林艷霞，張勝杰，耿海局，王權(quán)，馬仁強(qiáng)，陳健文*（.深圳市健元醫(yī)藥科技有限公司，廣東 深圳5888；.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣州 50006）

腦卒中俗稱(chēng)中風(fēng)，是一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命健康的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，具有高發(fā)病率、高致死率和高致殘率的特點(diǎn)。腦卒中死亡率已超過(guò)缺血性心臟病、肺癌、慢性阻塞性肺疾病和肝癌，僅次于惡性腫瘤，每年大約有2200 萬(wàn)人發(fā)病[1]。腦卒中主要包括缺血性腦卒中、出血性腦卒中和蛛網(wǎng)膜下腔出血，以缺血性腦卒中最為常見(jiàn)（占87%[2]），其中患者病后殘疾率高達(dá)25%[3]。目前，關(guān)于缺血性腦卒中的治療指南推薦的方法包括溶栓、腦神經(jīng)元保護(hù)、降低顱內(nèi)壓、抗凝、抗血小板聚集、降纖、腦血管支架植入、康復(fù)及心理治療、改善腦循環(huán)等，后續(xù)治療藥物卻相對(duì)有限。因此，研發(fā)療效確切的新藥十分必要。

我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)藥源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，具有本身獨(dú)特的理論體系和療效優(yōu)勢(shì)?；罱j(luò)通腦片是一種依據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論組方，利用現(xiàn)代化技術(shù)手段制成的中成藥片劑。本研究擬利用大鼠腦缺血再灌注模型來(lái)考察活絡(luò)通腦片的藥理作用，探究其對(duì)大鼠腦缺血的治療作用，為后期開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性Wistar 大鼠[南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（粵）2016-0041，200 ～240 g]，飼養(yǎng)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（粵）2016-0112。

1.2 儀器

電熱恒溫干燥箱（長(zhǎng)沙醫(yī)療器械廠，101-4A）；AB104S 電子天平、SB32000電子天平（METTLER TOLEDO）；脫水機(jī)（TP1020）、石蠟包埋機(jī)（EG1160）、切片機(jī)（RM2155）、生物熒光顯微鏡（DM5000B）（Leica）；血小板聚集儀（上海醫(yī)大儀器廠，QX-200）；大鼠MCAO 專(zhuān)用栓線（北京沙東生物技術(shù)公司，2432-AAA）等。

1.3 試藥

活絡(luò)通腦片提取物干粉（未醇沉工藝樣品，HRT，批號(hào)：16070601，中山大學(xué)藥學(xué)院）；銀杏葉片（深圳海王藥業(yè)，批號(hào)：20160102）。BSA（Sigma公 司），羊 抗 兔-IgG（Abcam，ab97049），SABC（博士德公司），DAB 顯色試劑盒（Roche），血小板活化因子（PAF，SIGMA），bFGF 抗體（Abcam，ab108319），BDNF 抗體（Abcam，ab106245）等。

2 方法

2.1 造模及神經(jīng)學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

參考文獻(xiàn)[4]制備大鼠缺血再灌注模型，同法制備假手術(shù)組。完成后，按照Z(yǔ)ea Longa 的5 分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)病學(xué)評(píng)分，0 分：無(wú)明顯神經(jīng)缺損癥狀；1 分：不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2 分：向外側(cè)轉(zhuǎn)圈；3 分：向?qū)?cè)傾倒；4 分：不能自行行走。

2.2 分組及給藥

將神經(jīng)評(píng)分1 ～3 分的大鼠隨機(jī)分為5 組，分別為模型對(duì)照組，HRT 低、中、高劑量組（85、170、340 mg·kg－1）和陽(yáng)性對(duì)照組（銀杏葉片26 mg·kg－1），每組15 只。另設(shè)假手術(shù)組大鼠10 只。造模24 h 后開(kāi)始灌胃給藥；每日給藥1 次，連續(xù)給藥14 d。藥物用蒸餾水配制成相應(yīng)的濃度，使給藥體積均為10 mL·kg－1。模型對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠同法給予藥物溶劑蒸餾水。

2.3 神經(jīng)學(xué)評(píng)分

觀察大鼠行為學(xué)變化，參考Zea Longa 的5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)病學(xué)評(píng)分。于給藥前（造模24 h）及給藥后3、7、10、14 d 為觀察時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。

2.4 行為學(xué)觀察

2.4.1 橫木行走實(shí)驗(yàn) 橫木行走實(shí)驗(yàn)用于評(píng)價(jià)腦缺血再灌注損傷后動(dòng)物運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力和整合缺損。根據(jù)文獻(xiàn)[5]報(bào)道方法于給藥前（造模24 h 后）以及給藥后3、7、10、14 d 對(duì)大鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)。

2.4.2 前肢抓握力量測(cè)試 前肢抓握力量測(cè)試評(píng)價(jià)動(dòng)物腦缺血再灌注損傷后前肢抓握力量的大小。參考文獻(xiàn)[6]方法分別于給藥前（造模24 h 后）及給藥后3、7、10、14 d 測(cè)試大鼠的前肢抓握力量。

2.5 血小板聚集實(shí)驗(yàn)

末次給藥后120 min 從腹腔靜脈抽血，以檸檬酸鈉抗凝，每管0.5 mL，用PAF（終濃度為1 nmol·L－1）誘導(dǎo)全血血小板聚集，以QX-200 全血血小板聚集儀測(cè)定聚集度（Ω），并計(jì)算血小板聚集抑制率。

2.6 免疫組化實(shí)驗(yàn)

于給藥14 d 后，麻醉大鼠，4%的多聚甲醛液灌注固定后斷頭取腦，除去小腦和腦干后分成三等份，取中間部分固定2 d，常規(guī)脫水、石蠟包埋，切片，厚5 μm。分別進(jìn)行BDNF 和bFGF 免疫組化實(shí)驗(yàn)。具體方法如下：常規(guī)脫水、抗原修復(fù)后，PBS 洗滌3 次，室溫封閉30 min 后分別滴加適量的含抗體BDNF（1∶100）和bFGF（1∶100）的一抗稀釋液，4℃過(guò)夜，PBS 洗滌3 次，同法滴加適量含二抗（羊抗兔1∶2000）的二抗稀釋液，37℃孵育30 min，PBS 洗滌3 次×5 min 后，常規(guī)DAB 顯色后用中性樹(shù)膠封片。根據(jù)大鼠腦缺血半暗帶的定位方法，取半暗帶和海馬相近部位同倍（400×）的6 個(gè)不同視野，用圖像分析系統(tǒng)對(duì)BDNF 和bFGF 免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性細(xì)胞平均吸收光密度（OD值）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，取平均值。

2.7 腦部病理檢查

常規(guī)HE 染色，光鏡下觀察大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)和海馬區(qū)病理學(xué)變化，并參考文獻(xiàn)[7]方法進(jìn)行評(píng)分：未觀察到組織學(xué)改變，0 分；組織學(xué)改變比例10%～20%，1 分；組織學(xué)改變比例21%～40%，2 分；組織學(xué)改變比例41%～100%，3 分。

2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組樣本采用One-Way ANOVA 分析，兩組樣本采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 HRT 對(duì)模型大鼠神經(jīng)學(xué)評(píng)分的影響

與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組大鼠給藥前及給藥3、7、10 和14 d 神經(jīng)功能缺損評(píng)分均有所升高（P＜0.05）。與模型對(duì)照組相比，給藥10 d和14 d，HRT 中、高劑量組以及陽(yáng)性對(duì)照組均可改善神經(jīng)功能缺損評(píng)分（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 HRT 對(duì)模型大鼠神經(jīng)學(xué)評(píng)分的影響(分，± s)Tab 1 Effect of HRT on the neurological score in rats (score，± s)

表1 HRT 對(duì)模型大鼠神經(jīng)學(xué)評(píng)分的影響(分，± s)Tab 1 Effect of HRT on the neurological score in rats (score，± s)

注：與假手術(shù)組比較，aP ＜0.05；與模型對(duì)照組比較，bP ＜0.05。Note：Compared with the sham group，aP ＜0.05；compared with the model group，bP ＜0.05.

組別 給藥前 給藥3 d 給藥7 d 給藥10 d 給藥14 d 存活率/n（%）假手術(shù)組 0.05±0.11 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 10（100）模型對(duì)照組 1.62±0.48a 1.58±0.70a 1.38±0.62a 1.23±0.52a 1.18±0.46a 11（73）HRT 低劑量組 1.64±0.53 1.33±0.49 0.14±0.50 1.05±0.50 1.02±0.50 11（73）HRT 中劑量組 1.62±0.52 1.35±0.47 1.17±0.33 0.83±0.25b 0.79±0.26b 11（73）HRT 高劑量組 1.59±0.51 1.27±0.47 0.98±0.39 0.81±0.25b 0.77±0.26b 13（87）陽(yáng)性對(duì)照組 1.62±0.47 1.35±0.43 1.24±0.40 0.83±0.33b 0.79±0.33b 12（80）

3.2 HRT 對(duì)模型大鼠橫木行走能力的影響

與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組大鼠給藥前以及給藥3、7、10 和14 d 平衡木行走評(píng)分均有下降（P＜0.05）。與模型對(duì)照組比較，HRT 中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠給藥后7、10 和14 d 橫木行走能力均有所改善（P＜0.05），見(jiàn)表2。

3.3 HRT 對(duì)模型大鼠前肢抓握力的影響

與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組大鼠給藥前以及給藥3、7、10 和14 d 前肢抓握力均明顯降低（P＜0.05）。與模型對(duì)照組比較，HRT 高劑量組大鼠給藥后7 ～14 d 前肢抓握力有顯著改善（P＜0.05），見(jiàn)表3。

3.4 HRT 對(duì)模型大鼠血小板聚集的影響

與模型對(duì)照組比較，HRT 各劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組均能明顯抑制PAF 誘導(dǎo)的體外血小板聚集（P＜0.05），見(jiàn)表4。

3.5 HRT 對(duì)模型大鼠海馬及半暗帶BDNF 和bFGF 表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組海馬及半暗帶中bFGF 和BDNF 的表達(dá)改變不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型對(duì)照組相比，HRT高劑量組海馬bFGF 表達(dá)量增加（P＜0.05），HRT中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組海馬BDNF 表達(dá)量增加（P＜0.05）；HRT 中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組半暗帶bFGF 表達(dá)量增加（P＜0.05），HRT 中、高劑量組半暗帶BDNF 表達(dá)增加（P＜0.05），見(jiàn)表5。

表2 HRT 對(duì)模型大鼠橫木行走能力的影響(分，± s)Tab 2 Effect of HRT on the beam-walking performance in rats (score，± s)

表2 HRT 對(duì)模型大鼠橫木行走能力的影響(分，± s)Tab 2 Effect of HRT on the beam-walking performance in rats (score，± s)

注：與假手術(shù)組比較，aP ＜0.05；與模型對(duì)照組比較，bP ＜0.05。Note：Compared with the sham group，aP ＜0.05；compared with the model group，bP ＜0.05.

組別 給藥前 給藥3 d 給藥7 d 給藥10 d 給藥14 d假手術(shù)組 6.0±0.0 6.0±0.0 6.0±0.0 6.0±0.0 6.0±0.0模型對(duì)照組 1.3±0.5 1.5±0.7a 1.9±0.6a 2.5±0.8a 2.8±0.6a HRT 低劑量組 1.4±0.5 1.8±0.4 2.6±0.7 3.3±0.6 4.2±0.8 HRT 中劑量組 1.3±0.4 1.9±0.8 2.8±0.9b 3.6±1.2b 4.6±1.2b HRT 高劑量組 1.3±0.7 1.9±0.8 2.9±0.8b 3.9±0.8b 5.1±1.0b陽(yáng)性對(duì)照組 1.4±0.5 1.9±0.7 3.1±0.7b 3.8±1.0b 5.1±1.3b

表3 HRT 對(duì)模型大鼠前肢抓握力的影響(g，± s)Tab 3 Effect of HRT on the bar-grasping performance in rats (± s)

表3 HRT 對(duì)模型大鼠前肢抓握力的影響(g，± s)Tab 3 Effect of HRT on the bar-grasping performance in rats (± s)

注：與假手術(shù)組比較，aP ＜0.05；與模型對(duì)照組比較，bP ＜0.05。Note：Compared with the sham group，aP ＜0.05；compared with the model group，bP ＜0.05.

組別 給藥1 d 給藥3 d 給藥7 d 給藥10 d 給藥14 d假手術(shù)組 764±100 873±98 969±94 1049±100 1086±97模型對(duì)照組 592±79a 634±99a 672±101a 679±125a 695±118a HRT 低劑量組 592±95 606±95 656±95 707±110 726±108 HRT 中劑量組 592±97 606±101 737±108 758±102 778±111 HRT 高劑量組 597±101 623±114 765±124b 790±114b 861±143b陽(yáng)性對(duì)照組 595±87 610±101 722±107 785±118 850±145b

表4 HRT 對(duì)模型大鼠血小板聚集的影響(± s)Tab 4 Effect of HRT on the platelet aggregation in rats (± s)

表4 HRT 對(duì)模型大鼠血小板聚集的影響(± s)Tab 4 Effect of HRT on the platelet aggregation in rats (± s)

注：與模型對(duì)照組比較，bP ＜0.05。Note：Compared with the model group，bP ＜0.05.

組別 血小板聚集率/Ω 聚集抑制率/%假手術(shù)組 10.33±1.42 11.55模型對(duì)照組 11.68±1.42 0.00 HRT 低劑量組 9.23±1.79b 20.99 HRT 中劑量組 9.08±0.93b 22.19 HRT 高劑量組 9.36±1.26b 19.87陽(yáng)性對(duì)照組 9.29±1.61b 20.47

3.6 HRT 對(duì)模型大鼠腦組織病理學(xué)改變的影響

與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組大鼠腦皮質(zhì)和海馬均明顯損傷，表現(xiàn)為腦皮質(zhì)體細(xì)胞大面積變性壞死，出現(xiàn)明顯梗死灶，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯等現(xiàn)象。與模型對(duì)照組比較，各給藥組均有一定的改善作用，表現(xiàn)為腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞變性壞死減輕，梗死灶相對(duì)較小，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，其中HRT 中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大腦皮質(zhì)損傷評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），HRT 高劑量組海馬損傷評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表6及圖1。

表5 HRT 對(duì)模型大鼠海馬及半暗帶BDNF 和bFGF 表達(dá)的影響(± s)Tab 5 Effect of HRT on the BDNF and the bFGF expression at hippocampus and penumbra areas in rats (± s)

表5 HRT 對(duì)模型大鼠海馬及半暗帶BDNF 和bFGF 表達(dá)的影響(± s)Tab 5 Effect of HRT on the BDNF and the bFGF expression at hippocampus and penumbra areas in rats (± s)

注：與模型對(duì)照組比較，bP ＜0.05。Note：Compared with the model group，bP ＜0.05.

組別 海馬bFGF 海馬BDNF 半暗帶bFGF 半暗帶BDNF假手術(shù)組 0.38±0.02 0.31±0.06 0.36±0.03 0.32±0.02模型對(duì)照組 0.37±0.04 0.33±0.03 0.35±0.03 0.32±0.05 HRT 低劑量組 0.39±0.06 0.35±0.06 0.38±0.05 0.34±0.03 HRT 中劑量組 0.42±0.08 0.36±0.04b 0.40±0.03b 0.36±0.03b HRT 高劑量組 0.43±0.08b 0.40±0.05b 0.44±0.04b 0.39±0.05b陽(yáng)性對(duì)照組 0.42±0.07 0.37±0.05b 0.41±0.05b 0.36±0.05

4 討論

近年來(lái)，腦血管病逐年上升，已經(jīng)給人類(lèi)的健康帶來(lái)嚴(yán)重的威脅，成為僅次于心肌梗死的第二大致死性疾病[8]。腦卒中是一種發(fā)病率很高的腦血管疾病，已經(jīng)成為影響傷殘調(diào)整壽命年第三大因素[9]。在國(guó)內(nèi)，腦卒中每年新增病例超過(guò)200 萬(wàn)[10-11]。研究顯示，缺血性腦卒中整個(gè)發(fā)病過(guò)程中，除了缺血對(duì)腦組織造成損傷外，缺血區(qū)組織恢復(fù)血流灌注后會(huì)加重?fù)p傷，出現(xiàn)“二次”損傷，即腦缺血再灌注損傷[12]。腦缺血再灌注損傷的病理機(jī)制較為復(fù)雜，影響因素也比較多，不同疾病階段的因素也有所不同。因此，研發(fā)治療缺血性腦卒中的藥物也需考慮到多方面的因素，尋找相應(yīng)的策略和作用靶點(diǎn)。

表6 HRT 對(duì)模型大鼠腦組織病理改變的影響(分，± s)Tab 6 Effect of HRT on the cerebral pathological changes in rats(score，± s)

表6 HRT 對(duì)模型大鼠腦組織病理改變的影響(分，± s)Tab 6 Effect of HRT on the cerebral pathological changes in rats(score，± s)

注：與假手術(shù)組比較，aP ＜0.05；與模型對(duì)照組比較，bP ＜0.05。Note：Compared with the sham group，aP ＜0.05；compared with the model group，bP ＜0.05.

組別 大腦皮質(zhì)損傷評(píng)分 海馬損傷評(píng)分假手術(shù)組 1.20±0.42 1.10±0.57模型對(duì)照組 7.45±2.07a 3.00±1.26a HRT 低劑量組 6.73±3.26 2.18±0.75 HRT 中劑量組 5.18±2.79b 2.09±0.70 HRT 高劑量組 5.46±2.47b 1.69±1.10b陽(yáng)性對(duì)照組 5.25±2.67b 2.08±1.68

腦缺血最主要的后遺癥就是神經(jīng)功能障礙和運(yùn)動(dòng)功能障礙[13]，本研究重點(diǎn)評(píng)價(jià)了模型動(dòng)物的神經(jīng)功能和運(yùn)動(dòng)功能，結(jié)果顯示，HRT 能夠顯著改善動(dòng)物的神經(jīng)學(xué)評(píng)分和運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分，提高模型動(dòng)物的橫木行走能力及前肢抓握力，表明HRT可以改善腦缺血?jiǎng)游锏纳窠?jīng)功能和運(yùn)動(dòng)功能。

圖1 大鼠大腦皮質(zhì)（上）及海馬CA3 區(qū)（下）HE 染色（100×）Fig 1 Hematoxylin eosin staining of the cerebral cortex area（up）and the hippocampal CA3 area（down）in rats（100×）

腦血管血液循環(huán)正常離不開(kāi)血液因素和血管因素，當(dāng)血液循環(huán)發(fā)生障礙時(shí)，腦組織供氧供血量不足，繼而發(fā)生缺血性腦卒中[14]，改善血管血液功能、恢復(fù)大腦血液供應(yīng)是治療缺血性腦卒中的重要手段[15]，治療藥物包括靜脈溶栓藥、抑制血小板藥物和中藥復(fù)方等[16]。本研究中，HRT能夠明顯抑制PAF 誘導(dǎo)的體外血小板聚集，提示HRT 具有抑制血小板聚集，減少血栓形成，進(jìn)而改善血液循環(huán)的作用。

BDNF 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布廣泛，在神經(jīng)元的生長(zhǎng)分化過(guò)程中作用至關(guān)重要，是維持神經(jīng)元正常生理功能必不可少的內(nèi)源性物質(zhì)之一[17]。bFGF 具有多種生物學(xué)活性，含有154 個(gè)氨基酸。正常生理狀態(tài)下，腦內(nèi)bFGF 表達(dá)量較少；在缺血性腦卒中發(fā)生后，bFGF 表達(dá)量增加，其受體表達(dá)隨之上調(diào)，bFGF 能減少缺血腦組織神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)，對(duì)受損神經(jīng)細(xì)胞有重要的保護(hù)作用[18]。本研究中，HRT 能夠顯著提高模型大鼠腦組織bFGF 和BDNF 的含量，提示HRT 具有提高bFGF 和BDNF 表達(dá)的作用，這一作用可能與其改善大鼠腦缺血再灌注有關(guān)。

腦組織結(jié)構(gòu)的完整性是正常生理功能的前提條件，海馬和皮質(zhì)結(jié)構(gòu)在腦組織的作用至關(guān)重要，一旦腦缺血發(fā)生，就會(huì)直接導(dǎo)致大腦結(jié)構(gòu)的損傷。本研究中，HE 染色的結(jié)果也證明了這一點(diǎn)，還顯示HRT 能夠顯著改善模型大鼠缺血再灌注造成的腦組織損傷。

綜上，HRT 具有較好地治療大鼠腦缺血再灌注損傷的作用，本研究可為HRT 后期開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供藥理學(xué)依據(jù)。