅迫對潤草1 號葉片中總蛋白質(zhì)含量的影響

在植物體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)主要是各種代謝酶，其含量高低反映了細胞在植物體內(nèi)的整體代謝能力［4］，在某種程度上也反映了植物的生長潛力。當重金屬離子進入植物體時，會與其他化合物結(jié)合成螯合物或者生成絡合物，從而抑制了植物的新陳代謝，特別是影響蛋白質(zhì)合成。因此，可溶性蛋白質(zhì)的含量是植物是否受到重金屬脅迫的一個重要指標［5］。從圖1 可以看出，經(jīng)銅處理后，潤草 1 號葉片中可溶性蛋白質(zhì)含量發(fā)生了顯著的變化。隨著銅濃度的增大，可溶性蛋白質(zhì)的含量先上升，隨后下降。銅濃度為10 mg/kg 時，可溶性蛋白質(zhì)含量達到最大值。

圖1 不同濃度銅脅迫對潤草1號葉片中總蛋白質(zhì)含量的影響

2.2 重金屬銅脅迫對潤草1 號葉片中可溶性糖含量的影響

可溶性糖是植物體內(nèi)重要的有機物之一，也是植物碳和能量的重要來源。為了適應干旱、低溫、重金屬等逆境條件，植物會積極積累一些可溶性糖，以提高自身的滲透調(diào)節(jié)能力和降低冰點?？扇苄蕴鞘侵参镌谀婢持挟a(chǎn)生的適應性產(chǎn)物，因此有利于增強植物的抗逆性［6］。從圖2 可以看出，銅處理后，潤草1 號葉片中可溶性總糖含量發(fā)生了明顯的變化，隨著銅濃度的增大先升高后降低。銅濃度為20 mg/kg時，可溶性總糖含量達到最大值。

圖2 不同濃度銅脅迫對潤草1號葉片中可溶性糖含量的影響

2.3 重金屬銅脅迫對潤草1 號葉片中SOD 活性的影響

超氧化物歧化酶（SOD）是植物體內(nèi)最重要的自由基清除酶，它的主要生理功能是消除植物體內(nèi)廣泛存在的超氧陰離子自由基（），使·轉(zhuǎn)變成沒有毒性的氧氣和毒性比較低的過氧化氫，并減少具有較大毒性和較高活性的·OH 的生成，從而使植物體內(nèi)存在的自由基保持在較低的水平，以減輕·對植物的傷害［7］。SOD 的活性水平與植物的抗逆性密切相關(guān)。在面對中等強度的逆境時，SOD 的活性增強是為了有效提高植物抵抗逆境的能力，從而使植物能夠適應逆境而存活下來。植物能夠成功地抵抗逆境脅迫的生理基礎(chǔ)就是具有較高的SOD 活性。從圖3 可以看出，銅處理后，隨著銅濃度的增大，潤草1號葉片中SOD活性表現(xiàn)為先上升后下降，發(fā)生了顯著的變化。銅濃度為50 mg/kg 時，SOD 活性達到最大值。

圖3 不同濃度銅脅迫對潤草1 號葉片中SOD 活性的影響

2.4 重金屬銅脅迫對潤草1 號葉片中POD 活性的影響

過氧化物酶（POD）在植物的各種組織中廣泛存在，其活性較高，與植物的光吸收、光氧化等有關(guān)［8］。POD 主要生理功能是消除分子氧在代謝過程中產(chǎn)生的過氧化氫和其他過氧化物，使自由基保持在較低水平，從而避免自由基對植物的傷害［9］，在植物的抗氧化代謝過程中起著非常重要的作用。POD 是一種更有效的適應性酶，反映植物生長、內(nèi)部代謝和適應外部環(huán)境的能力。植物在重金屬的脅迫下，各種組織中廣泛存在的POD 活性表現(xiàn)出明顯的升高或降低。從圖4 可以看出，銅處理后，潤草1 號葉片中POD 活性發(fā)生了顯著的變化，隨著銅濃度的增大表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢。銅濃度為20 mg/kg時，POD 活性達到最大值。

圖4 不同濃度銅脅迫對潤草1 號葉片中POD 活性的影響

3 小結(jié)與討論

糖是小分子物質(zhì)，在植物受到滲透脅迫時起到重要的調(diào)節(jié)作用，脯氨酸在植物體內(nèi)積累時也需要糖的參與。糖具有較強的氧化還原能力，脯氨酸合成時所必需的氧化還原能力就是糖通過氧化磷酸化提供的，它是植物進行新陳代謝所必需的基礎(chǔ)物質(zhì)［10］。試驗結(jié)果表明，潤草1 號葉片中可溶性糖含量對重金屬銅的脅迫非常敏感。銅濃度較低時，可溶性糖含量略有增加，可能是潤草1 號葉片內(nèi)不溶性糖（如淀粉、纖維素等）發(fā)生了降解引起的，也可能是光合作用產(chǎn)生的淀粉在運輸過程中受到了阻礙的結(jié)果，還有可能是葡萄糖酶和蔗糖酶的活性在代謝過程中出現(xiàn)了反常所引起的［11］。銅濃度較高時，可溶性糖的含量大幅下降，可能是潤草1 號葉片中進行光合作用的整個系統(tǒng)受到了銅的破壞，造成了葉片內(nèi)不溶性糖發(fā)生分解且不能進行正常的運輸［11］；也可能是高濃度銅脅迫下，降低了潤草1 號葉片的含水量，使葉片內(nèi)積累的可溶性糖通過滲透調(diào)節(jié)作用避免細胞受到傷害。

蛋白質(zhì)是生物體進行生命活動必不可少的基礎(chǔ)物質(zhì)，生物體內(nèi)細胞代謝酶的變化情況可以通過可溶性蛋白質(zhì)含量來反映。試驗結(jié)果表明，隨著銅脅迫濃度的增加，潤草1 號葉片內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢。銅濃度較低時，為了減輕銅脅迫造成的傷害，潤草1 號葉片以蛋白質(zhì)的合成為主，因此蛋白質(zhì)含量升高。隨著銅濃度的增大，潤草1 號葉片的細胞結(jié)構(gòu)被破壞，阻礙了蛋白質(zhì)的合成，加快了原有蛋白質(zhì)的分解，導致細胞代謝酶和可溶性蛋白質(zhì)受到破壞，使?jié)櫜? 號葉片內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量出現(xiàn)了不同程度的下降。

自由基的產(chǎn)生和清除是植物細胞內(nèi)進行的兩個相反過程，只有在各種保護酶協(xié)同作用下才能清除產(chǎn)生的自由基，使植物細胞免受自由基的傷害［12］。重金屬銅脅迫下，潤草1 號葉片內(nèi)各種保護酶活性也發(fā)生相應的改變，但因脅迫濃度的不同而有所不同。試驗結(jié)果表明，隨著銅脅迫濃度的增大，潤草1號葉片內(nèi)SOD 的活性先升高后降低。在低濃度銅脅迫下，潤草1 號葉片細胞內(nèi)自由基產(chǎn)生的比較少，SOD 的活性變化也比較小。隨銅脅迫濃度的增大，潤草1 號葉片內(nèi)則產(chǎn)生大量的氧自由基使其濃度迅速增加，SOD 活性也相應地增大以歧化活性氧，脅迫下SOD 活性的增大還可能與酶蛋白的大量合成有關(guān)［13］，使?jié)櫜? 號表現(xiàn)出較強的抗氧化和抗損傷的能力。但當產(chǎn)生的自由基大于SOD 清除能力時，SOD 活性也會受到自由基的影響，其活性大幅下降甚至完全失去活性，同時其他代謝酶也會受到自由基的傷害，甚至引起潤草1 號的凋亡。因此，在重金屬銅脅迫下，高的SOD 活性對維持潤草1 號對氧化損傷的整體防御能力具有重要的作用。

活性氧和自由基具有很強的毒害作用，只有保持其產(chǎn)生與清除的平衡，才能使細胞膜系統(tǒng)免受損傷?？寡趸瘎┖捅Ｗo酶對平衡起著調(diào)節(jié)與控制作用，若平衡被破壞會使脂膜的過氧化作用加劇，對細胞膜系統(tǒng)造成破壞［14］。POD 能清除活性氧和自由基，是植物在逆境脅迫下的重要保護酶類。當潤草1 號葉片受銅脅迫后，葉片內(nèi)POD 活性隨著銅脅迫濃度的增大，先應激性升高然后降低，在銅脅迫濃度為20 mg/kg 時潤草1 號葉片內(nèi)POD 活性出現(xiàn)高峰值。POD 活性升高的原因可能是由于銅脅迫濃度小于20 mg/kg 時，潤草1 號葉片內(nèi)有大量的活性氧（如·、·OH、H2O2等）累積，這些活性氧不但使脂膜的過氧化作用增強，也使POD 活性升高，從而減輕了活性氧對脂膜的傷害。當銅脅迫濃度大于20 mg/kg時，潤草1 號葉片受到較大傷害防御能力下降，不能將產(chǎn)生的活性氧及時除去而生成毒性更大的·OH 自由基，對脂膜造成不可逆轉(zhuǎn)的傷害，使?jié)櫜? 號葉片結(jié)構(gòu)遭到破壞；也對POD 造成傷害活性急劇下降，使其清除活性氧的能力降低，加劇了脂膜的氧化及結(jié)構(gòu)和功能的破壞，導致潤草1 號的生理代謝紊亂并加速其凋亡，這也是銅毒害潤草1 號的主要原因。