林小玲， 梁立鋒， 吳影桃， 趙杰明， 蔡秋月

（1.羅定市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 云浮 527200；2.云浮市慢性病防治中心檢驗(yàn)科，廣東 云浮 527300；3.云浮市慢性病防治中心結(jié)核病防治科，廣東 云浮 527300）

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（Mycobacterium tuberculosiscomplex，MTBC）感染引起的一種嚴(yán)重危害人類健康的慢性傳染病，傳染性強(qiáng)。我國(guó)是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家，近年來(lái)的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)肺結(jié)核病的發(fā)病率越來(lái)越高，耐藥情況也相當(dāng)嚴(yán)重，已逐漸呈現(xiàn)出高感染率、高發(fā)病率、高耐藥率、高死亡率等特點(diǎn)[1-3]，尤其是耐多藥和廣泛耐藥結(jié)核病，已經(jīng)成為結(jié)核病防治的挑戰(zhàn)性難題[4]。另外，非結(jié)核分枝桿菌（Nontuberculous mycobacterium，NTM）感染也較常見(jiàn)，發(fā)病率也呈逐年上升趨勢(shì)[5]，患者發(fā)病癥狀、影像學(xué)檢查及痰涂片鏡檢與肺結(jié)核病易混淆，常導(dǎo)致誤診。鑒于各地區(qū)結(jié)核病疫情特點(diǎn)的不同[6]，為了解云浮地區(qū)肺結(jié)核病流行狀況及耐藥特點(diǎn)，以便制定有效、合理的治療方案，本研究分析了云浮地區(qū)近3年MTBC的耐藥情況。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

收集2016—2019年分離自云浮市區(qū)及云安區(qū)、新興縣、羅定市和郁南縣5個(gè)慢性病防治機(jī)構(gòu)結(jié)核病門診確診結(jié)核病初診患者痰培養(yǎng)陽(yáng)性菌株1 571株，患者男1 158例、女413例，年齡14～92歲。MTBC標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv由廣東省結(jié)核病控制中心提供，冷凍保存。

1.2 儀器和試劑

HR40-ⅡA2型生物安全柜（青島海爾特種電器有限公司），450型CO2培養(yǎng)箱（上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），22 SWG標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)（廣州市尤德生物科技有限公司）。改良中性羅氏培養(yǎng)基、酸性羅氏培養(yǎng)基、500 μg/mL對(duì)硝基苯甲酸（P-nitrobenzoic acid，PNB）培養(yǎng)基以及9種含藥培養(yǎng)基，9種含藥培養(yǎng)基分別為4種一線抗結(jié)核病藥物培養(yǎng)基（異煙肼0.2 μg/mL、利福平40 μg/mL、鏈霉素4 μg/mL、乙胺丁醇2 μg/mL）、5種二線抗結(jié)核病藥物培養(yǎng)基（氧氟沙星2 μg/mL、卡那霉素30 μg/mL、丙硫異煙胺5 μg/mL、對(duì)氨基水楊酸2 μg/mL、卷曲霉素40 μg/mL），購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 MTBC分離、培養(yǎng) 將痰樣本用4%NaOH溶液處理后，分別接種于4支酸性羅氏培養(yǎng)基，培養(yǎng)8周，培養(yǎng)物涂片染色確定為抗酸菌后，納入本研究的病例菌株。

1.3.2 MTBC鑒別試驗(yàn) 以PNB培養(yǎng)基作為鑒別培養(yǎng)基，將入選菌株同時(shí)接種于空白改良中性羅氏培養(yǎng)基（空白對(duì)照培養(yǎng)基）和PNB培養(yǎng)基，空白對(duì)照培養(yǎng)基生長(zhǎng)而PNB培養(yǎng)基不生長(zhǎng)，即為MTBC；在空白對(duì)照培養(yǎng)基和PNB培養(yǎng)基上都生長(zhǎng)，即為NTM。具體操作步驟參照《耐多藥肺結(jié)核防治管理工作方案》[7]與《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[8]進(jìn)行。

1.3.3 體外藥物敏感性試驗(yàn) 采用比例法進(jìn)行菌株對(duì)9種抗結(jié)核病藥物的體外藥物敏感性試驗(yàn)，操作按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[8]進(jìn)行。

1.4 質(zhì)量控制

本結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室由廣東省結(jié)核病控制中心定期督導(dǎo)質(zhì)控。MTBC菌群鑒別試驗(yàn)和體外藥物敏感試驗(yàn)由經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的技術(shù)人員操作，并嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行，均以H37Rv標(biāo)準(zhǔn)敏感菌株作為質(zhì)控敏感對(duì)照，在含藥培養(yǎng)基上均不生長(zhǎng)。以空白對(duì)照培養(yǎng)基生長(zhǎng)而PNB培養(yǎng)基不生長(zhǎng)為MTBC菌群鑒別試驗(yàn)質(zhì)控合格，否則重復(fù)試驗(yàn)，直至合格?？瞻讓?duì)照培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)良好，且高稀釋度對(duì)照培養(yǎng)基上菌落數(shù)≥20個(gè)，則體外藥物敏感性試驗(yàn)質(zhì)控合格，否則重復(fù)試驗(yàn)，直至合格。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用率表示。

2 結(jié)果

2.1 MTBC鑒別試驗(yàn)結(jié)果

1 571株分枝桿菌臨床分離株中，有1 514株（96.4%）被鑒定為MTBC，57株（3.6%）被初步鑒定為NTM。

2.2 體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 總體耐藥情況 1 514株MTBC中，有237株（15.70%）存在不同類別的耐藥，其中單耐藥145株（9.60%）、多耐藥57株（3.80%）、耐多藥34株（2.20%）、廣泛耐藥1株（0.07%）。

2.2.2 MTBC對(duì)不同藥物的耐藥情況 237株耐藥MTBC對(duì)一線抗結(jié)核病藥物的耐藥率從高到低依次為鏈霉素（11.2%，170株）、異煙肼（7.5%，114株）、利福平（3.7%，56株）、乙胺丁醇（3.4%，51株）；對(duì)二線抗結(jié)核病藥物的耐藥率從高到低依次為氧氟沙星（1.8%，27株）、對(duì)氨基水楊酸（1.5%，23株）、卷曲霉素和丙硫異煙胺（0.5%，7株）、卡那霉素（0.3%，4株）。

2.2.3 耐多藥和廣泛耐藥菌株交叉耐藥情況 耐多藥菌株對(duì)一線抗結(jié)核病藥物乙胺丁醇的耐藥率最高（67.6%），對(duì)二線抗結(jié)核病藥物氧氟沙星的耐藥率最高（23.5%，8株），其次為卷曲霉素、對(duì)氨基水楊酸、丙硫異煙胺，均為5.9%（2株），對(duì)卡那霉素的耐藥率為0；僅有的1株廣泛耐藥菌株對(duì)一線和二線抗結(jié)核病藥物均耐藥。

2.2.4 耐多藥和廣泛耐藥菌株耐藥譜 耐多藥菌株藥耐譜中，一線抗結(jié)核病藥物以異煙肼+利福平+鏈霉素+乙胺丁醇組合最為常見(jiàn)，耐藥率高達(dá)41.2%；二線抗結(jié)核病藥物以異煙肼+利福平+鏈霉素+乙胺丁醇+氧氟沙星組合最常見(jiàn)，耐藥率為14.7%。1株廣泛耐藥菌株對(duì)所有藥物均耐藥。見(jiàn)表1。

表1 耐多藥菌株耐藥譜

3 討論

結(jié)核病嚴(yán)重威脅公眾健康，NTM的傳染性雖不強(qiáng)，但同MTBC一樣嚴(yán)重危害公眾健康。NTM感染與MTBC感染在治療上有較大差異，誤治會(huì)對(duì)患者感染部位造成實(shí)質(zhì)性損傷，極大影響NTM感染患者的預(yù)后[9]，所以NTM感染所致肺部疾病的準(zhǔn)確診斷非常關(guān)鍵。本研究1 571株菌株中，分離出NTM 57株，檢出率為3.6%，遠(yuǎn)低于全國(guó)平均水平（22.9%）[10]和鄰近市——肇慶的12.34%[11]，與本地區(qū)所屬省份——廣東省的1.85%[12]和鄰近市——茂名市的1.71%[13]相近，提示NTM分布存在地區(qū)差異。目前，結(jié)核分枝桿菌與NTM感染導(dǎo)致的結(jié)核病診斷金標(biāo)準(zhǔn)是羅氏培養(yǎng)法，因細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，通常需4～8周才能出結(jié)果，無(wú)法滿足臨床需求。

耐藥是結(jié)核病化療失敗的主要原因之一。本研究有237株MTBC耐藥菌株，總耐藥率為15.7%，低于全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告顯示的42.1%[10]，也低于廣東?。?1.93%）及珠海市和茂名市的總耐藥率（19.74%、18.25%）[12-14]，提示本地區(qū)MTBC耐藥水平較低。

體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，本地區(qū)MTBC主要以單耐藥為主，耐2種及以上藥物菌株所占比例較小，其中單耐藥、耐多藥、多耐藥菌株的耐藥率分別為9.60%、3.80%、2.20%，較全國(guó)的16.50%、31.60%、11.70%低，與廣東省[12]的12.90%、5.82%、2.99%相近。本地區(qū)廣泛耐藥率（0.07%）比全國(guó)（2.10%）及廣東省（0.34%）低，提示本地區(qū)總耐藥和各類型耐藥水平均接近或低于全國(guó)和本省水平，但仍需提高初診患者的治療質(zhì)量，從源頭上減少耐藥的產(chǎn)生。本研究廣泛耐藥病例雖僅有1例，但提示本地區(qū)已存在廣泛耐藥結(jié)核病患者，應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)測(cè)，防止擴(kuò)散傳播。

本研究結(jié)果顯示，云浮地區(qū)的結(jié)核病患者對(duì)一線抗結(jié)核病藥物鏈霉素和異煙肼耐藥最嚴(yán)重，與全國(guó)及廣東省的情況相符，可能與以前肺結(jié)核病治療方案以鏈霉素+異煙肼組合為主有關(guān)。因此，臨床在制定化療方案時(shí)，對(duì)鏈霉素+異煙肼的使用應(yīng)慎重。本研究中，菌株對(duì)二線抗結(jié)核病藥物氧氟沙星和對(duì)氨基水楊酸的耐藥率最高，異于廣東?。ㄑ醴承呛途砬顾兀┖兔校▽?duì)氨基水楊酸和卡那霉素），提示不同地區(qū)MTBC耐藥情況有所不同，臨床醫(yī)生應(yīng)根據(jù)當(dāng)?shù)鼐甑哪退幪攸c(diǎn)制定合理的治療方案。本地區(qū)結(jié)核病患者對(duì)氟喹諾酮類藥物（氧氟沙星）的耐藥率最高，可能與其本身為廣譜抗菌藥物，基層醫(yī)務(wù)人員在日常診療過(guò)程中過(guò)早使用該藥物有關(guān)。因此，對(duì)于不明原因的感染或肺結(jié)核病合并肺部感染的患者，應(yīng)合理使用喹諾酮類藥物，避免因耐藥影響治療。

耐多藥和廣泛耐藥是結(jié)核病藥物治療面臨的嚴(yán)重挑戰(zhàn)。耐多藥是菌株至少同時(shí)對(duì)異煙肼、利福平耐藥；廣泛耐藥是菌株對(duì)異煙肼、利福平耐藥，同時(shí)對(duì)任何氟喹諾酮類藥物耐藥，以及至少對(duì)1種二線抗結(jié)核病藥物（卷曲霉素、卡那霉素、阿米卡星）耐藥。本地區(qū)耐多藥菌株對(duì)一線抗結(jié)核病藥物乙胺丁醇和鏈霉素的耐藥率分別為67.6%和52.9%，提示本地區(qū)耐多藥菌感染治療在一定程度上主要依靠二線抗結(jié)核病藥物。本研究中，菌株對(duì)二線抗結(jié)核病藥物卡那霉素的耐藥率最低，建議臨床予以關(guān)注；菌株對(duì)卡那霉素、卷曲霉素的耐藥率不高，可用于組成耐多藥治療方案；對(duì)氨基水楊酸、丙硫異煙胺也可作為制定耐藥方案所選擇的藥物，但因其本身屬于抑菌藥物，對(duì)結(jié)核病的治療作用有限。

本研究中，MTBC耐藥譜構(gòu)成呈現(xiàn)出多態(tài)性和復(fù)雜性。耐多藥譜共11種組合，其中異煙肼+利福平+鏈霉素+乙胺丁醇（41.2%）與異煙肼+利福平+鏈霉素+乙胺丁醇+氧氟沙星（14.7%）組合最為常見(jiàn)，因此在制定耐多藥治療方案時(shí)，特別是制定標(biāo)準(zhǔn)化治療方案時(shí)，應(yīng)充分考慮菌株對(duì)這幾種藥物的耐藥情況，調(diào)整治療方案。

本研究中，雖然廣泛耐藥菌株僅有1株，但提示其已經(jīng)產(chǎn)生或開(kāi)始傳播，可能對(duì)本地區(qū)結(jié)核病防控形成威脅，廣泛耐藥結(jié)核病不但抗藥性更強(qiáng)，治療上比耐多藥結(jié)核病更為困難，早發(fā)現(xiàn)和積極防控是關(guān)鍵。

綜上所述，本地區(qū)MTBC耐藥譜的多態(tài)性和復(fù)雜性，一方面提示耐藥成因復(fù)雜，另一方面也在一定程度上提示標(biāo)準(zhǔn)化治療方案可能難以覆蓋足夠的耐藥譜型，應(yīng)開(kāi)展體外藥物敏感性試驗(yàn)，尤其是開(kāi)展耐藥分子生物學(xué)檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果設(shè)計(jì)個(gè)體化治療方案應(yīng)成為耐藥結(jié)核病治療的首選。