傅夏燕，陳其臻，尹 喆，王炎秋

(1.同濟大學(xué)附屬同濟醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，上海 200065；2.同濟大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200092)

人卵母細胞生長在被基底膜包圍的卵泡液中，基底膜和卵泡液中缺乏血管系統(tǒng)[1]。卵泡發(fā)育過程中，卵泡發(fā)育前的竇狀卵泡期氧濃度處于正常水平。伴隨著卵泡由無腔卵泡發(fā)育為有腔卵泡，被卵泡液包裹的卵丘顆粒細胞和卵母細胞周圍的血管系統(tǒng)分布迅速減少，導(dǎo)致卵母細胞供血迅速下降，形成低氧環(huán)境；排卵過程中脈管系統(tǒng)的脫落以及重塑均會降低局部氧濃度。因此卵泡的發(fā)育、成熟、排卵以及隨后的黃體早期均處于局部低氧或缺氧的環(huán)境中[2]，這一過程主要通過缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)實現(xiàn)對氧應(yīng)激的平衡。本文就HIF-1在卵泡發(fā)育、排卵過程中的表達、作用機制以及意義等方面進行綜述。

1 HIF-1的結(jié)構(gòu)及活性調(diào)節(jié)

HIF-1是由α亞基和β亞基組成的異二聚體(圖1)，編碼HIF-1α和HIF-1β的基因分別位于人類第14號染色體21～24區(qū)和第1號染色體的q2l區(qū)。其中HIF-1α(相對分子質(zhì)量120000)作為調(diào)節(jié)亞基，決定了HIF-1的功能，主要表達于細胞核中，含量受外界氧濃度的影響；HIF-1β(相對分子質(zhì)量91000～94000)則穩(wěn)定的表達于細胞核和細胞質(zhì)中，不受外界環(huán)境的影響，主要與穩(wěn)定HIF-1及其二聚化有關(guān)。HIF-1α和HIF-lβ均為基本螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)轉(zhuǎn)錄因子家族成員，并具有Per-ARNT-Sim(PAS)結(jié)構(gòu)域。而HIF-1α除了以上2個結(jié)構(gòu)域之外，還具有氧依賴降解結(jié)構(gòu)域(oxygen dependent degradation domain,ODDD)以及2個轉(zhuǎn)錄活化所需的反式激活結(jié)構(gòu)域(N-TAD,C-TAD)。

HIF-1的穩(wěn)定性受脯氨酰羥化酶結(jié)構(gòu)域(prolyl hydroylase domain,PHD)蛋白的調(diào)節(jié)[3]，見圖1。HIF-1表達與氧分壓密切相關(guān)。在正常氧濃度下，HIF-1α很不穩(wěn)定，通常其半衰期<5min，容易被降解，因此，常氧條件下，HIF-1通常不起轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。在這個過程中，PHD對HIF-1α中的脯氨酸殘基402和564進行氧依賴的羥基化，致使其與腫瘤抑制蛋白VHL結(jié)合，進而通過氧依賴降解結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的泛素蛋白酶體被降解，ARD1乙?；D(zhuǎn)移酶對賴氨酸殘基532的乙酰化也可促進HIF-1α與VHL的結(jié)合。

圖1 HIF-1結(jié)構(gòu)及調(diào)節(jié)過程[4]Fig.1 HIF-1 structure and regulation process[4]

而在相對缺氧條件下，PHD活化受抑制，組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300與CREB結(jié)合蛋白(CREB binding protein,CBP)與未經(jīng)羥基化的HIF-1α結(jié)合，致HIF-1α不能被降解，從而在細胞核內(nèi)大量積聚，與HIF-lβ結(jié)合形成HIF-l，與低氧反應(yīng)元件(hypoxic response element,HRE)結(jié)合后啟動相關(guān)低氧基因的表達。HIF-1的常見靶基因有血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白和糖酵解酶等[5]。在HeLa細胞中，缺氧4h后，HIF-1α的表達在氧濃度為0.5%時達到最大，在1.5%～2%時達到最大值的一半[6]。HIF-1的DNA結(jié)合活性隨氧濃度的降低而呈指數(shù)增加，決定了HIF-1的DNA結(jié)合活性水平[7]。

2 HIF-1與卵泡結(jié)構(gòu)的關(guān)系

2.1 HIF-1與各級卵泡發(fā)育

卵泡的發(fā)育始于胎兒(人類)或新生兒(嚙齒類動物)，此時原始卵泡形成[8]。一旦卵泡啟動生長，激活的原始卵泡，包括卵母細胞及其周圍的一層扁平的顆粒細胞，發(fā)育成初級、次級并最終發(fā)育成有腔卵泡。卵泡發(fā)育和排卵與卵泡分泌功能、完善的血管網(wǎng)絡(luò)發(fā)育密切相關(guān)。在這個過程中，腔前卵泡的發(fā)育依賴于細胞因子及顆粒細胞。當(dāng)發(fā)育為有腔卵泡時，顆粒細胞及血管系統(tǒng)進一步發(fā)育，卵泡腔形成并擴大。

Boonyaprakob等[9]發(fā)現(xiàn)，HIF-1在優(yōu)勢卵泡中的表達水平高于閉鎖前卵泡，且在閉鎖卵泡中幾乎沒有HIF-1 mRNA的表達，提示HIF在卵泡發(fā)育中可能起著重要作用。杜學(xué)海等[10]發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在初級卵泡和次級卵泡內(nèi)表達不顯著，只有當(dāng)卵泡發(fā)育至有腔卵泡時，HIF-1α才開始呈顯著表達，且隨著卵泡腔增大，其表達量呈增加趨勢，推測為卵泡腔增大后卵母細胞血供減少，缺氧的環(huán)境誘導(dǎo)HIF-1表達的增加。Kim等[11]發(fā)現(xiàn)，對超促排卵小鼠使用HIF抑制劑棘霉素，在注射HCG 10h后HIF-1α表達明顯降低，11h 后即卵泡即將破裂時幾乎檢測不到，注射HCG 20h后仍有大量成熟卵泡未破裂。以上研究均提示，HIF-1α為調(diào)節(jié)排卵的關(guān)鍵因子。

2.2 HIF-1與顆粒細胞分化及卵丘發(fā)育

人卵泡液的氧濃度為1.3%～5.5%[12]。顆粒細胞是卵泡內(nèi)的主要細胞類型，具有改變其形態(tài)和功能以適應(yīng)和支持發(fā)育中的卵母細胞的作用。在卵泡發(fā)育過程中，顆粒細胞逐漸分化為圍繞卵泡壁的壁顆粒細胞以及圍繞卵母細胞的卵丘細胞。由于卵母細胞表面缺乏促性腺激素受體，因此卵母細胞生發(fā)泡的破裂依賴于FSH與卵丘顆粒細胞的結(jié)合。氧氣是卵丘-卵母細胞復(fù)合體環(huán)境中的重要組成部分，當(dāng)卵丘細胞的發(fā)育環(huán)境受到干擾時，卵丘細胞的功能和基因表達均會發(fā)生改變。

HIF-1表達于不同發(fā)育及分化階段的顆粒細胞及卵泡中，通過與顆粒細胞表面FSH受體調(diào)控顆粒細胞分泌E2等復(fù)雜相互調(diào)節(jié)作用，而促進不同階段卵泡的發(fā)育。動物實驗表明，伴隨卵泡發(fā)育，顆粒細胞與卵母細胞相輔相成，呈共生關(guān)系[10]。在顆粒細胞的分化過程中，HIF-1表達逐漸增強，與卵母細胞中HIF-1表達一致，具有時間限制性。Kind等[13]的Western印跡法結(jié)果表明，HIF-1α蛋白在低氧暴露的卵丘細胞中穩(wěn)定表達。Tsafriri等[14]將未成熟卵母細胞與卵丘-顆粒細胞分別培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)二者均未生長，而將二者混合培養(yǎng)時，則會與卵泡中的空間結(jié)構(gòu)相似，主動形成縫隙連接，這顯著提高了卵母細胞的成熟率。Shiratsuki等[15]在對牛的顆粒細胞進行體外培養(yǎng)時，分別將其分為低氧組(5%)和高氧組(21%)，在培養(yǎng)24h后，低氧組顆粒細胞HIF-1基因和蛋白表達均高于高氧組。此外，Shiratsuki等[15]還檢測了HIF-1α相關(guān)基因的表達。在低氧條件下培養(yǎng)的GCs中，140個HIF-1調(diào)控基因中有39.23%的表達顯著增加，而7.25%的基因表達降低。Zhang等[16]的免疫組織化學(xué)和Western印跡法分析結(jié)果顯示，HIF-1α在顆粒細胞中有特異性表達，其可能是通過調(diào)節(jié)增殖細胞核抗原的表達來促進卵泡發(fā)育。以上研究結(jié)果均表明，HIF-1α可能通過調(diào)節(jié)卵巢顆粒細胞增殖與分化來參與卵泡發(fā)育。

3 HIF-1誘導(dǎo)卵泡發(fā)育的作用機制

3.1 PI3K/AKT-mTOR通路

在細胞增殖過程中，蛋白激酶B(protein kinase,AKT)和哺乳動物雷帕霉素靶點(manmanlian target of rapamycin,mTOR)信號級聯(lián)是有力的調(diào)節(jié)因子[17]。AKT通過結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合物2(turberous sclerosis complex,TSC2)的磷酸化上調(diào)mTOR復(fù)合物1(mTORC1)的活性[18]。mTORC1激酶活性通過磷酸化靶蛋白如p70S6激酶(P70S6K)和真核細胞翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1(4E-BP1)來刺激蛋白質(zhì)合成和細胞生長。AKT還強烈誘導(dǎo)細胞中的糖酵解酶活性[19]，提示AKT-mTOR和糖酵解活性增高可能有助于GCs在低氧條件下的細胞增殖。Zhang等[20]的研究表明，PI3K/mTOR通路的激活增加了牛黃體細胞中HIF-1α的穩(wěn)定性和VEGF的表達。Shiratsuki等[15]認為缺氧誘導(dǎo)的HIF-1激活通過VEGF增強AKT-mTOR信號，從而激活顆粒細胞增殖。也有研究報道，缺氧通過PI3K激活A(yù)KT來調(diào)節(jié)細胞增殖，而PI3K是通過胰島素樣生長因子和促性腺激素刺激牛顆粒細胞激活的[21]，具體機制見圖2。

3.2 FSH/VEGF對HIF-1的調(diào)節(jié)

FSH通過G蛋白偶聯(lián)的FSH受體發(fā)揮作用，為卵泡成熟提供主要刺激，使卵泡從腔前狀態(tài)成熟到排卵前狀態(tài)[22-24]。FSH與其受體結(jié)合導(dǎo)致cAMP水平升高。當(dāng)cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白p300被募集到其C末端時，誘導(dǎo)HIF-1表達。此過程不僅需要PI3K/AKT介導(dǎo)的哺乳動物雷帕霉素靶標的激活[25]，同時需要Forkhead轉(zhuǎn)錄因子[26]和MDM2的磷酸化。HIF-1與靶基因(如促紅細胞生成素、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白、各種糖酵解酶、VEGF受體flt-1和VEGF)在低氧濃度下與共同的缺氧反應(yīng)元件(core-ACGTG-)結(jié)合，從而激活其活性,而這一過程也可通過激活PD98059敏感的蛋白(激酶)活性直接實現(xiàn)[27]，具體機制見圖2。

圖2 HIF-1參與卵泡發(fā)育機制圖Fig.2 The mechanism of HIF-1 involvement in follicular development

Zhou等[28]的研究表明，體內(nèi)、外注射卵泡刺激素均可明顯增加HIF-1α的表達。原始卵泡及早期腔前卵泡均無獨立的血管系統(tǒng)，而是依賴周圍基質(zhì)中的血管。伴隨著卵泡的發(fā)育，竇狀卵泡逐漸形成個性化的血管供應(yīng)，而這一過程主要受VEGF調(diào)節(jié)。Fisher等[29]的研究表明，生長中的卵泡(慢生長組和快生長組)產(chǎn)生大量的VEGF，特別是在卵泡腔形成后，而無生長卵泡則未檢測到VEGF。

3.3 其它激素對HIF-1的調(diào)節(jié)

HIF-1的表達同時受到其他激素的調(diào)節(jié)[30]。研究表明，hCG為卵巢HIF-1蛋白豐度的重要調(diào)節(jié)因子[1]。在低氧狀態(tài)下，用hCG刺激卵泡，結(jié)果表明，HIF-1蛋白水平明顯增加。當(dāng)Hep3B細胞在低氧條件下培養(yǎng)時，轉(zhuǎn)化生長因子-1也能刺激HIF-1水平升高，誘導(dǎo)VEGF mRNA豐度增加[31]。雖然缺氧被認為是細胞內(nèi)HIF-1反應(yīng)的主要誘因，但其他刺激，如炎癥細胞因子、生長因子同樣可能誘導(dǎo)常氧細胞中HIF-1及其靶基因的表達[32-35]。

4 HIF-1在臨床診斷和治療中的應(yīng)用

目前對HIF-1的研究集中在基礎(chǔ)研究方面，在臨床應(yīng)用方面，研究主要涉及腫瘤診治中的應(yīng)用[36]，與卵泡發(fā)育障礙的相關(guān)性報道較少。

4.1 HIF-1表達與卵巢儲備功能

劉春喜等[37]的研究發(fā)現(xiàn)，多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)患者血清中HIF-1α表達上調(diào)，卵巢儲備功能下降者則呈低表達，故認為，HIF-1α的表達水平可以用于卵巢儲備功能的預(yù)測，其作用機制尚不清楚，推測其與促性腺激素、雌激素、低氧環(huán)境之間的復(fù)雜相互調(diào)節(jié)機制相關(guān)[2]。

4.2 HIF-1與卵巢早衰

在小鼠生理性卵巢早衰模型中，隨著超促排卵及臭氧吸入，卵巢儲備功能下降，竇狀卵泡缺氧程度加重，而引起氧化應(yīng)激及HIF-1α增高。故推測，HIF-1α的表達量可作為預(yù)測卵巢早衰的指標之一[38]，HIF-1α可能通過調(diào)節(jié)卵泡中血管發(fā)育而參與卵泡發(fā)育過程。

4.3 HIF-1與超促排卵

近年來，越來越多的證據(jù)表明，缺氧與超促排卵所獲卵子的質(zhì)量關(guān)系密切。在動物實驗中，HIF-1α表達量與卵子質(zhì)量呈反比[38]。應(yīng)用FSH對小鼠進行超促排卵時，由于多個卵泡發(fā)育致單個卵泡周圍血流量減少，局部氧濃度降低，使HIF-1α大量積聚，影響卵子的減數(shù)分裂，從而導(dǎo)致卵母細胞非整倍體發(fā)生率升高，降低了卵子質(zhì)量[39-40]。London等[41]用克羅米芬對小鼠進行促排卵時，也發(fā)現(xiàn)了卵母細胞非整倍體概率升高。Gao等[42]對67名IVF助孕患者的研究結(jié)果顯示，血清及卵泡液中的VEGF水平與卵母細胞質(zhì)量呈負相關(guān)，其原因可能是促排卵過程中卵泡供氧不足，導(dǎo)致HIF-1表達增加，VEGF代償性升高，使缺氧卵泡對促性腺激素反應(yīng)性減弱，造成卵母細胞成熟受阻[43]。據(jù)上，HIF-1α表達量可作為促排治療中，卵母細胞質(zhì)量的評價指標之一。

4.4 HIF-1在卵泡發(fā)育障礙治療中的應(yīng)用

張鴻升等[44]對脊髓損傷大鼠進行電針干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，HIF-1α及VEGF表達均上調(diào)，表明其在神經(jīng)損傷再生修復(fù)中可能起著重要作用。雷公藤多苷致卵泡發(fā)育障礙大鼠模型中，促凋亡因子FOXO3a表達升高，而HIF-α、IGF-1R表達則下降，補腎活血中藥復(fù)方新加歸腎丸可能通過上調(diào)HIF-1α的表達，下調(diào)FOXO3a的表達，從而抑制卵泡過度閉鎖，促進卵泡正常生長發(fā)育[45]。有望通過檢測卵泡發(fā)育過程中HIF-1的變化，預(yù)測卵巢功能障礙性疾病，從而施行中西藥結(jié)合的干預(yù)治療。

5 展 望

HIF-1參與各級卵泡的發(fā)育及排卵過程，然而卵泡發(fā)育的過程為多因素參與的復(fù)雜生理過程，卵巢內(nèi)的激素變化如何調(diào)節(jié)低氧分子機制以及二者如何發(fā)揮相互作用，尤其是臨床應(yīng)用方面仍待進一步研究。解決以上問題，有助于全面理解卵泡發(fā)育、排卵過程及相關(guān)的病理生理過程，從而為HIF-1的臨床應(yīng)用提供堅實的理論基礎(chǔ)。