呂瑩，郝堯坤，張照蘭（河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 脾胃肝膽病科，鄭州 450000）

細胞凋亡是程序性細胞死亡，具有壞死的生化和形態(tài)學特征，細胞凋亡不僅可能導致細胞死亡，而且在導致受損組織的級聯(lián)反應中起重要作用[1]。肝細胞凋亡是肝臟疾病的重要影響因素，并參與正常肝細胞的發(fā)育和控制肝臟疾病的發(fā)展[2]。槲皮苷（quercitrin），即槲皮素-3-鼠李糖苷，具有較強的抗氧化作用，是一種遍布植物體內(nèi)的生物大分子，為側(cè)柏[3]、魚腥草[4]、桑寄生[5]等傳統(tǒng)中藥材的主要藥物成分，其藥效作用備受人們的重視。近幾年研究發(fā)現(xiàn)槲皮苷發(fā)揮多種生物學作用，包括抗腫瘤[6]、抑制破骨細胞形成[7]、保護血管內(nèi)皮細胞[8]、促進牙周再生[9]、抑制巨噬細胞炎癥[10]等。本實驗采用過氧化氫（H2O2）處理肝細胞損傷進行體外實驗研究，觀察槲皮苷對肝細胞L-02 損傷的保護作用和抗凋亡機制。

1 材料

正常人肝細胞L-02（中國科學院上海細胞生物學研究所），槲皮苷（純度≥98%）、7'-dichloroflurescin diacetate（DCFH-DA）試劑盒（美國Sigma-Aldrich 公司），噻唑藍（MTT）（貨號：M2128）、二甲基亞砜（DMSO）、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（美國GIBCO 公司），異硫氰酸熒光素標記的膜聯(lián)素Ⅴ/碘化丙啶（Annexin Ⅴ-FITC/PI）細胞凋亡檢測試劑盒（貨號：KGA108）（江蘇凱基生物公司），核轉(zhuǎn)錄因子E2 相關因子（Nrf2）、血紅素加氧酶-1（HO-1）、B 細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2 相關X 蛋白（Bax）、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved caspase-3）抗體（美國Cellular Signaling Technology 公司），辣根過氧化物酶標記二抗（北京中杉金橋有限公司），TNF-α（貨號：E-EL-H0109c）、IL-6（貨號：E-ELH0102c）酶聯(lián)免疫（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司），超氧化物歧化酶（SOD）（貨號：S0109）、丙二醛（MDA）（貨號：S0131）檢測試劑盒（碧云天生物技術公司）。

2 方法

2.1 L-02 細胞培養(yǎng)與分組

L-02 細胞中加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。將生長狀態(tài)良好的L-02 細胞分為空白組：正常培養(yǎng)的L-02 細胞；H2O2組：使用0.6 mmol·L－1H2O2處理1 h；槲皮苷處理組：L-02細胞分別使用25、50、100、200、400、800、1600、3200 μmol·L－1槲皮苷預處理3 h 后，使用0.6 mmol·L－1H2O2處理1 h，收集細胞，進行后續(xù)實驗。于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。

2.2 MTT 檢測L-02 細胞增殖

各組L-02 細胞接種于96 孔板中，密度為1×105個·mL－1，培養(yǎng)48 h 后，每孔細胞加入5 mg·mL－1的MTT 溶液20 μL，37℃培養(yǎng)4 h，加入DMSO 150 μL，37℃搖床振蕩培養(yǎng)10 min，于酶標儀測定L-02 細胞在490 nm 處的吸光（OD）值，細胞存活率（%）＝實驗組OD值/對照組OD值×100%。

2.3 DAPI/PI 檢測L-02 細胞凋亡

各組L-02 細胞培養(yǎng)24 h（接種密度1×105個·mL－1），加入多聚甲醛固定，用DAPI 和PI染液染色15 min，染色后，加入甲醇洗滌，棄去甲醇，于熒光顯微鏡下觀察細胞核染色情況，進行DAPI/PI 雙染細胞計數(shù)并計算細胞凋亡率。

2.4 流式細胞術檢測L-02 細胞凋亡

L-02 細胞密度調(diào)整為1×106個·mL－1，參照細胞凋亡率檢測試劑盒說明書的步驟，使用500 μL 緩沖液懸浮細胞，加入Annexin V-FITC 5 μL 混勻，加入PI 5 μL 混勻，室溫遮光反應15 min，置流式細胞儀檢測L-02 細胞凋亡。

2.5 氧化應激指標ROS、SOD 和MDA 的檢測

收集各組L-02 細胞上清液，分別按照ROS、SOD 和MDA 的檢測試劑盒說明書的步驟進行檢測。

2.6 ELISA 法檢測炎癥因子TNF-α 和IL-6 水平

收集各組L-02 細胞上清液，按照ELISA 試劑盒說明書檢測TNF-α和IL-6 水平。

2.7 Western blot 檢測Nrf2、HO-1、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3 蛋白表達

使用RIPA 裂解液提取各組L-02 細胞的總蛋白，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入目的蛋白一抗（Nrf2、HO-1、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3 均為1∶1000 稀釋），4℃孵育過夜，次日用Tris-HCl-Tween 緩沖鹽溶液（TBST）洗膜10 min×3次，加入二抗（1∶800稀釋），室溫孵育1 h，TBST 洗膜10 min×3 次，顯色、曝光，以β肌動蛋白（β-actin）作為內(nèi)參蛋白，分析目的蛋白表達。

2.8 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以平均值±標準差（±s）表示。多組間數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q檢驗，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度槲皮苷對H2O2 處理人肝細胞L-02存活率的影響

與空白組比較，H2O2處理后人肝細胞L-02 存活率降低；與H2O2組比較，50 ～1600 μmol·L－1的槲皮素增加人肝細胞L-02 存活率，3200 μmol·L－1的槲皮素促進H2O2誘導人肝細胞L-02存活率降低（見表1）。其中槲皮苷100、200、400 μmol·L－1條件下的H2O2處理后人肝細胞L-02 存活率相對較高，800 μmol·L－1濃度下的存活率與100 μmol·L－1濃度差異不大，故選用槲皮苷100、200、400 μmol·L－13 個濃度進行后續(xù)實驗。

3.2 槲皮苷對H2O2 處理人肝細胞L-02 凋亡的影響

肝細胞形態(tài)學觀察顯示，與空白組比較，H2O2處理后人肝細胞L-02 膜粗糙，部分膜破裂，透光度低；與H2O2組比較，槲皮苷100、200、400 μmol·L－1濃度組細胞形態(tài)明顯得到改善。DAPI 進行細胞核染色顯示，與空白組（2.15±0.46）%比較，H2O2處理的L-02 染色質(zhì)濃縮、凝聚、斷裂，細胞凋亡（27.46±3.67）%顯著增多（P＜0.05）。與H2O2組比較，槲皮苷100、200、400 μmol·L－1濃度組[（22.12±2.88）%、（16.87±2.34）%、（13.34±1.72）%]細胞凋亡顯著減少。其中槲皮苷 400μmol·L－1效果最佳（見圖1）。

表1 不同濃度的槲皮苷對H2O2 處理肝細胞L-02 增殖的影響(± s，n ＝9)Tab 1 Effect of different concentrations of quercetin on the proliferation of hepatocytes L-02 treated with H2O2 (± s，n ＝9)

表1 不同濃度的槲皮苷對H2O2 處理肝細胞L-02 增殖的影響(± s，n ＝9)Tab 1 Effect of different concentrations of quercetin on the proliferation of hepatocytes L-02 treated with H2O2 (± s，n ＝9)

注：與空白組比較，*P ＜0.05；與H2O2 組比較，#P ＜0.05。Note：Compared with the blank group，*P ＜0.05；compared with the H2O2 group，#P ＜0.05.

組別 細胞存活率/%空白組 100.84±3.13 H2O2 組 59.29±3.71*H2O2 ＋槲皮苷25 μmol·L－1 組 62.05±4.75 H2O2 ＋槲皮苷50 μmol·L－1 組 68.88±5.86#H2O2 ＋槲皮苷100 μmol·L－1 組 73.12±4.63#H2O2 ＋槲皮苷200 μmol·L－1 組 77.44±5.26#H2O2 ＋槲皮苷400 μmol·L－1 組 84.19±3.44#H2O2 ＋槲皮苷800 μmol·L－1 組 74.08±3.35#H2O2 ＋槲皮苷1600 μmol·L－1 組 66.39±3.11#H2O2 ＋槲皮苷3200 μmol·L－1 組 52.21±4.34#

3.3 槲皮苷對H2O2 處理人肝細胞L-02 凋亡和凋亡蛋白的影響

與空白組比較，H2O2誘導的人肝細胞L-02凋亡率、Bax、Cleaved caspase-3 蛋白表達量明顯升高，Bcl-2 蛋白水平顯著降低，Bax/Bcl-2 比率顯著升高（P＜0.05，見表2和圖2）。與H2O2組比較，100、200、400 μmol·L－1槲皮苷明顯減少H2O2誘導的人肝細胞L-02 凋亡率、Bax、Cleaved caspase-3 蛋白表達量，顯著提高Bcl-2 蛋白水平，降低Bax/Bcl-2 比率，并呈濃度依賴性（P＜0.05，見表2和圖2）。

3.4 槲皮苷對H2O2 處理人肝細胞L-02 氧化應激的影響

與空白組比較，H2O2處理后人肝細胞L-02 中ROS 含量和MDA 水平顯著升高，SOD 活性明顯降低（P＜0.05，見表3）。與H2O2組比較，100、200、400 μmol·L－1槲皮苷明顯降低H2O2損傷的L-02 細胞的ROS 和MDA 水平，顯著提高SOD 活性，并呈濃度依賴性（P＜0.05，見圖3和表3）。

3.5 槲皮苷對H2O2 處理人肝細胞L-02 炎癥因子分泌的影響

與空白組比較，H2O2組人肝細胞L-02 中TNF-α和IL-6 水平顯著升高（P＜0.05）。與H2O2組比較，100、200、400 μmol·L－1槲皮苷明顯降低H2O2處理的人肝 細 胞L-02 的TNF-α和IL-6 水平，并呈濃度依賴性（P＜0.05，見表4）。

3.6 槲皮苷對H2O2 處理人肝細胞L-02 Nrf2/HO-1 通路的影響

圖1 槲皮苷對H2O2 處理人肝細胞L-02 凋亡的影響（DAPI，×200）Fig 1 Effect of quercetin on the apoptosis of human hepatocytes L-02 treated with H2O2 （DAPI，×200）

圖2 槲皮苷對人肝細胞L-02 凋亡（A）和凋亡相關蛋白表達（B）的影響Fig 2 Effect of quercetin on the apoptosis of human hepatocytes L-02 （A）and expression of apoptosis-related proteins（B）

圖3 探針法檢測人肝細胞L-02 中ROS 熒光強度（×100）Fig 3 Fluorescence intensity of human hepatocyte L-02 ROS detected by probe method（×100）

與空白組比較，H2O2處理人肝細胞L-02 中Nrf2 和HO-1 蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與H2O2組比較，槲皮苷100、200、400 μmol·L－1濃度組Nrf2 和HO-1 蛋白水平顯著升高，并呈濃度依賴性（P＜0.05，見圖4及表5）。

4 討論

表2 槲皮苷對H2O2 處理肝細胞L-02 凋亡和凋亡相關蛋白表達的影響(x±s，n ＝9)Tab 2 Effect of quercetin on H2O2-treated hepatocyte L-02 apoptosis and apoptosis-related protein expression (x±s，n ＝9)

表3 槲皮苷對H2O2 處理人肝細胞L-02 中ROS 熒光強度、SOD 和MDA 水平的影響(± s，n ＝9)Tab 3 Effect of quercetin on ROS fluorescence intensity，SOD and MDA levels in human hepatocytes L-02 treated with H2O2 (± s，n ＝9)

表3 槲皮苷對H2O2 處理人肝細胞L-02 中ROS 熒光強度、SOD 和MDA 水平的影響(± s，n ＝9)Tab 3 Effect of quercetin on ROS fluorescence intensity，SOD and MDA levels in human hepatocytes L-02 treated with H2O2 (± s，n ＝9)

注：與空白組比較，*P ＜0.05；與H2O2 組比較，#P ＜0.05。Note：Compared with the blank group，*P ＜0.05；compared with the H2O2 group，#P ＜0.05.

組別 ROS 熒光強度（UFI） SOD 活性/（U·mL－1） MDA 含量/（μmol·L－1）空白組 493.38±78.83 32.40±1.26 2.34±0.67 H2O2 組 1305.59±102.80* 11.31±1.77* 9.57±0.85*H2O2 ＋槲皮苷100 μmol·L－1 組 1155.47±92.73# 16.98±1.35# 6.23±0.63#H2O2 ＋槲皮苷200 μmol·L－1 組 989.52±82.12# 21.34±1.49# 5.36±0.47#H2O2 ＋槲皮苷400 μmol·L－1 組 795.65±73.40# 24.55±1.18# 4.62±0.59#

表4 槲皮苷對H2O2 誘導的人肝細胞L-02 中TNF-α 和IL-6 分泌的影響(± s，n ＝9)Tab 4 Effect of quercetin on the secretion of TNF-α and IL-6 in human hepatocytes L-02 induced by H2O2 (± s，n ＝9)

表4 槲皮苷對H2O2 誘導的人肝細胞L-02 中TNF-α 和IL-6 分泌的影響(± s，n ＝9)Tab 4 Effect of quercetin on the secretion of TNF-α and IL-6 in human hepatocytes L-02 induced by H2O2 (± s，n ＝9)

注：與空白組比較，*P ＜0.05；與H2O2 組比較，#P ＜0.05。Note：Compared with the blank group，*P ＜0.05；compared with the H2O2 group，#P ＜0.05.

組別 TNF-α 含量/（ng·L－1）IL-6 含量/（ng·L－1）空白組 16.54±2.92 10.26±1.05 H2O2 組 52.33±5.45* 26.64±3.08*H2O2 ＋槲皮苷100 μmol·L－1 組 44.65±4.03# 22.15±2.60#H2O2 ＋槲皮苷200 μmol·L－1 組 37.25±4.68# 20.56±2.23*H2O2 ＋槲皮苷400 μmol·L－1 組 31.06±3.97# 15.22±2.18#

圖4 槲皮苷對人肝細胞L-02 Nrf2/HO-1 蛋白表達的影響Fig 4 Effect of quercetin on the expression of L-02 Nrf2/HO-1 proteins in human hepatocytes

在肝細胞損傷過程中，ROS 與細胞內(nèi)大分子（蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等）以及細胞膜、細胞器結(jié)合破壞其生物活性，誘發(fā)肝細胞凋亡，在多種肝臟疾病發(fā)生起重要作用[11]。目前關于肝細胞氧化應激損傷的病理機制尚未完全闡明，既往研究顯示抑制肝細胞氧化應激損傷及肝細胞凋亡可有效保護肝細胞免受氧自由基損傷[12-13]，本研究主要探討槲皮苷對肝細胞H2O2損傷的作用機制，為研發(fā)抗H2O2損傷的新型藥物提供新方向。

表5 槲皮苷對H2O2 處理肝細胞L-02 中Nrf2 和HO-1 蛋白表達的影響(± s，n ＝9)Tab 5 Effect of quercetin on H2O2-treated hepatocyte L-02 Nrf2 and HO-1 protein expression (± s，n ＝9)

表5 槲皮苷對H2O2 處理肝細胞L-02 中Nrf2 和HO-1 蛋白表達的影響(± s，n ＝9)Tab 5 Effect of quercetin on H2O2-treated hepatocyte L-02 Nrf2 and HO-1 protein expression (± s，n ＝9)

注：與空白組比較，*P ＜0.05；與H2O2 組比較，#P ＜0.05。Note：Compared with the blank group，*P ＜0.05；compared with the H2O2 group，#P ＜0.05.

組別 Nrf2 蛋白 HO-1 蛋白空白組 0.21±0.02 0.14±0.02 H2O2 組 0.33±0.04* 0.24±0.03*H2O2 ＋槲皮苷100 μmol·L－1 組 0.45±0.03# 0.41±0.05#H2O2 ＋槲皮苷200 μmol·L－1 組 0.49±0.06# 0.46±0.05#H2O2 ＋槲皮苷400 μmol·L－1 組 0.66±0.07# 0.71±0.07#

槲皮苷具有抗氧化、抗炎和改善藥物代謝等作用，國內(nèi)外研究顯示槲皮苷通過降低ROS 含量和細胞毒性發(fā)揮細胞保護作用[14]。細胞凋亡過程受到多種基因調(diào)控，研究表明caspase-3 可參與肝細胞凋亡過程，活化成Cleaved caspase-3 時可發(fā)揮促進細胞凋亡的作用[15-16]。本研究通過使用H2O2處理L-02 細胞模擬其在體內(nèi)環(huán)境，細胞增殖率降低，Cleaved caspase-3、Bax 的蛋白水平升高，Bcl-2 的蛋白水平降低，細胞凋亡率升高；槲皮苷可促進細胞存活，抑制H2O2誘導L-02 細胞凋亡，降低Bax、Cleaved caspase-3 蛋白表達量，升高Bcl-2 蛋白水平。

機體在應對氧自由基損害時，形成完善的氧化應激應答防御系統(tǒng)，該系統(tǒng)受抗氧化反應元件（antioxidant responsive element，ARE）位于抗氧化保護基因的上游調(diào)控區(qū)域調(diào)控[17]。氧化應激是肝細胞損傷的重要原因之一，細胞發(fā)生氧化應激時ROS 水平升高，可加重肝細胞凋亡，MDA是一種脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，細胞發(fā)生氧化應激時促使MDA 水平升高從而進一步加重氧化應激損傷，SOD 屬于抗氧化酶類且具有清除氧自由基能力[18-20]。研究表明，IL-6、TNF-α水平降低可減輕體內(nèi)炎癥反應從而減弱細胞損傷程度[21]。本研究發(fā)現(xiàn)槲皮苷可顯著升高SOD 活性，降低ROS、MDA、TNF-α、IL-6 水平。

Nrf2/HO-1 途徑是參與機體氧化應激調(diào)控的重要信號通路，ROS 的大量產(chǎn)生可刺激Nrf2 表達，促進下游HO-1 等抗氧化基因表達進而增強細胞抗氧化應激能力[22-23]。Nrf2/HO-1 途徑已被證實在H2O2誘導的肝細胞中激活，其激活是啟動細胞內(nèi)源性抗氧化途徑之一[24]。本研究發(fā)現(xiàn)槲皮苷處理組Nrf2 和HO-1 表達水平顯著高于H2O2，提示槲皮苷可能通過激活Nrf2/HO-1 途徑進而對H2O2誘導L-02 細胞損傷發(fā)揮保護作用。

綜上所述，研究表明槲皮苷對H2O2損傷的肝細胞具有保護作用，抑制肝細胞凋亡，其機制可能為槲皮苷通過抑制H2O2引起的氧化應激和炎癥因子分泌，與Nrf2/HO-1 通路激活密切相關。