史大偉，邢軍，馬龍，李安，于紅，古麗加馬力·艾薩，張瑞

（1.新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院烏魯木齊830054；2.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院烏魯木齊830046）

0 引 言

開菲爾是一種傳統(tǒng)的發(fā)酵乳飲料，可緩解乳糖不耐受癥、胃腸道疾病和高血壓等[1-5]。富含的微生物能發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)酸、抗生素和多種香氣，其中細(xì)菌數(shù)量占比較大，起到較重要的作用，對開菲爾的發(fā)酵有較大影響[6-13]。

單分子實(shí)時測序技術(shù)（Single Mo lecu le R eal-Tim e sequencing，SMR T）是目前正在使用的新的測序技術(shù)之一，該新技術(shù)不僅能獲得更長、更準(zhǔn)確的DNA序列，而且與傳統(tǒng)的方法一樣可靠和準(zhǔn)確，能快速、準(zhǔn)確地在物種水平上識別微生物[14-15]。為了解開菲爾在發(fā)酵前后細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)和種群變化動態(tài)，本研究在0～96 h發(fā)酵時間段采集了15份牧民手工制作的發(fā)酵樣品中的細(xì)菌，為分離鑒定開菲爾功能細(xì)菌的研究奠定基礎(chǔ)，同時，為開菲爾發(fā)酵過程中細(xì)菌菌落的結(jié)構(gòu)和種群動態(tài)變化提供數(shù)據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料

樣品取自新疆喀什地區(qū)的牧民家中，置于冰盒冷藏待用。發(fā)酵牛乳烏魯木齊市超市購買。

1.2 方法

1.2.1 鮮乳殺菌處理

烏魯木齊市超市購買西域春牌牛奶作為開菲爾發(fā)酵基質(zhì)，采用85℃熱處理20 min，備用。

1.2.2 開菲爾粒制備與活化

本實(shí)驗(yàn)室于2018年制備獲得的開菲爾粒固態(tài)發(fā)酵劑（原料采自喀什山區(qū)牧民家庭制作奶疙瘩，后經(jīng)過冰盒冷凍保存至實(shí)驗(yàn)室）→粉碎→過40目篩→溫水30℃泡洗3次→按質(zhì)量比1∶5加入30℃水打漿→均質(zhì)→按1∶10比例接種在25℃已消毒牛乳中→25℃培養(yǎng)12 h→過濾獲得開菲爾?！?4℃冷藏備用。

1.2.3 接種開菲爾粒進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)

活化后獲得的開菲爾粒，分別接種于3個裝有滅菌鮮乳培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃恒溫培養(yǎng)箱密封培養(yǎng)，分別在0、24、48、72、96、120 h從3個發(fā)酵瓶中取樣三份。標(biāo)記后-80℃冰箱冷凍保存待測。

1.2.4 pH值和滴定酸度的測定

使用精密pH計(jì)測量樣品的pH值，每樣品3個平行。準(zhǔn)確稱取5 g開菲爾，加40 m L的蒸餾水，3滴酚酞指示劑，混勻，用標(biāo)準(zhǔn)0.1m o l/L N aOH溶液滴定[16]。

1.2.5 樣品總DNA提取

通過PCRBIO Taq DNA聚合酶提取樣品總DNA。

引物為：27F（5’-gagagtttgatcctggctcag-3’）

引物包含一組16個核苷酸的條形碼。最終反應(yīng)混合物的體積為50μL。每個樣品包含1×PCRBIO反應(yīng)緩沖液，10 m g模板DN A，每個引物10 m o l和1μg Taq DNA聚合酶。反應(yīng)條件如下：95℃5 min，然后在95℃30 s，58℃ 45 s和52℃ 1 min進(jìn)行30個循環(huán)，最終延伸52℃5 min。使用Agilent DNA 1000試劑盒和Agilent 2100生物分析儀檢查PCR產(chǎn)品的質(zhì)量。純化的PCR產(chǎn)物用于通過模板制備試劑盒2.0（Pacific Biosciences Tem p late Prep K it 2.0）構(gòu)建DNA文庫。

1.2.6 樣品PacBio SMRT上機(jī)測序

建庫測序：提取樣品總DN A后，根據(jù)16S全長引物27F和1541R，合成帶有Barcode的特異引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對其產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化形成測序文庫（SMRT Bell），建好的文庫先進(jìn)行文庫質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫用PacBio Sequel進(jìn)行測序。PacBio Sequel下機(jī)數(shù)據(jù)為bam格式,通過sm rtlink分析軟件導(dǎo)出CCS文件,根據(jù)Barcode序列識別不同樣品的數(shù)據(jù)并轉(zhuǎn)化為fastq格式數(shù)據(jù)。

1.2.7 序列處理與生物信息學(xué)分析

原始數(shù)據(jù)是根據(jù)RS R eadsO finsert.1生成的。Q IIME軟件包用于獲取高質(zhì)量序列。為了提取高質(zhì)量序列，將最小全通量，最小預(yù)測準(zhǔn)確性，最小插入片段讀取長度和最大讀取長度分別設(shè)置為5、90、1 400和1 800 bp。去除條形碼和引物序列以創(chuàng)建數(shù)據(jù)集。以選擇讀取長度超過425 bp的序列。然后，將PyNAST和UCLUST用于在序列同一性為100%聚類下比對序列，以獲得代表性序列。之后通過UCLUST將序列分類為可操作的分類單位（OTU），其閾值為95%。核糖體數(shù)據(jù)庫用于每個O TU代表序列的分類分配80%的置信度閾值。使用FastT ree中設(shè)置的代表性O(shè)TU進(jìn)行分類用于下游分析。α多樣性由Shannon-Wiener，Sim pson指數(shù)，Chao1指數(shù)和稀釋性曲線計(jì)量評估。加權(quán)和非加權(quán)計(jì)算都應(yīng)用于主成分分析（principal co-ordinates analysis）以分析微生物群落。使用R軟件包3.1.2版和O rigin軟件8.5版生成圖形。

2 結(jié)果與討論

2.1 開菲爾細(xì)菌多樣性分析

2.1.1 測序深度評估

為了更全面地揭示開菲爾微生物群落組成及多樣性信息，采用了Pac Bio測序技術(shù)對不同發(fā)酵時間開菲爾樣品的微生物群落進(jìn)行了解析（如圖1）。

圖1 開菲爾發(fā)酵樣品稀疏曲線和香農(nóng)曲線

由圖1可知，對于細(xì)菌群落，共獲得高質(zhì)量序列61 682條，平均每個樣本含有4 072條；根據(jù)97%的序列相似度對序列進(jìn)行OTU劃分，共獲得1 062個OTU，總體而言，每個開菲爾樣品的覆蓋率(coverage)均在99%以上，表明測序的深度可以準(zhǔn)確反映開菲爾發(fā)酵過程細(xì)菌群落的真實(shí)情況。各發(fā)酵樣品的稀疏曲線均未進(jìn)入平臺期，因此隨著測序量的增加有可能發(fā)現(xiàn)新的細(xì)菌，另一張圖顯示隨著測序深度的增加香農(nóng)曲線已進(jìn)入平臺期，說明在該測序深度下，發(fā)酵樣品中的細(xì)菌的多樣性可以被充分展示。因此本研究中細(xì)菌測序量滿足后續(xù)生物信息學(xué)分析的要求。

2.1.2 開菲爾細(xì)菌多樣性

細(xì)菌群落的Chao1指數(shù)在發(fā)酵0～96 h呈現(xiàn)先下降后上升再下降后上升的態(tài)勢，且在0 h達(dá)到最大值54.68±0.95。辛普森指數(shù)呈現(xiàn)先上升后下降再上升后下降的態(tài)勢，且在0 h達(dá)到最值0.09±0.03。說明開菲爾發(fā)酵過程中細(xì)菌群落組成前期大于發(fā)酵后期，后期發(fā)酵細(xì)菌多樣性較小，見表1。

2.1.3 開菲爾細(xì)菌菌群構(gòu)成

在采樣的開菲爾中鑒定出2個細(xì)菌門，主要門為厚壁菌門（Firmicutes）變形菌門（Proteobacteria）。在發(fā)酵過程中厚壁菌門呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢。以下為0～96 h相對豐度數(shù)據(jù)（4.37%、62.80%、59.01%、74.58%、85.69%），在發(fā)酵0～96 h之間96 h達(dá)到最值。變形菌門呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，為0～96 h相對豐度數(shù)據(jù)（91.74%、37.20%、40.96%、25.42%、4.30%），在發(fā)酵0 h處于相對最大值。

表1 開菲爾發(fā)酵樣品多樣性指數(shù)表

開菲爾發(fā)酵樣品中鑒定了30個屬，相對豐度大于1%屬（圖2），在發(fā)酵0 h相對豐度大于1%的菌屬為：腸桿菌屬（Enterobacter）8%，蛭弧菌屬（Bdellovibrio）15%，嗜甲基菌屬（Methylophilus）14%，鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）12%，羅爾斯頓菌屬（Ralstonia）9%，彎曲桿菌屬（Curvibacter）7%，食酸菌屬（Acidovora x）7%，苯細(xì)菌屬（Phenylobacterium）5%。在發(fā)酵24 h僅有兩種菌屬芽孢桿菌屬（Bacillus）61%和腸桿菌屬（Enterobacter）37%。在發(fā)酵48 h有4種菌屬氣單胞菌屬（Aeromonas）40%，嗜熱桿菌屬（Exiguobacterium）42%，鏈球菌屬（Streptococcus）14%。72 h有4種菌屬芽孢桿菌屬（Bacillus）73%，腸桿菌屬（Enterobacter）7%，氣單胞菌屬（Aeromonas）18%。96 h有3種芽孢桿菌屬（Bacillus）64%，腸桿菌屬（Enterobacter）8%，鏈球菌屬（Streptococcus）22%。

圖2 發(fā)酵樣品細(xì)菌屬組成的柱狀

圖2中，KSX 001-003為喀什開菲爾發(fā)酵0 h樣品；KSX 241-243為喀什開菲爾發(fā)酵24 h樣品；KSX 481-483為喀什開菲爾發(fā)酵48 h樣品；KSX 721-723為喀什開菲爾發(fā)酵72 h樣品；KSX 961-963為喀什開菲爾發(fā)酵96 h樣品。

在發(fā)酵過程中芽孢桿菌屬呈現(xiàn)先逐漸增加的趨勢，在72 h相對豐度達(dá)到最大值73%（0～96 h發(fā)酵過程中的變化趨勢為3%，61%，0%，73%，64%）、腸桿菌屬呈現(xiàn)先增加后減少再增加的趨勢，在24 h達(dá)到最大值（0～96 h發(fā)酵過程中的變化趨勢為8%，37%，1%，7%，8%）氣單胞菌呈現(xiàn)先增后減的趨勢，在48 h達(dá)到最大值（0～96 h發(fā)酵過程中的變化趨勢為1%，0%，40%，18%，0%）、鏈球菌屬呈現(xiàn)先增加后減少再增加的趨勢，在96 h達(dá)到最大值（0～96 h發(fā)酵過程中的變化趨勢為0%，1%，14%，2%，22%）。

圖3中，0 h為喀什開菲爾發(fā)酵0 h樣品；24 h為喀什開菲爾發(fā)酵24 h樣品；48 h為喀什開菲爾發(fā)酵48 h樣品；72 h為喀什開菲爾發(fā)酵72 h樣品；96 h為喀什開菲爾發(fā)酵96 h樣品。由圖3可知，在0 h鑒定到6種菌種：炭疽芽孢桿菌（Bacillus.anthracis）2%、腸桿菌（Enterobacter sp）8%、嗜水氣單胞菌（Aeromonas.diversa）1%、嗜甲基菌（Methylophilus.sp）14%、鞘氨醇單胞（Sphingomonas.leidyi）12%、細(xì)菌（bacterium）9%。在發(fā)酵24 h鑒定了3種：炭疽芽孢桿菌（Bacillus.anthracis）61%、腸桿菌（Enterobacter.sp）37%、唾液鏈球菌（S.oralis.subsp）1%。在發(fā)酵48 h鑒定到了4種：腸桿菌（Enterobacter.sp）1%、嗜水氣單胞菌（Aeromonas.diversa）40%、微小桿菌（Exiguobacterium.sp）42%、唾液鏈球菌（S.oralis.subsp）14%。在發(fā)酵72 h鑒定到了4種：炭疽芽孢桿菌（Bacillus.anthracis）73%、腸桿菌（Enterobacter.sp）7%、嗜水氣單胞菌（Aeromonas.diversa）18%、嗜熱鏈球菌（S.thermophilus）2%。在發(fā)酵96 h鑒定到4種炭疽芽孢桿菌（Bacillus.anthracis）64%、腸桿菌（Enterobacter.sp）8%、唾液鏈球菌（S.oralis.subsp）7%、嗜熱鏈球菌（S.thermophilus）15%。炭疽芽孢桿菌在發(fā)酵過程中0～24h呈現(xiàn)增加的趨勢，在發(fā)酵48 h相對豐度為0，隨著發(fā)酵的進(jìn)行逐漸增加，相對豐度在發(fā)酵72 h達(dá)到最大值。腸桿菌在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)先增后減的趨勢，在0～24 h逐漸增加，腸桿菌在48 h相對豐度也為0，在72～96 h逐漸增加。唾液鏈球菌呈現(xiàn)先增后減的趨勢，在48 h相對豐度達(dá)到最大值。嗜熱鏈球菌在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)增加趨勢，在0～48 h為檢測到嗜熱鏈球菌，在72～96 h嗜熱鏈球菌逐漸增加，96 h達(dá)到最大值。

圖3 開菲爾發(fā)酵樣品0～96 h細(xì)菌種組成的柱狀

2.2 開菲爾細(xì)菌差異性

2.2.1 開菲爾細(xì)菌差異性分析

圖4為不同發(fā)酵時間開菲爾樣品細(xì)菌群落的PCoA分析，結(jié)果顯示了開菲爾樣品在發(fā)酵過程中細(xì)菌群落的相似性及差異性。

開菲爾發(fā)酵樣品分布于3個象限，其中發(fā)酵0 h（剛開始發(fā)酵的開菲爾）的樣品單獨(dú)位于第2象限，表明0 h樣品中細(xì)菌群落與24～96 h樣品細(xì)菌群落差異較大。發(fā)酵24、48 h的樣品位于第4象限。發(fā)酵72、96 h的開菲爾樣品同時分布于第4象限。不同發(fā)酵時間樣品之間存在差異性，分布結(jié)果同多樣性指數(shù)相符合。由此可以分為4個階段：(1)發(fā)酵0 h，細(xì)菌多樣性最高，(2)發(fā)酵24 h，細(xì)菌多樣性開始下降，細(xì)菌結(jié)構(gòu)迅速調(diào)整；(3)發(fā)酵48 h細(xì)菌多樣性增加。(4)發(fā)酵72～96 h，細(xì)菌多樣性變化較小，群落結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定。使用PCoA分析了細(xì)菌群落差異性，結(jié)果顯示不同發(fā)酵時間開菲爾樣品之間細(xì)菌群落組成有明顯差異。

圖4 發(fā)酵樣品PCoA圖

2.2.2 開菲爾細(xì)菌與環(huán)境因子相關(guān)性

在開菲爾發(fā)酵過程中，物種與環(huán)境因子相關(guān)性可為兩類，一類是pH有關(guān)，與發(fā)酵過程中大多數(shù)物種呈正相關(guān)關(guān)系；另外一類Lactic(滴定酸度)，與發(fā)酵過程中大多數(shù)物種呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，如圖5。

圖5 發(fā)酵樣品細(xì)菌與環(huán)境因子關(guān)系

由圖5可知，其中嗜熱桿菌屬（Exiguobacterium）、棒桿菌屬（Caulobacter）、氣單胞菌屬（Aeromonas）、葡萄球菌屬（Streptococcus）、桿菌屬（Thermomonas）與pH呈正相關(guān)；芽孢桿菌屬（Bacillus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、腸桿菌屬(Enterobacter)與pH呈負(fù)相關(guān)。氣單胞菌屬(Aeromonas)、細(xì)菌滅弧菌屬(Bacteriovorax)與滴定酸度（Lactic）呈正相關(guān)，鞘氨醇屬（Sphingobium）、羅爾斯頓菌屬(Ralstonia)、彎曲桿菌屬(Curvibacter)、嗜甲基菌屬(Methylophilus)與滴定酸度（Lactic）呈負(fù)相關(guān)。

3 結(jié)果與討論

開菲爾發(fā)酵過程中細(xì)菌群落對于開菲爾制品的質(zhì)量具有重要意義。目前許多生物學(xué)方法已被用來表征開菲爾發(fā)酵過程中的細(xì)菌群落[17-18]。在本研究中，采用PacBio SMRT測序共檢測到2個門、30個屬、8個種的細(xì)菌，其中優(yōu)勢菌門為厚壁菌門和變形菌門。其中優(yōu)勢菌屬為：芽孢桿菌屬、腸桿菌屬、氣單胞菌、鏈球菌屬。鑒定的種為：炭疽芽孢桿菌（Bacillus.anthracis）、嗜甲基菌（Methylophilus.sp）、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas.leidyi）腸桿菌（Enterobacter.sp）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas.diversa）、微小桿菌（Exiguobacterium.sp）唾液鏈球菌（S.oralis.subsp）、嗜熱鏈球菌（S.thermophilus）。與其他的測序分析開菲爾相比揭示了新的種[19]。

Gesudu等[20]通過單分子實(shí)時測序技術(shù)分析庫米斯（一種發(fā)酵乳制品）細(xì)菌群落中演替的動態(tài)過程表明，瑞士乳桿菌從0到9 h豐度增加，在9 h達(dá)到高峰，然后下降。相比之下，糞腸球菌，杜蘭腸球菌和卡塞爾腸球菌在整個發(fā)酵過程中逐漸增加，并在24 h后達(dá)到最大值。劉文俊等[21]通過PacBio三代測序技術(shù)對傳統(tǒng)酸馬奶進(jìn)行研究,鑒定到種為：瑞士乳桿菌、乳酸乳球菌、副乳鏈球菌、棉子糖乳球菌、腸膜陰串珠球菌和產(chǎn)馬乳酒乳桿菌等，與本研究有差異。開菲爾在發(fā)酵前期存在大量的細(xì)菌，隨著發(fā)酵的進(jìn)行細(xì)菌種類逐漸減少并趨于穩(wěn)定。Bourrie BC等[22]研究發(fā)酵開菲爾中的微生物發(fā)現(xiàn)：主要由厚壁菌門和變形菌門組成，屬水平則主要由乳酸菌屬和醋酸桿菌屬組成，其次是芽孢桿菌屬和鏈球菌屬，種水平除了比較常見的嗜酸乳桿菌、乳酸乳球菌、德氏乳桿菌、植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌、乳酪鏈球菌、雙歧桿菌、醋酸酐菌、釀酒酵母菌、白色念珠菌、干酪乳桿菌和卷曲乳桿菌外，還有特異的開菲爾乳桿菌、馬乳酒樣乳桿菌、開菲爾念珠菌等。賈宇聲等[23]鑒定出的主要細(xì)菌是副氏乳桿菌，其次是醋酸桿菌，開菲乳桿菌和乳酸乳球菌，與本研究有差異。有研究報(bào)道，發(fā)酵劑培養(yǎng)類型、貯藏期和哺乳動物物種以及溫度和pH的變化對發(fā)酵乳中微生物都有顯著影響[24-25]。