劉晨陽 張成 楊婕 孫韜

表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)作為EGFR陽性肺癌患者治療的一線靶向用藥，能顯著延長晚期患者生存時間，改善患者生活質(zhì)量。然而EGFR-TKI抵抗的形成，嚴重影響了其療效[1]，其形成的機制復雜，涉及EGFR突變、c-Myc基因擴增及腫瘤干細胞等。非編碼RNA作為表觀遺傳的重要執(zhí)行者，與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。成熟的miRNA通過與其互補的mRNA結(jié)合，進而促進靶mRNA的降解或抑制其翻譯[2]。miR-145可靶向c-Myc、Oct4及AKT等原癌基因，在多種惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌作用[3-5]，因此，揭示miR-145的調(diào)控機制對于腫瘤的早期診斷及治療方案的評估至關重要，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是長度>200nt的非編碼RNA，其可作為內(nèi)源競爭RNA(competing endogenous RNAs，ceRNA)，抑制miRNA的生物學效應，參與調(diào)控腫瘤細胞的惡性行為及藥物抵抗[6-7]。本研究通過生物信息技術發(fā)現(xiàn)，與miR-145潛在結(jié)合的lncRNA LINC00628，并對其與miR-145的結(jié)合作用及與肺腺癌細胞EGFR-TKI抵抗的關系進行了探究。

資料與方法

一、實驗材料

1 實驗細胞及試劑 人肺腺癌細胞系PC9(上海生科院細胞資源中心)，RPMI-1640培養(yǎng)基及胎牛血清(FBS，美國Gibco)，吉非替尼(Gefitinib，美國MCE)，LINC00628 小干擾RNA(small interference RNA LINC00628，siLINC)及隨機序列對照表達載體(上海吉凱基因)，LINC00628過表達載體、miR-145過表達載體及空白載體(上海漢恒生物)，合成miR-145 NC及mimics(上海漢恒生物科技)，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(美國Thermo Fisher)，psiCHECK2載體及Luciferase Assay Reagent II試劑盒(美國Promega)，CCK-8試劑(日本同仁化學)，RNAiso Plus、PrimeScript RT reagent Kit及SYBR Green I(日本Takara)，GAPDH、c-Myc及AKT抗體(美國Proteintech)。

2 臨床組織來源 收集2019年7月至2019年12月我院普胸外科54例肺腺癌患者腫瘤組織及癌旁組織，取材后取部分組織置于液氮罐中保存，54例患者中男性30例，女性24例；年齡36～71歲，中位年齡51歲；包括高分化腺癌11例，中低分化腺癌43例；Ⅰ～Ⅱ期患者25例，Ⅲ～Ⅳ期患者29例，所有患者均為首次發(fā)現(xiàn)的原發(fā)性肺腺癌，術前未經(jīng)抗腫瘤治療。

二、實驗方法

1 細胞培養(yǎng)及分組 PC9細胞采用90% RPMI-1640+10% FBS培養(yǎng)于37℃+5% CO2+100%相對濕度的環(huán)境中。將PC9細胞傳代后分為7組：對照組(Control組)、吉非替尼抵抗組(Gefitinib resistance，GR組)，干擾組(small interference LINC00628，siLINC組)、干擾對照組(siControl組)，空白組(Blank組)、過表達組(miR-145組)及回復組(Rescue組)。GR組采用0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μmol/L吉非替尼逐步誘導PC9細胞GR的形成，每個濃度梯度維持培養(yǎng)2周以上，直至細胞在3.2 μmol/L吉非替尼中維持良好的生長狀態(tài)，90% RPMI-1640+10% FBS繼續(xù)培養(yǎng)48 h；Control組予以同步的二甲基亞砜(DMSO)處理；siLINC組采用Lipofectamine 2000介導LINC00628 小干擾RNA載體轉(zhuǎn)染于GR細胞中；siControl組轉(zhuǎn)染對照表達載體于GR細胞中；Blank組轉(zhuǎn)染空白載體于GR細胞中；miR-145組轉(zhuǎn)染miR-145過表達載體于GR細胞中；Rescue組共轉(zhuǎn)染LINC00628過表達載體及miR-145過表達載體于GR細胞中，均使用1 μg/mL 嘌呤霉素篩選1周。

2 實時熒光定量PCR(qPCR) RNAiso Plus提取組織或細胞總RNA，取1 μg RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，miR-145特異性逆轉(zhuǎn)錄引物序列，各待檢測基因的合成引物序列如下(由上海生工提供)：LINC00628：上游5′-AGAGCGAGCAGGATGAGATAGT-3′、下游5′-GTGAGCAAGGAAGTTGACAGTG-3′；miR-145：上游5′-CAGCATACATGATTCCTTGTA-3′、下游5′-CTTTGGTGTTTGAGATGTTTGG-3′； c-Myc：上游5′-CCTGGTGCTCCATGAGGAGAC-3′、下游5′-CAGACTCTGACCTTTTGCCAGG-3′； AKT1：上游5′-GGACAACCGCCATCCAGACT-3′、下游5′-GCCAGGGACACCTCCATCTC-3′；GAPDH：上游5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′ 、下游5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。10 μL核酸熒光染料體系進行qPCR反應，每組設置3個平行孔，以GAPDH作為內(nèi)參基因，2(-ΔΔCT)法計算LINC00628、miR-145、c-Myc及AKT1 mRNA的表達水平。

3 蛋白質(zhì)印記技術(Western Blot) 收集細胞總蛋白，每組細胞取30 μg總蛋白進行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，穩(wěn)壓100V；轉(zhuǎn)PVDF膜，穩(wěn)流250 mA，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，c-Myc、AKT1及GAPDH抗體1 ∶1 000孵育目的條帶4℃過夜，1 ∶2 000二抗室溫孵育1 h，Bio-rad ChemiDocXRS+化學發(fā)光儀進行曝光顯影。

4 CCK-8實驗 接種各組細胞于96孔細胞培養(yǎng)板，細胞濃度均為1 000個細胞/孔，設置0、0.25、0.5、1、2、4、8、16 μmol/L吉非替尼濃度梯度，每組每個梯度設置5個重復孔，培養(yǎng)48 h后加入CCK-8試劑，避光培養(yǎng)4 h，檢測450 nm處吸光度，計算細胞吉非替尼半抑制濃度(Inhibitory concentration 50%，IC50)。

5 熒光素酶報告基因?qū)嶒?連接LINC00628預測結(jié)合位點區(qū)域序列于psiCHECK2載體，培養(yǎng)293T細胞并分為2組：分別為miR-145 NC組及miR-145 mimics組，通過脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染miR-145 NC及psiCHECK2 LINC00628載體于miR-145 NC組細胞中，共轉(zhuǎn)染miR-145 mimics及psiCHECK2 LINC00628載體于miR-145 mimics組細胞中，轉(zhuǎn)染后48h后加入200 μL裂解液室溫搖轉(zhuǎn)孵育30 min，取10 μL加入96孔板，100 μL預混Luciferase Assay Reagent Ⅱ檢測熒光強度為RLU1，100 μL預混Stop&Glo Reagent檢測熒光強度為RLU2，以RLU1/RLU2作為各組細胞的相對熒光強度。

6 統(tǒng)計學方法 本研究使用SPSS 13.0進行統(tǒng)計學分析，單因素方差分析(One Way ANOVA)及LSD兩兩比較進行組間差異分析，檢驗水準α=0.05。

結(jié) 果

一、肺腺癌臨床組織中LINC00628的表達情況

生物信息分析(數(shù)據(jù)平臺：gepia.cancer-pku.cn/index.html)發(fā)現(xiàn)LINC00628在肺腺癌中高表達(圖1A)，同時高表達LINC00628的肺腺癌患者預后時間顯著縮短(圖1B)，肺腺癌臨床樣本中同樣發(fā)現(xiàn)LINC00628高表達(圖1C)。

二、各組細胞中吉非替尼IC50的比較：CCK-8分析結(jié)果顯示，Control組、GR組、siControl組及siLINC組，吉非替尼IC50分別為0.46±0.07、6.41±0.83、6.08±0.85及3.29±0.46 μmol/L，相比Control組，GR組、siControl組及siLINC組吉非替尼IC50均顯著升高(P<0.05)；相比siControl組，siLINC組吉非替尼IC50顯著降低(P<0.05)(見圖2A)。Blank組、miR-145組及Rescue組IC50分別為6.27±0.69、2.94±0.50及6.33±0.73 μmol/L，miR-145組吉非替尼IC50顯著低于Blank組及Rescue組(P<0.05)(見圖2B)。

三、各組細胞中LINC00628、miR-145、c-Myc及AKT1 mRNA的表達水平

qPCR結(jié)果顯示，相比Control組，GR組LINC00628、c-Myc及AKT1 mRNA表達水平顯著增高，miR-145表達水平顯著降低(P<0.01)；相比siControl組，siLINC組LINC00628、c-Myc及AKT1 mRNA表達水平顯著降低，而miR-145表達水平顯著增高(P<0.01)(見圖3A)；相比miR-145組，Blank及Rescue組miR-145表達顯著降低，c-Myc及AKT1 mRNA表達顯著增高(P<0.01)(見圖3B)。

圖1 肺腺癌臨床組織中LINC00628的表達及其與患者預后的關系

圖2 各組細胞吉非替尼IC50的擬合曲線

圖3 各組細胞LINC00628、miR-145、c-Myc及AKT1 mRNA的表達及比較

四、各組細胞中c-Myc及AKT1蛋白表達水平

Western Blot結(jié)果顯示，相比Control組，GR組c-Myc及AKT1蛋白表達水平顯著增高；相比siControl組，siLINC組c-Myc及AKT1蛋白表達水平顯著降低(見圖4A、B)。相比miR-145組，Blank及Rescue組c-Myc及AKT1蛋白表達顯著增高(見圖4C、D)。

五、LINC00628與miR-145結(jié)合的驗證

生物信息數(shù)據(jù)庫(lncRNABase)預測發(fā)現(xiàn)LINC00628轉(zhuǎn)錄本715-721位點與miR-145堿基互補配對，通過構(gòu)建LINC00628熒光素酶報告基因載體，發(fā)現(xiàn)miR-145 mimics可顯著降低LINC00628-psiCHECK2的熒光信號(見圖5)。

圖4 各組細胞中c-Myc及AKT1蛋白印記

圖5 LINC00628與miR-145結(jié)合位點的預測及驗證

討 論

miR-145的低表達與多種惡性腫瘤的發(fā)生及進展相關，包括卵巢癌、肝細胞癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌及非小細胞肺癌等[3-5, 8-9]，同時，有研究指出，在肺腺癌細胞中過表達miR-145后可使EGFR和NUDT1 mRNA表達顯著下調(diào)，并抑制細胞增殖，另外miR-145在野生型或T790M點突變的EGFR肺癌細胞株中表達顯著低于突變型EGFR細胞株，這提示miR-145的低表達與EGFR-TKI藥物抵抗相關[10]。lncRNA作為機體表觀遺傳的重要執(zhí)行者，通過競爭性結(jié)合miRNA，間接調(diào)控mRNA的表達，目前已發(fā)現(xiàn)LET、ROR、SNHG1、MALAT1等lncRNA參與調(diào)控miR-145，進而在惡性腫瘤中發(fā)揮生物學作用[11-13]，但在肺癌中的相關調(diào)控機制仍有待探索。我們通過lncRNABase數(shù)據(jù)庫在肺腺癌細胞模型中發(fā)現(xiàn)lncRNA LINC00628與miR-145存在可能的結(jié)合作用，同時GEPIA數(shù)據(jù)平臺指出LINC00628在肺腺癌組織中高表達，并與患者預后不良相關，提示其在肺腺癌中的研究價值。

已有研究顯示，LINC00628參與影響乳腺癌、胃癌、肝細胞癌及骨肉瘤細胞的惡性行為，D.Q. Chen等[14]研究顯示，LINC00628在乳腺癌組織中低表達，并與患者預后時間正相關，體外過表達乳腺癌細胞系LINC00628可抑制細胞增殖及轉(zhuǎn)移能力，并促進細胞凋亡，該效應與Caspase-3及Bax蛋白表達增加有關；Zi-Zhen Zhang等[15]發(fā)現(xiàn)LINC00628可促進組蛋白H3第27位賴氨酸上三甲基化(H3K27me3)水平，抑制胃癌細胞體內(nèi)外增殖能力；另外，LINC00628也在肝細胞癌及骨肉瘤組織中低表達，并通過抑制VEGFA及PI3K/Akt通路在其中發(fā)揮抑癌效應[16-17]。這提示LINC00628與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關，但其與肺癌的關系仍不明確。因此，我們對其在肺腺癌中的表達情況及其與患者預后的關系進行了探究，GEPIA數(shù)據(jù)庫及臨床標本中發(fā)現(xiàn)LINC00628在肺腺癌組織中高表達，并觀察到LINC00628的高表達預示患者預后不良?？紤]到LINC00628與miR-145在肺腺癌細胞中存在潛在的相互作用以及miR-145與EGFR-TKI抵抗的密切關系，我們利用EGFR突變的肺腺癌細胞PC9作為體外模型構(gòu)建了吉非替尼抵抗細胞株，發(fā)現(xiàn)GR細胞LINC00628與c-Myc及AKT1表達均上調(diào)，而miR-145表達顯著降低，提示LINC00628可能參與肺腺癌細胞EGFR-TKI抵抗的形成。為了明確這一假設，我們在GR模型中，外源性干擾了LINC00628的表達，發(fā)現(xiàn)細胞miR-145表達升高，且c-Myc及AKT1表達降低，同時細胞吉非替尼敏感性增強，這表明干擾LINC00628可能通過促進miR-145的表達介導GR細胞吉非替尼抵抗的逆轉(zhuǎn)。另外，我們在GR模型中過表達miR-145后發(fā)現(xiàn)c-Myc及AKT1表達降低，與文獻中的結(jié)果趨勢一致[3,5]，且吉非替尼IC50下降，表明miR-145可抑制c-Myc及AKT1表達并促進細胞對吉非替尼敏感，而在共轉(zhuǎn)染LINC00628及miR-145過表達載體后發(fā)現(xiàn)miR-145的效應被LINC00628所拮抗，提示兩者可能存在調(diào)控作用。進一步的熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，LINC00628與miR-145相互存在結(jié)合作用。值得一提的是，LINC00628已被發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌作用[14-17]，但本研究卻揭示了其在肺腺癌中的促癌價值，這可能是由于不同來源的惡性腫瘤中主導腫瘤進展的分子機制不盡相同[18-19]，而LINC00628可能存在包括原癌及抑癌基因在內(nèi)的多種靶基因，導致其促癌作用及抑癌作用并存，而在肺腺癌中，其促癌作用顯著大于抑癌作用，因此產(chǎn)生了與乳腺癌、胃癌、肝細胞癌及骨肉瘤中相反的生物學效應，其確切機制仍有待進一步探究。綜上，我們的研究發(fā)現(xiàn)LINC00628可通過結(jié)合miR-145，影響下游基因c-Myc、AKT1的表達及細胞吉非替尼抵抗能力，是潛在的肺腺癌治療靶點及分子標志物。