吳 毛 王建偉 馮 驊 尹 恒 華 臻 俞云飛

（江蘇省無(wú)錫市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 無(wú)錫 214000）

骨折是以骨小梁組織連續(xù)性破壞為特點(diǎn)，骨組織的修復(fù)與重建是在多種組織因子和細(xì)胞參與下共同完成。中醫(yī)學(xué)將其歸屬到“骨折病”范疇，認(rèn)為骨折必?fù)p傷經(jīng)脈氣血，致血脈離經(jīng)妄行、血瘀留滯?！皠⑹瞎莻弊鳛闊o(wú)錫市非物質(zhì)文化遺產(chǎn)［1］，經(jīng)多代傳人總結(jié)形成本院經(jīng)驗(yàn)方—?jiǎng)⑹险欠?，具有“活血祛瘀，接骨續(xù)筋”功效，且臨床療效顯著［2-3］，但有關(guān)其促進(jìn)骨折愈合的具體作用機(jī)制尚不明確。近年來(lái)有關(guān)中藥促進(jìn)骨折愈合多集中于調(diào)節(jié)骨代謝、促進(jìn)成骨細(xì)胞形成等方面，其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）作為骨組織干細(xì)胞主要來(lái)源，可以在BMP、Wnt信號(hào)通路等多種生物信息網(wǎng)調(diào)節(jié)下促成骨分化［4］?，F(xiàn)代研究表明［5-6］，Wnt信號(hào)通路及其下游靶基因Rnux2、OSX是調(diào)節(jié)成骨分化的關(guān)鍵路徑。硬骨素（Sclerostin/SOST）可以通過(guò)抑制Wnt信號(hào)通路從而負(fù)向調(diào)節(jié)成骨代謝［7］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)［8］，通過(guò)siRNA抑制Sclerostin基因表達(dá)可以促進(jìn)BMP-4體外誘導(dǎo)BMSCs成骨分化過(guò)程。因此，本研究依托無(wú)錫市科教強(qiáng)衛(wèi)項(xiàng)目（ZDRC025），設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)探討劉氏正骨方對(duì)BMSCs體外成骨分化的影響及其可能作用機(jī)制，為劉氏正骨方治療骨折病提供理論基礎(chǔ)，并為其應(yīng)用于治療骨折提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

DMEM（Hyclone，美國(guó)）；胎牛血清（GlBICO，美國(guó)）；胰蛋白酶（Sigma，美國(guó)）；CCK-8試劑盒（Abcam，美國(guó)）；茜素紅（Sigma，美國(guó)）；總蛋白提取試劑盒（上海碧云天公司，中國(guó)）；一抗：Col1A2、OCN、OPN、Scleros?tin、LRP5、Runx2及GAPDH均為美國(guó)Abcam公司產(chǎn)品。二抗：山羊抗兔抗體和馬抗小鼠抗體為美國(guó)CST公司產(chǎn)品；NanoDrop 2000（Thermo&Scintific，美國(guó)）；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀和Trizol（Invitrogen，美國(guó)）；實(shí)時(shí)PCR試劑盒（TOYOBO，中國(guó)）；實(shí)時(shí)PCR儀（RocheLightCycler480，德國(guó)）；PCR反應(yīng)體系和反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas，美國(guó)）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒和ECL發(fā)光液（上海碧云天公司，中國(guó)）。

1.2 含藥血清制備

劉氏正骨方（丸劑）組成：地鱉蟲(chóng)2 g，血竭1 g，川芎1 g，乳香1 g，沒(méi)藥1 g，白術(shù)1 g，丁香1 g，杜仲1 g，骨碎補(bǔ)3 g，黨參2 g，當(dāng)歸3 g，黃芪 1 g，自然銅 1 g，熟地黃3 g，蘇木3 g等。無(wú)錫市中醫(yī)醫(yī)院藥劑室制備，溶解、濃縮為最終質(zhì)量濃度0.45 g/mL生藥，置于4℃冰箱保存。取與中藥湯劑相同劑量的0.9%氯化鈉溶液配置成對(duì)照溶液。中藥血清制備：取體質(zhì)量100～150 g SD大鼠，依據(jù)《藥理試驗(yàn)中動(dòng)物間和動(dòng)物與人體間的等效劑量換算》計(jì)算實(shí)際大鼠灌藥劑量，終末灌服質(zhì)量濃度0.45 g/mL?？瞻籽褰M給予等量生理鹽水。每天灌藥8∶00、20∶00分別灌服1次，連續(xù)7 d，第7天上午8∶00灌注全天量，灌服后1 h后于下腹主動(dòng)脈采血，經(jīng)靜置、離心、滅活補(bǔ)體、過(guò)濾除菌等步驟制得，分裝并標(biāo)記含中藥血清和空白血清，放置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 BMSCs分離與培養(yǎng)

分離：取體質(zhì)量100～150 g SD大鼠，采取斷頸法處死后消毒、剝離并折斷脛骨及股骨，用含雙抗PBS液（終濃度為青霉素100 U/mL和鏈霉素100 μg/mL）沖洗出骨髓細(xì)胞，離心去上清液、PBS重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)。培養(yǎng)：按4×105個(gè)/cm2密度將細(xì)胞均勻接種于MGM培養(yǎng)基，加入10% FBS、1%雙抗，37℃、5% CO2環(huán)境的恒溫箱中培養(yǎng)，3 d換液1次，繼續(xù)培養(yǎng)7 d后收集細(xì)胞，取部分用于實(shí)驗(yàn)，部分液氮冷藏保存。

1.4 BMSCs成骨分化誘導(dǎo)及分組

將BMSCs按1×105個(gè)/cm2密度接種于六孔板，使用MGM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后進(jìn)行試驗(yàn)。依據(jù)干預(yù)培養(yǎng)條件分為對(duì)照組（含10%空白血清）、中藥組（10%中藥血清）、BMP-2組（含BMP-2 50 ng/mL），每2日更換1次培養(yǎng)液，在第28天時(shí)收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性；采用實(shí)時(shí)熒光PCR和Western blotting檢測(cè)成骨分化相關(guān)分子（Col1A2、OCN、OPN）及Scleros?tin基因的mRNA和蛋白水平表達(dá)情況；采用ALP和茜素紅染色檢測(cè)細(xì)胞礦化程度。

1.5 含藥血清對(duì)Sclerostin基因濃度依賴(lài)性研究

將BMSCs按1×105個(gè)/cm2密度接種于六孔板，使用MGM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，依據(jù)中藥血清濃度分4組：對(duì)照組（含10%空白血清）、低濃度組（2.5%中藥血清）、中濃度組（5%中藥血清）、高濃度組（含10%中藥血清），使用空白血清調(diào)配使各組最終血清終濃度為10%，每2天更換1次培養(yǎng)液，在第14天時(shí)收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè)

1.6.1 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性 將BMSCs按1×106個(gè)/cm2密度接種于96孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)，干預(yù)結(jié)束后在避光處加入配置好的CCK-8溶液，37℃孵育2 h，再用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD 450 nm處測(cè)量各孔的吸光值并計(jì)算。

1.6.2 DNA含量分析 將BMSCs按3×105個(gè)/cm2密度接種于96孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，24 h后進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后收集細(xì)胞樣本。DNA含量由CyQUANT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒測(cè)量；其中，激發(fā)波長(zhǎng)為450 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為530 nm。

1.6.3 實(shí)時(shí)熒光PCR法 收集細(xì)胞樣品，抽取總RNA，以2 μg反轉(zhuǎn)20 μL體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。檢測(cè)目的基因的mRNA表達(dá)。將反轉(zhuǎn)的cDNA稀釋5倍，進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。擴(kuò)增體系為10.0 μL，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃ 5 s、60℃ 25 s，擴(kuò)增50個(gè)循環(huán)。溶解曲線分析：95℃5 s；溶解曲線為單一峰說(shuō)明是特異性擴(kuò)增，陰性對(duì)照為ddH2O，GAPDH為內(nèi)參，每個(gè)模板做3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果使用相對(duì)定量2-ΔΔCt方法分析。引物序列詳見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)引物序列

1.6.4 Western blotting法 收集細(xì)胞樣品，使用蛋白提取緩沖液RIPA和蛋白酶抑制劑PMSF提取蛋白，經(jīng)冰上靜置、4℃離心后采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，SDSPAGE電泳，用0.22 μm孔徑的PVDF膜轉(zhuǎn)膜，經(jīng)封閉、一抗孵育、洗滌、孵育二抗后，常規(guī)ECL發(fā)光液顯色。

1.6.5 ALP染色與茜素紅染色 使用固紫B試劑盒（購(gòu)自Sigma公司）和茜素紅鈣染色試劑盒（購(gòu)自Sig?ma公司）分別進(jìn)行染色，并通過(guò)倒置顯微鏡觀察拍照記錄。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用PASS Statistics 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，兩獨(dú)立樣本采用t檢驗(yàn)，多樣本采用單因素相差分析，方差不齊采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組BMSCs細(xì)胞活性及成骨分化的比較

細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)：與對(duì)照組相比，中藥組和BMP-2組細(xì)胞活性明顯增高（P<0.05）；中藥組和BMP-2組中的DNA含量也相應(yīng)增高。見(jiàn)表2。成骨分化實(shí)驗(yàn)：與對(duì)照組相比，中藥組和BMP-2組細(xì)胞ALP活性明顯增強(qiáng)（P<0.05），且BMP-2組效果最強(qiáng)（P<0.05）。茜素紅染色結(jié)果：中藥組和BMP-2組細(xì)胞外礦化程度明顯高于對(duì)照組（P<0.05），且BMP-2組效果最強(qiáng)。成骨相關(guān)基因Col1A2、OCN和OPN mRNA和蛋白水平表達(dá)情況也呈現(xiàn)相同趨勢(shì)。相較于對(duì)照組和BMP-2組，中藥組中Sclerostin基因表達(dá)明顯抑制。見(jiàn)圖1～圖2，表2～表3。

圖1 劉氏正骨方含藥血清上調(diào)BMSCs細(xì)胞ALP活性及細(xì)胞礦化

圖2 各組Col1A2、OCN、OPN蛋白水平表達(dá)比較

表2 各組BMSCs細(xì)胞增殖和礦化現(xiàn)象比較（±s）

表2 各組BMSCs細(xì)胞增殖和礦化現(xiàn)象比較（±s）

注：與本組治療前比較，?P<0.05；與中藥組比較，△P<0.05。下同。

組別對(duì)照組中藥組BMP-2組n 3 3 3 CCK-8 0.957±0.062 1.469±0.087*2.043±0.229*△DNA 1.076±0.026 1.311±0.065*2.085±0.211*△

表3 各組BSMC中成骨相關(guān)基因與Sclerostin基因mRNA表達(dá)比較（±s）

表3 各組BSMC中成骨相關(guān)基因與Sclerostin基因mRNA表達(dá)比較（±s）

組別對(duì)照組中藥組BMP-2組n 3 3 3 ALP活性1.014±0.103 1.723±0.128*3.811±0.262*△茜素紅定量1.047±0.026 1.623±0.244*3.643±0.391*△Col1A2 1.091±0.054 1.526±0.172*3.626±0.366*△OCN 1.083±0.031 1.663±0.219*2.823±0.263*△OPN 1.130±0.064 1.783±0.148*3.533±0.453*△Sclerostin 1.074±0.036 0.911±0.072*4.533±0.725*△

2.2 各組BMSCs活性的比較

見(jiàn)表4。使用不同濃度劉氏正骨方含藥血清處理BMSCs 14 d后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，BMSCs細(xì)胞活性和DNA含量結(jié)果表明低濃度組、中濃度組無(wú)明顯差異（P>0.05），但高濃度組細(xì)胞活性增強(qiáng)，DNA含量增多（P<0.05）。

表4 各組BMSCs細(xì)胞活性及Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)（±s）

表4 各組BMSCs細(xì)胞活性及Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)（±s）

組別對(duì)照組低濃度組中濃度組高濃度組n 3 3 3 3 CCK-8 1.045±0.027 1.121±0.060 1.204±0.122 1.551±0.081*DNA 1.034±0.077 1.078±0.071 1.150±0.091 1.457±0.069*LRP5 1.075±0.046 1.170±0.106 1.276±0.093 1.626±0.203*Runx2 1.069±0.034 1.207±0.067 1.449±0.226 2.039±0.084*Sclerostin 1.031±0.115 0.924±0.071 0.827±0.085 0.737±0.049*

2.3 各組Sclerostin、LRP5、Runx2基因表達(dá)的比較

見(jiàn)圖3，表4。與對(duì)照組相比，高濃度含藥血清可以下調(diào)Sclerostin基因表達(dá)，上調(diào)Wnt信號(hào)通路中關(guān)鍵分子LRP5蛋白以及下游靶基因成骨關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2蛋白的表達(dá)，但低濃度和中濃度組無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。

圖3 各組Sclerostin、LRP5、Runx2基因蛋白水平的表達(dá)

3 討論

“劉氏骨傷”為無(wú)錫市非物質(zhì)文化遺產(chǎn)［1］，由多代傳人總結(jié)、完善形成，該方中骨碎補(bǔ)等補(bǔ)腎壯骨，土鱉蟲(chóng)等活血續(xù)筋，熟地黃補(bǔ)血養(yǎng)陰，黨參等補(bǔ)益氣血，血竭等活血散瘀消腫，諸藥合用共奏活血祛瘀、補(bǔ)腎養(yǎng)肝之功效。我們前期臨床研究也表明［4-5］，劉氏正骨方可以有效地促進(jìn)患者骨折愈合，但其具體作用機(jī)制尚不明確。

現(xiàn)代中醫(yī)藥促進(jìn)骨修復(fù)與重建的研究多聚焦于骨代謝調(diào)節(jié)機(jī)制等方面。目前研究表明［9］，活血化瘀類(lèi)中藥可以改善局部微循環(huán)、促進(jìn)骨組織細(xì)胞活性與增殖；補(bǔ)腎壯骨類(lèi)藥可以加快骨代謝、增加骨含量。骨折愈合的關(guān)鍵在于骨組織再生與重建，而成骨細(xì)胞主要來(lái)源于干細(xì)胞的定向分化。BMSCs屬于多向分化干細(xì)胞，可在特定刺激下發(fā)生促成骨分化，該過(guò)程是由多種細(xì)胞因子和信號(hào)通路共同參與調(diào)控［10］。BMP-2可以通過(guò)Wnt、MAPK等多種信號(hào)通路以及Runx2、Osterix等相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)成骨分化［6］。ALP、細(xì)胞礦化現(xiàn)象是評(píng)價(jià)成骨分化早期和晚期的重要標(biāo)志；Col1A2、OCN、OPN是成骨源性細(xì)胞中反應(yīng)骨轉(zhuǎn)化與形成的特異性標(biāo)志；Sclerostin可負(fù)向調(diào)控成骨分化［11］。本次研究結(jié)果顯示：中藥血清可以增強(qiáng)BMSCs細(xì)胞活性與ALP活性，而細(xì)胞增殖程度是BMSCs促成骨分化的基礎(chǔ)，而Col1A2、OCN、OPN基因也呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，提示劉氏正骨方可以促進(jìn)BMSCs成骨分化，可能是其活血祛瘀、補(bǔ)腎養(yǎng)肝的微觀體現(xiàn)。

Sclerostin早期被作為一種非經(jīng)典BMP拮抗劑，可與BMP的Ⅰ型和Ⅱ型受體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抑制BMP信號(hào)通路，從而負(fù)調(diào)控成骨分化過(guò)程［11］。我們前期研究表明［8］，通過(guò)siRNA抑制Sclerostin基因表達(dá)可以上調(diào)BMP-4誘導(dǎo)BMSCs成骨分化。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)［7，13］，補(bǔ)腎強(qiáng)督類(lèi)中藥復(fù)方可以通過(guò)體上調(diào)Scleros?tin基因表達(dá)來(lái)抑制BMSCs成骨分化。本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMP-2可以上調(diào)BMSCs中Sclerostin基因表達(dá)，這與既往研究結(jié)果相一致［12］，但中藥組中Sclerostin基因呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)［11，14］，Sclerostin蛋白抑制成骨分化并非主要通過(guò)Smad信號(hào)通路，而是通過(guò)與Wnt/β-catenin信號(hào)通路中關(guān)鍵受體Lrp5/6中的El螺旋區(qū)域競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，促使GSK-3β對(duì)β-catenin的磷酸化，從而抑制Wnt/β-catenin信號(hào)激活以及下游轉(zhuǎn)錄因子Runx2的表達(dá)，從而負(fù)向調(diào)控成骨分化過(guò)程，其中Runx2是正向調(diào)節(jié)BMSCs促成骨分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子［5］。因此，我們?cè)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究劉氏正骨方含藥血清促進(jìn)BMSCs成骨作用與Sclerostin基因之間的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高濃度劉氏正骨方含藥血清濃度可增強(qiáng)BMSCs細(xì)胞活性，這可能與下調(diào)Sclerostin基因后抑制成骨細(xì)胞程序性凋亡而延長(zhǎng)細(xì)胞壽命有關(guān)［16］。高濃度劉氏正骨方含藥血清可抑制BMSCs中Scleros?tin基因表達(dá)，且上調(diào)Wnt通路中LRP5和Runx2的表達(dá)，提示劉氏正骨方含藥血清可能是通過(guò)抑制Scleros?tin基因表達(dá)、激活Wnt信號(hào)通路途徑，從而促進(jìn)BSMCs成骨分化過(guò)程。

綜上所述，劉氏正骨方含藥血清可以體外促進(jìn)BMSCs成骨分化，該過(guò)程可能與抑制Sclerostin基因表達(dá)，激活Wnt信號(hào)通路及下游Runx2轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)。本研究初采用現(xiàn)代細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù)手段對(duì)劉氏骨傷理論中活血祛瘀，接骨續(xù)筋理論進(jìn)行微觀驗(yàn)證，為中醫(yī)藥治療骨折提供新的理論方向與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)不足：由于本次實(shí)驗(yàn)不涉及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，無(wú)法觀察對(duì)組織水平的影響；本研究?jī)H探究Wnt通路，還可能有如BMP/Smad信號(hào)通路、MSX2轉(zhuǎn)錄因子等其他因素參與調(diào)節(jié)，在其他生物信息網(wǎng)絡(luò)中的作用還有待進(jìn)一步探究。