李彬彬 姜 敏 王超然 蔣璐劍 周 琴 左明煥 姜 苗

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院腫瘤科，北京 100078；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100029

胃癌最常見的消化道腫瘤之一，近年來發(fā)病率與死亡率均呈升高趨勢[1]。中醫(yī)藥是胃癌治療中不可或缺的一環(huán)。中醫(yī)古籍中并未提及“胃癌”的病名，現(xiàn)一般根據(jù)胃癌的疾病表現(xiàn)將其歸入“積聚”“伏梁”“胃反”“癥瘕”等范疇，論其病機為“本虛標(biāo)實”，即以脾胃虛弱為本，痰凝、氣滯、瘀血、毒聚為標(biāo)。李星等[2]通過對文獻的統(tǒng)計分析得出胃癌證型中最常見的是瘀毒內(nèi)阻證，可見“血瘀”為胃癌發(fā)生的重要因素。名老中醫(yī)是國家及各省市根據(jù)臨床工作與理論傳承評選出的對中醫(yī)藥工作有重點貢獻的人物，對胃癌的治療有豐富的經(jīng)驗，對血瘀的治療各有其獨到的見解，但尚缺乏相關(guān)文獻總結(jié)，故本文通過對文獻的系統(tǒng)挖掘得出名老中醫(yī)從瘀論治胃癌的關(guān)鍵藥物，并以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)解釋活血化瘀藥物作用于胃癌的主要活性成分及作用靶點。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)采集

計算機檢索2000 年1 月1 日—2019 年10 月1 日內(nèi)中國知網(wǎng)（CNKI）、萬方數(shù)據(jù)知識服務(wù)平臺（Wanfang Data）、維普中文期刊服務(wù)平臺（VIP）數(shù)據(jù)庫，結(jié)合人工檢索相關(guān)書籍。以2015 年版《胃癌臨床實踐指南》[3]及《中國藥典》[4]為標(biāo)準(zhǔn)納入病例并收集名老中醫(yī)從論治胃癌的處方。將處方藥物錄入并上傳至古今醫(yī)案云平臺（V1.5.6），在“中藥配伍”的“關(guān)聯(lián)分析”中得到相關(guān)關(guān)聯(lián)規(guī)則結(jié)果。應(yīng)用“復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)圖分析”功能，調(diào)節(jié)“邊權(quán)重”為12，得出核心藥物組合。

1.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機制及關(guān)鍵干預(yù)靶點預(yù)測

1.2.1 核心藥物活性化合物及對應(yīng)靶點的篩選 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析數(shù)據(jù)庫和平臺（TCMSP）中以所得核心藥物為關(guān)鍵詞，并按照口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18 篩選化合物。此外，在TCMSP 獲得篩選所得的化學(xué)成分對應(yīng)的靶點蛋白，導(dǎo)入Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/），限定物種為人，將所有靶基因名稱校正為其官方名稱，剔除無對應(yīng)靶點成分及重復(fù)靶點。

1.2.2 疾病靶點的確定及交集靶點的收集 在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）及在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM）數(shù)據(jù)庫（https://omim.org/）中通過檢索關(guān)鍵詞“gastric cancer”，收集胃癌相關(guān)靶點，利用韋恩（Venn）圖顯示藥物靶點與疾病靶點的交集靶點。

1.2.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析 將交集靶點導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫（https//string-db.org/）繪制蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。利用R 軟件（Version 3.6.1）得到PPI 可視化圖形，根據(jù)度值（degree）＞30 篩選核心靶點，建立“中藥成分-核心靶點”數(shù)據(jù)集，并將其導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 建立網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.4 靶點的分子功能/生物過程和通路富集分析 在R 軟件中安裝相關(guān)軟件包，以P ＜0.05、Q ＜0.05 進行關(guān)鍵靶基因基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）功能富集分析，并將結(jié)果以條形圖和氣泡圖形式輸出。

2 結(jié)果

2.1 藥物關(guān)聯(lián)度分析

共納入68 首處方，38 種藥物，挖掘得到6 條關(guān)聯(lián)規(guī)則。見表1。

表1 藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則

2.2 復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析

復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)圖分析得出核心活血化瘀藥物組合為當(dāng)歸、石見穿、丹參、莪術(shù)、延胡索、桃仁、三棱、紅花。見圖1。

圖1 核心活血化瘀藥物組合

2.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.3.1 中藥化合物篩選及對應(yīng)靶點收集 共收集到8 味核心藥物所含化合物171 個，經(jīng)去重、刪除無靶點化合物后共得到131 個有效化合物，對應(yīng)123 個靶點。其中，對應(yīng)靶點數(shù)≥10 的化合物31 個。見表2。

2.3.2 疾病靶點與交集靶點收集 檢索GeneCards 及OMIM 得到與胃癌對應(yīng)的靶點1254 個，將藥物對應(yīng)靶點與胃癌對應(yīng)的123 個疾病靶點進行匹配分析，得到62 個核心藥物有效作用靶點，應(yīng)用Venn 圖見圖2。

表2 核心藥物主要化合物信息

圖2 交集靶點Venn 圖

2.3.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建及可視化分析 將交集靶點導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫得到PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。對網(wǎng)絡(luò)圖進行可視化分析，篩選出16 個核心作用靶點，見圖4，分別是EGFR、MYC、CASP3、CCND1、ESR1、ALB、IL6、MAPK8、VEGFA、ERBB2、FOS、AR、MDM2、CYCS、CASP8、RELA，提示這些核心作用靶點在網(wǎng)絡(luò)中起到關(guān)鍵作用。

2.3.4 網(wǎng)絡(luò)特征分析 經(jīng)上述可得核心藥物對胃癌的16 個核心有效靶點，對應(yīng)52 個中藥成分，見圖5。網(wǎng)絡(luò)中連接度前6 的中藥成分為槲皮素、木犀草素、黃芩素、β-胡蘿卜素、山奈酚和丹參酮ⅡA。

2.3.5 GO 功能及KEGG 通路富集分析 通過關(guān)鍵靶基因，共富集1327 個生物學(xué)過程和功能，根據(jù)校正后P 值進行排序，選擇生物過程、分子功能及細胞成分前10 個進行條形圖展示，見圖6（封四），共富集38 條通路，根據(jù)校正后P 值進行排序，選擇前20 個進行氣泡圖展示，見圖7（封四）。

圖3 交集靶點蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 核心靶點可視化分析

圖5 “中藥成分-核心靶點”網(wǎng)絡(luò)

3 討論

在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中，血瘀證貫穿始終，葉天士曾指出“久病入絡(luò)”“久病必有瘀”，王捷虹課題組[5]通過跟蹤324 例胃癌前病變患者2 年，得出“毒瘀交阻”是其發(fā)生癌變的核心病機，解毒化瘀兼益氣養(yǎng)陰法能有效阻止其癌變。名老中醫(yī)陳光偉認為中晚期胃癌多為虛實夾雜，而實邪主要有熱、瘀、毒、痰[6]。名老中醫(yī)劉沈林認為胃癌晚期治療以健脾養(yǎng)正消癥法為主，選方可參照健脾資生丸合血癥丸[7]。故在胃癌治療的不同時期均可應(yīng)用活血化瘀藥物。

本研究得出名老中醫(yī)治療胃癌血瘀證的核心藥物為當(dāng)歸、石見穿、丹參、莪術(shù)、延胡索、桃仁、三棱、紅花。關(guān)聯(lián)規(guī)則分析可得關(guān)聯(lián)度較強的藥對組合有三棱-莪術(shù)、紅花-桃仁。研究發(fā)現(xiàn)[8-9]，紅花-桃仁藥對可改善胃癌血瘀證患者的凝血指標(biāo)，降低血液黏度。張瑩等[10]發(fā)現(xiàn)三棱、莪術(shù)組方可通過降低胃癌移植瘤裸鼠血清環(huán)氧合酶-2（COX-2）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）水平，從而達到抑制腫瘤生長的作用。石見穿、丹參與當(dāng)歸均對腫瘤細胞有抑制作用[11-13]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析可得活血化瘀核心藥物主要活性成分有槲皮素、木犀草素和黃芩素等。GO 功能分析集中在類固醇激素反應(yīng)、對有毒物質(zhì)的反應(yīng)、細胞核受體活性等方面。槲皮素可調(diào)節(jié)組蛋白乙?；?，進而影響基因轉(zhuǎn)錄，同時FOS、AHR、JUN 等可能是槲皮素在胃癌中的作用靶點[14]。而山奈酚可通過上調(diào)miR-181a、抑制多種通路來抑制胃癌SNU-216 細胞的活力和增殖，促進細胞自噬[15]。提示核心藥物的幾種主要成分可能通過調(diào)節(jié)細胞核內(nèi)miRNAs 及核外多種蛋白酶來影響一系列通路，主要通路有PI3K-Akt 信號通路、細胞凋亡、MAPK 信號通路、HIF-1 信號通路等。細胞凋亡與Bcl-2 家族蛋白和caspase 家族蛋白密切相關(guān)，同時與PI3K-Akt 信號通路及MAPK 信號通路等多條通路有關(guān)[16]。PI3K-Akt 信號通路是影響細胞周期的重要通路，PI3K 和Akt 蛋白的磷酸化可激活MTOR通路，從而促使腫瘤細胞從G0/G1期向S 期進展[17]。MAPK 包括多種信號途徑，其中JNK、p38 MAPK 與細胞凋亡密切相關(guān)[18]。實驗證明，核心藥物所含木犀草素[19]、黃芩素[20]與山奈酚[15]均可通過PI3K-Akt 信號通路或者MAPK 信號通路誘導(dǎo)細胞凋亡。實體腫瘤的迅速生長使中心區(qū)域氧氣供應(yīng)不足，激活HIF-1，VEGF 被認為是HIF-1 的下游基因，可促進胃癌血管生成，與腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)。所以推測核心藥物可以通過促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤血管新生來控制胃癌細胞生長轉(zhuǎn)移。PI3K-Akt 信號通路與HIF-1 通路也與化療和靶向藥物的耐藥有關(guān)[21]。實驗證明，黃芩素可能通過HIF-1α 通路下調(diào)藥物外排功能，從而逆轉(zhuǎn)缺氧誘導(dǎo)的胃癌5-FU 耐藥。β-胡蘿卜素是一種常見的抗氧化物，存在于多種果蔬及藥物之中。研究表明，β-胡蘿卜素對幽門螺桿菌感染的胃癌高危人群具有保護性作用[23]。丹參酮ⅡA 可以抑制細胞增殖和腫瘤生長，增強阿霉素對耐藥胃癌細胞的抗癌作用[24-25]。由以上分析，可推測核心藥物通過多種成分從不同通路影響細胞周期，促進細胞凋亡，逆轉(zhuǎn)化療耐藥，影響血管生成等，體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點、多途徑的整體調(diào)節(jié)特點。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對名老中醫(yī)治療胃癌血瘀證的核心藥物的作用機制進行探討，結(jié)果顯示核心活血化瘀藥物的主要潛在活性成分及作用靶基因與胃癌作用通路的關(guān)系，為進一步深入探討其作用機制提供新思路，但仍需進一步的實驗研究進行驗證。