方慧玲， 葛丹紅， 朱宇清， 朱嶺峰， 趙曉君， 陳子齊， 王梓蒙

（上海市臨床檢驗(yàn)中心，上海 200126）

維生素D是一類脂溶性類固醇激素，通過(guò)調(diào)節(jié)腸鈣吸收和腎臟重吸收維持鈣平衡。隨著人口老齡化和疾病譜的改變，維生素D作為維持生命活動(dòng)所必需的一類有機(jī)物質(zhì)，其主要作用已經(jīng)從傳統(tǒng)應(yīng)用范疇擴(kuò)展到心血管疾病、自身免疫性疾病、糖尿病、腫瘤等各類疾病的治療中[1-3]，具有減輕胰島素抵抗、調(diào)節(jié)免疫、移植細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞分化、抗炎性反應(yīng)及抗纖維化等非骨骼系統(tǒng)作用[4-6]。生理狀態(tài)下，人體血液中維生素D的主要形式是25-羥基維生素D[25-hydroxyvitamin D，25（OH）D]，是評(píng)價(jià)維生素D營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的最佳指標(biāo)。

隨著維生素D的功能被不斷深入地認(rèn)識(shí)，臨床對(duì)25（OH）D的檢測(cè)需求也日益增加，檢測(cè)質(zhì)量日益受到重視，商品化25（OH）D檢測(cè)試劑盒種類也越來(lái)越多。常用的25（OH）D檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)原理包括全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光法、電化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，還有一些實(shí)驗(yàn)室自建的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。有研究發(fā)現(xiàn)，不同方法檢測(cè)25（OH）D的結(jié)果差異顯著[7]。檢測(cè)結(jié)果不同將直接影響到臨床醫(yī)生對(duì)患者體內(nèi)維生素D水平的判斷[8]，因此如何做好25（OH）D的檢測(cè)質(zhì)量控制，成為質(zhì)量保證的重點(diǎn)。

室間質(zhì)量評(píng)價(jià)（external quality assessment，EQA）是由實(shí)驗(yàn)室外部的某個(gè)獨(dú)立機(jī)構(gòu)按照預(yù)先制定的準(zhǔn)則，利用實(shí)驗(yàn)室間的結(jié)果對(duì)參評(píng)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)能力評(píng)價(jià)的活動(dòng)[9]。上海市臨床檢驗(yàn)中心（Shanghai Center for Clinical Laboratory，SCCL）是獲得中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)認(rèn)可的臨床檢驗(yàn)質(zhì)量控制組織評(píng)價(jià)機(jī)構(gòu)。SCCL每年按計(jì)劃向各實(shí)驗(yàn)室發(fā)放未知樣本，對(duì)檢驗(yàn)人員的技術(shù)水平進(jìn)行考核，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，2015年開始開展25（OH）D項(xiàng)目的EQA活動(dòng)。本研究主要針對(duì)上海地區(qū)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室2015—2019年EQA 25（OH）D檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，以了解上海地區(qū)25（OH）D的檢測(cè)質(zhì)量，為該項(xiàng)目的標(biāo)準(zhǔn)化提供參考。

1 材料和方法

1.1 EQA樣品準(zhǔn)備

2015—2019年25（OH）D EQA樣品均為商品化質(zhì)控品，其中2015、2016年EQA樣品購(gòu)自英國(guó)朗道公司，2017、2018、2019年EQA樣品購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司。該項(xiàng)目所有質(zhì)控品均為經(jīng)處理的人源血清制備的血清樣品。所有樣品發(fā)放前均按照能力驗(yàn)證提供者認(rèn)可準(zhǔn)則（CNASCL03：2010）[10]要求進(jìn)行均勻性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)，確保每個(gè)參評(píng)實(shí)驗(yàn)室都收到具有可比性的能力驗(yàn)證樣品，并且在整個(gè)能力驗(yàn)證過(guò)程中保持穩(wěn)定。所有EQA質(zhì)控品均在2～8 ℃條件下運(yùn)輸和保存。

1.2 方法

1.2.1 EQA方案設(shè)計(jì) 25（OH）D 項(xiàng)目的EQA計(jì)劃設(shè)計(jì)在內(nèi)分泌組，各質(zhì)控品由SCCL統(tǒng)一時(shí)間發(fā)放，每年2次，每次發(fā)放5水平樣品。各實(shí)驗(yàn)室按說(shuō)明書要求復(fù)溶后，按日?；颊邫z測(cè)樣本處理方式處理，由日常工作人員使用實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)系統(tǒng)（儀器、試劑和方法等）檢測(cè)，檢測(cè)次數(shù)應(yīng)與常規(guī)檢測(cè)患者樣本的次數(shù)相同。檢測(cè)結(jié)束后按照要求上報(bào)結(jié)果。

1.2.2 結(jié)果評(píng)價(jià)與分析 根據(jù)SCCL能力驗(yàn)證項(xiàng)目統(tǒng)計(jì)方案對(duì)上報(bào)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。EQA統(tǒng)計(jì)分析以參加者的公議值為指定值。上報(bào)數(shù)據(jù)根據(jù)檢測(cè)儀器進(jìn)行分組，分別為瑞士羅氏公司（簡(jiǎn)稱羅氏）、意大利索靈公司（簡(jiǎn)稱索靈）、深圳新產(chǎn)業(yè)公司（簡(jiǎn)稱新產(chǎn)業(yè)）、深圳邁瑞公司（簡(jiǎn)稱邁瑞）、德國(guó)西門子公司（簡(jiǎn)稱西門子）、美國(guó)雅培公司（簡(jiǎn)稱雅培），剔除粗大誤差后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。上報(bào)數(shù)據(jù)中明顯的錯(cuò)誤結(jié)果（單位換算、小數(shù)點(diǎn)、計(jì)算等粗大誤差）由專家識(shí)別，并且計(jì)算合計(jì)統(tǒng)計(jì)量時(shí)剔除該值，但這些結(jié)果仍在能力驗(yàn)證計(jì)劃中予以評(píng)價(jià)。25（OH）D項(xiàng)目的能力評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)為靶值±25%，參評(píng)實(shí)驗(yàn)室某一樣品檢測(cè)結(jié)果在能力評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，則該樣品檢測(cè)結(jié)果為滿意。1次能力驗(yàn)證活動(dòng)參評(píng)實(shí)驗(yàn)室單個(gè)項(xiàng)目的5個(gè)樣品檢測(cè)結(jié)果至少80%達(dá)到滿意，則該項(xiàng)目為合格，某一項(xiàng)目的得分計(jì)算公式為：該項(xiàng)目的可接受結(jié)果數(shù)/該項(xiàng)目總測(cè)定樣品數(shù)×100。本研究其他數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件完成，對(duì)不同分組樣本進(jìn)行Mann-Whitney Wilcoxon檢驗(yàn)和Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，不同年度單項(xiàng)目合格率進(jìn)行Pearsonχ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)室回報(bào)情況

參加SCCL EQA活動(dòng)的實(shí)驗(yàn)室包括上海地區(qū)開展該項(xiàng)目的各級(jí)各類醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)檢驗(yàn)科、臨床實(shí)驗(yàn)室、醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室以及儀器、試劑生產(chǎn)企業(yè)實(shí)驗(yàn)室和獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室。2019年共83家參評(píng)實(shí)驗(yàn)室上報(bào)25（OH）D檢測(cè)結(jié)果，除1家采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)外，其他82家均為化學(xué)發(fā)光發(fā)和電化學(xué)發(fā)光法；有85.54%的實(shí)驗(yàn)室使用進(jìn)口檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)25（OH）D。見表1。

2.2 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力評(píng)價(jià)

SCCL 2015—2019年開展10次25（OH）D EQA活動(dòng)，發(fā)放不同濃度水平樣品50份。參評(píng)實(shí)驗(yàn)室從2015年第1次的41家逐年增加到2019年第2次的83家，增加了102.4%。參評(píng)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)方法包括化學(xué)發(fā)光法、電化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、熒光免疫法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜及其他方法。2015年第1次EQA 27家合格、5家不合格、9家不評(píng)價(jià)，單項(xiàng)合格率為65.8%（27/41）；2019年第2次EQA 77家合格、1家不合格、5家不評(píng)價(jià)，單項(xiàng)目合格率為92.8%（77/83）。見表2。

表2 2015—2019年上海地區(qū)25（OH）D EQA合格率

根據(jù)2015—2019年25（OH）D EQA上報(bào)數(shù)據(jù)剔除粗大誤差后總體均值（）、標(biāo)準(zhǔn)差（s）和變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）等統(tǒng)計(jì)量（表3），對(duì)不同檢測(cè)批次的EQACV作Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)和Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，不同年度25（OH）D檢測(cè)結(jié)果CV差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000 1）。2019年EQA數(shù)據(jù)按照檢測(cè)方法分為化學(xué)發(fā)光法、電化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)3個(gè)組，除1921、1922 2個(gè)批次外，其他批次樣品不同方法檢測(cè)結(jié)果差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。2019年不同儀器組EQA數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表4、表5。

表3 2015—2019年25（OH）D EQA數(shù)據(jù)（剔除后）

表4 2019年25（OH）D項(xiàng)目第1次EQA數(shù)據(jù)（剔除前）

表5 2019年25（OH）D項(xiàng)目第2次EQA數(shù)據(jù)（剔除前）

2.3 不同儀器組檢測(cè)結(jié)果與液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法的比較

2015—2019年，23個(gè)批次EQA質(zhì)控品用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見表6。

表6 2015—2019年23個(gè)批次EQA質(zhì)控品的質(zhì)譜檢測(cè)數(shù)據(jù)

以液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)值作為參考值，對(duì)應(yīng)批次的EQA上報(bào)數(shù)據(jù)根據(jù)檢測(cè)儀器進(jìn)行分組，比較組內(nèi)均值和參考值，計(jì)算偏移，計(jì)算公式為：偏移=（組內(nèi)均值-參考值）/參考值，實(shí)驗(yàn)室數(shù)＜2時(shí)直接使用原始數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。各儀器組（實(shí)驗(yàn)室數(shù)＞2家）與液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)結(jié)果的差異見圖1。

圖1 各儀器組均值與液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果的偏移

3 討論

我國(guó)人群維生素D缺乏的情況廣泛存在[11]。隨著臨床對(duì)25（OH）D檢測(cè)需求的增多，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)25（OH）D的檢測(cè)質(zhì)量也受到廣泛關(guān)注[12]。2010年，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院、美國(guó)疾病預(yù)防控制中心、美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)研究院和比利時(shí)根特大學(xué)合作，開始維生素D標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)劃，以期解決維生素D檢測(cè)面臨的問(wèn)題。美國(guó)病理學(xué)家協(xié)會(huì)組織的維生素D正確度驗(yàn)證計(jì)劃數(shù)據(jù)顯示，能力驗(yàn)證計(jì)劃對(duì)實(shí)驗(yàn)室維生素D檢測(cè)能力的提升起到了良好的促進(jìn)作用[13]。SCCL也于2018年開始開展基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法的EQA和正確度驗(yàn)證計(jì)劃。本研究結(jié)果顯示，上海地區(qū)醫(yī)學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室25（OH）D 項(xiàng)目的EQA合格率從2015年的65.8%上升到2019年的92.8%，單項(xiàng)合格率顯著提高。從每年EQA數(shù)據(jù)的CV中位數(shù)看，上海地區(qū)醫(yī)學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)25（OH）D的檢測(cè)離散程度逐漸變小，提示各實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)能力一致性有所提高。對(duì)不合格的結(jié)果進(jìn)行分析，推測(cè)不合格原因主要有以下幾個(gè)方面：（1）質(zhì)控品運(yùn)輸和保存時(shí)，出現(xiàn)嚴(yán)重偏離正常保存條件的情況，導(dǎo)致質(zhì)控品變質(zhì)；（2）實(shí)驗(yàn)室人員未嚴(yán)格按說(shuō)明書要求進(jìn)行樣品復(fù)溶；（3）上報(bào)錯(cuò)誤，如未進(jìn)行單位換算或質(zhì)控品編號(hào)混淆及填寫錯(cuò)誤；（4）儀器/方法的性能變化，如儀器故障等。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)加強(qiáng)人員培訓(xùn)及儀器維護(hù)，以提高檢測(cè)質(zhì)量。

盡管25（OH）D項(xiàng)目EQA合格率在逐年提高，但不同檢測(cè)方法與檢測(cè)系統(tǒng)間的差異依舊存在。2019年10批次EQA樣品檢測(cè)數(shù)據(jù)間差異顯著（表4、表5），與之前的血清樣品的EQA結(jié)果一致[14]。結(jié)合廠家聲稱的試劑性能與檢測(cè)參考區(qū)間（表1）對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，推測(cè)造成這一現(xiàn)象的原因除了不同系統(tǒng)本身存在的差異之外，還可能與本研究所選用的檢測(cè)樣品類型有關(guān)。本研究中所有樣品均為經(jīng)處理的人源血清制備的血清樣品，廠家在制備過(guò)程中基于穩(wěn)定性或凍干成形的要求可能添加了非血清來(lái)源的物質(zhì)，從而使樣品基質(zhì)發(fā)生改變。這些添加劑產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)可能導(dǎo)致了不同檢測(cè)系統(tǒng)間檢測(cè)結(jié)果的差異。本研究結(jié)果顯示，化學(xué)發(fā)光法的CV顯著高于電化學(xué)發(fā)光法的CV，除了方法學(xué)差異的影響外，還有可能是因?yàn)榛瘜W(xué)發(fā)光法組里包含了不同的儀器組，而電化學(xué)發(fā)光法只有羅氏組。化學(xué)發(fā)光法組中，盡管采用的方法相同，不同品牌抗體識(shí)別抗原表位的差異可能會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)25（OH）D的檢測(cè)能力出現(xiàn)差異，血液中其他維生素D代謝物或類似物的干擾也會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的差異。近年來(lái)，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法因可對(duì)目標(biāo)化合物直接定量而逐漸成為“金標(biāo)準(zhǔn)”的檢測(cè)方法。本研究不同檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果與液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法的差異依舊存在，但隨著EQA的開展，部分檢測(cè)系統(tǒng)與液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法的差異逐漸減小，檢測(cè)性能有所提升。本研究中液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、電化學(xué)發(fā)光法和熒光免疫法3種方法因使用的實(shí)驗(yàn)室太少，其在EQA中的表現(xiàn)需要更多數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究也存在一定的缺陷：一是本研究是對(duì)歷年EQA數(shù)據(jù)的回顧性分析，質(zhì)控物檢測(cè)結(jié)果的差異并不能等同于常規(guī)檢測(cè)樣本的結(jié)果差異；二是質(zhì)控物濃度不能完全覆蓋醫(yī)學(xué)決定水平，如2019年缺乏25（OH）D＜30 ng/mL的質(zhì)控品，因此無(wú)法準(zhǔn)確評(píng)價(jià)各檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)低濃度25（OH）D的檢測(cè)能力。

隨著臨床對(duì)維生素D的應(yīng)用的拓展，維生素D檢測(cè)的質(zhì)量也越來(lái)越受重視。EQA作為一項(xiàng)質(zhì)量保證活動(dòng)，也是內(nèi)部質(zhì)量控制的有效補(bǔ)充，其結(jié)果也逐漸成為各國(guó)際組織、認(rèn)可機(jī)構(gòu)和政府管理部門對(duì)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力進(jìn)行監(jiān)督評(píng)價(jià)的依據(jù)。我們希望通過(guò)EQA活動(dòng)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中存在的問(wèn)題，并加以改進(jìn)，以提高各醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室的25（OH）D檢測(cè)水平，逐步提高常規(guī)檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可比性，為檢測(cè)結(jié)果互認(rèn)提供保證。