魯 杰，謝 丹，阮婧華，范東生，查 鑫，辛加敏

(1貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550002；2貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550001)

胃癌是一種死亡率極高的疾病，長(zhǎng)期威脅人類的健康[1]，作為一種早期癥狀不明確的惡性腫瘤，通常采用化學(xué)療法、放射療法、生物學(xué)療法等綜合療法來(lái)輔助，但這些方法對(duì)人體傷害均較大[2]，治療后產(chǎn)生的副作用給患者的生活也帶來(lái)極大的負(fù)面影響。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)天然活性物質(zhì)在抗腫瘤方面具有高效、低毒、高選擇性、使用范圍廣的優(yōu)點(diǎn)[3]，因此找出并利用抗胃癌活性且低毒副作用的天然活性物質(zhì)成為現(xiàn)代研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

目前中藥活性成分已被廣泛應(yīng)用于抗胃癌的研究中，中藥揮發(fā)油作為中藥活性成分中的一部分，有許多研究[4-8]表明，揮發(fā)油具有良好的抗腫瘤活性?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，苗藥鐵筷子富含揮發(fā)油，具有抗炎、鎮(zhèn)痛的藥理作用[9-10]。苗藥鐵筷子為臘梅科蠟梅屬植物臘梅Chimonanthuspraecox(L.)link.及山臘梅C.nitensoliv的干燥細(xì)根，收載于《中華本草·苗藥卷》及2003版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中。作為貴州苗族的常用藥[9]，苗藥鐵筷子具有祛風(fēng)止痛、理氣解毒的功效[11]，常用于風(fēng)濕痹痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療。

本次試驗(yàn)對(duì)鐵筷子揮發(fā)油抗腫瘤活性進(jìn)行初步研究。本研究采用水蒸氣蒸餾法提取鐵筷子揮發(fā)油，并利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)對(duì)鐵筷子揮發(fā)油的化學(xué)成分進(jìn)行檢測(cè)，以及采用CCK8法對(duì)揮發(fā)油抗腫瘤活性的初步研究。本次研究以期為苗族特色藥鐵筷子抗胃癌提供思考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HP6890/5975C氣相色譜質(zhì)譜分析聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；全波段酶標(biāo)儀。

1.2 試劑

正己烷(分析純)；實(shí)驗(yàn)用水為哇哈哈純凈水；無(wú)水硫酸鈉(分析純)；鐵筷子為貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供，由中藥房陳秀敏主任藥師鑒定，鑒定結(jié)果為臘梅科蠟梅屬植物臘梅Chimonanthuspraecox(L.)link.及山臘梅C.nitensoliv的干燥細(xì)根。BGC-823 細(xì)胞購(gòu)買于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所；DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司，批號(hào)8119414)；新生牛血清(美國(guó)Gibco公司，批號(hào)SH40003.01)；青鏈霉素混合液(北京索萊寶有限公司，批號(hào)No.20171113)；CCK8試劑盒(北京索萊寶有限公司，批號(hào)CA1210)。

2 方法

2.1 鐵筷子揮發(fā)油的制備[12-15]

取鐵筷子藥材100 g，加入5倍量的蒸餾水浸泡過(guò)夜，加入2 mL正己烷，按照水蒸氣蒸餾法提取6 h，得具有特殊氣味淡黃色油狀物1 mL，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥即得鐵筷子揮發(fā)油。

2.2 氣相色譜條件

色譜柱為HP-5MS(60 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細(xì)管柱，初始溫度70 ℃(保留2min)，以4 ℃·min-1升溫至270 ℃，再以8 ℃·min-1升溫至310 ℃(保留3 min)，汽化室溫度250 ℃；載氣為高純He(99.999%)；柱前壓18.47psi，載氣流量1.0 mL·min-1，分流比10∶1，溶劑延遲時(shí)間：6 min。

2.3 質(zhì)譜條件

離子源為EI源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6 μA；倍增器電壓2271 V；接口溫度280 ℃；質(zhì)量范圍29～450 amu。

2.4 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖作用

收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的BGC-823細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1.0×104～1.5×104接種于96孔板，每個(gè)孔加入100 μL的細(xì)胞，邊緣孔用無(wú)菌PBS填充，將96孔板放37 ℃含5% CO2的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h貼壁后，分成空白組、溶劑對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性藥物組?？瞻捉M只加DMEM培養(yǎng)液，溶劑對(duì)照組加入含有DMSO的DMEM培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組為苗藥鐵筷子揮發(fā)油先用DMSO溶解，后用DMEM稀釋成濃度為300 μL/mL、150 μL/mL、75 μL/mL、35 μL/mL、15 μL/mL。陽(yáng)性藥物卡培他濱用DMEM配制濃度為0 μL/mL、0.25 μL/mL、0.5 μL/mL、1.0 μL/mL、2.0 μL/mL、4.0 μL/mL。每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，每孔加100 μL。放培養(yǎng)箱37 ℃含5% CO224 h后，每孔加入10 μL的CCK8試劑，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定光密度OD值。空白調(diào)零孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，按下列公式計(jì)算細(xì)胞的增殖抑制率。

細(xì)胞增殖抑制率=(OD對(duì)照組-OD實(shí)驗(yàn)組)/OD對(duì)照組×100%

2.5 統(tǒng)計(jì)方法

3 結(jié)果與分析

3.1 鐵筷子揮發(fā)油的化學(xué)成分氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析結(jié)果

鐵筷子揮發(fā)油的化學(xué)成分氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析，化學(xué)成分總離子流程圖見圖1，鐵筷子揮發(fā)油的化學(xué)成分及相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)見表1。

圖1 鐵筷子揮發(fā)油成分的總離子流程圖

表1 鐵筷子揮發(fā)油成分及其相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)

在苗藥鐵筷子揮發(fā)油提取過(guò)程中加入正己烷得油量最高，提取條件穩(wěn)定，對(duì)總離提取率較高[16]。圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)檢索及核對(duì)Nist14和Wiley275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，確定了33種化合物，用峰面積歸一化法測(cè)定了各化學(xué)成分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)見表1。

3.2 CCK8檢測(cè)苗藥鐵筷子揮發(fā)油對(duì)BGC-823細(xì)胞增殖抑制作用

苗藥鐵筷子揮發(fā)油對(duì)BGC-823細(xì)胞干預(yù)24 h，半抑制濃度IC50值為11.793 μg/mL；陽(yáng)性藥物卡培他濱對(duì)BGC-823細(xì)胞干預(yù)24 h，IC50值為1.098 μg/mL，陽(yáng)性藥物組與苗藥鐵筷子揮發(fā)油組對(duì)BGC-823細(xì)胞的增殖均有抑制作用，細(xì)胞的增殖抑制率與濃度呈相關(guān)性，與空白對(duì)照組比較，不同濃度的鐵筷子揮發(fā)油對(duì)BGC-823細(xì)胞的增殖抑制率均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2、表3。

表2 不同濃度鐵筷子揮發(fā)油對(duì)BGC-823細(xì)胞的增殖抑制作用

表3 不同濃度陽(yáng)性藥物卡培他濱對(duì)BGC-823細(xì)胞的增殖抑制作用

4 討論

從GC-MS分析結(jié)果可以看出，苗藥鐵筷子揮發(fā)油中主要含有棕櫚酸、亞油酸、油酸、α-杜松醇等化合物。與已報(bào)道文獻(xiàn)[17]相比，主要化合物成分相同，都檢測(cè)出了棕櫚酸、亞油酸、油酸、α-杜松醇。與文獻(xiàn)[17]中苗藥鐵筷子揮發(fā)油的GC-MS檢測(cè)結(jié)果比較，并沒(méi)有檢測(cè)出香橙烯、α-紫穗槐烯、吉瑪烯、α-衣蘭油烯、α-蓽加油萜、廣藿香醇、肉豆蔻酸、十五酸8個(gè)化合物，本次實(shí)驗(yàn)提取的揮發(fā)油檢測(cè)出含有正己醛、2-庚酮、正庚醛、樟腦萜、月桂烯、4-異丙基甲苯、雙戊烯、水楊酸甲酯、沒(méi)藥醇、桃金娘醇10個(gè)化合物。文獻(xiàn)[17]中從鐵筷子揮發(fā)油中共鑒定出了30種化合物結(jié)構(gòu)，占總揮發(fā)油總量的96.81%，而本次研究從鐵筷子揮發(fā)油中鑒定了33種化合物，共占揮發(fā)油的89.71%。檢測(cè)的結(jié)果不同可能是由于藥材產(chǎn)地、土壤條件、溫度濕度、光照條件等環(huán)境因素的差異所造成的。苗藥鐵筷子揮發(fā)油中包括烴類、不飽和脂肪酸類、萜類化合物等，不飽和脂肪酸在防治心血管疾病方面效果顯著[18]，萜類化合物在抗菌消炎鎮(zhèn)痛方面具有很好療效[19]。苗藥鐵筷子揮發(fā)油中含有烯烴類化合物，約占總體的7.36%，萜類化合物占總體的5.57%，有研究表明[20]，萜類化合物具有抗胃癌的活性的作用，但苗藥鐵筷子揮發(fā)油中具體是哪種化合物抑制BGC-823細(xì)胞的增殖以及抗腫瘤的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度的苗藥鐵筷子揮發(fā)油干預(yù)BGC-823細(xì)胞后呈現(xiàn)出增殖抑制作用(P<0.05)可能與苗藥鐵筷子揮發(fā)油對(duì)細(xì)胞的作用機(jī)制有關(guān)，并且這種作用對(duì)劑量具有明顯的依賴性，可能是作用靶點(diǎn)在某種程度上參與了細(xì)胞的增殖過(guò)程，還有待進(jìn)一步研究。本次研究并未對(duì)鐵筷子揮發(fā)油在動(dòng)物模型中作出闡述，今后需要進(jìn)一步探討。

綜上所述，本研究對(duì)苗藥鐵筷子揮發(fā)油進(jìn)行水蒸氣蒸餾法提取，采用GC-MS聯(lián)用對(duì)揮發(fā)油成分進(jìn)行表征，并采用CCK8法檢驗(yàn)了苗藥鐵筷子揮發(fā)油具有抗胃癌的活性，表明苗藥鐵筷子具有很大的藥用利用價(jià)值和開發(fā)空間，但是目前對(duì)于鐵筷子的研究較少，對(duì)鐵筷子揮發(fā)油抗腫瘤成分、作用機(jī)制和作用細(xì)胞靶點(diǎn)尚未明確，對(duì)鐵筷子揮發(fā)油的臨床研究也很少，該藥值得深入的研究與探討。本次研究為進(jìn)一步開展鐵筷子揮發(fā)油體內(nèi)抗胃癌作用和抗胃癌分子機(jī)制研究提供新思路，并為鐵筷子這一苗藥的合理開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)。