柯福彬，Anil Kumar Yadav，謝曉恬，喬曉紅

(同濟大學附屬同濟醫(yī)院兒科，上海 200065)

獲得性再生障礙性貧血(aplastic anemia,AA，簡稱再障)由多種病因引起的機體造血功能障礙，以骨髓造血干細胞數(shù)量減少、骨髓造血組織脂肪化和外周血全血細胞減少為特征的血液系統(tǒng)疾病。其發(fā)病機制目前尚未十分清楚，近年來多數(shù)學者認為獲得性AA的主要發(fā)病機制為機體中T細胞免疫異常活化導致骨髓造血功能衰竭，可能原因與機體T淋巴細胞功能異常激活，產(chǎn)生抑制性造血細胞因子如IL-2、IFN-γ等抑制骨髓造血干細胞的增殖分化[1]。人體T細胞亞群如TH1，TH2，Treg等分泌各種細胞因子，IL-2、IFN-γ、IL-4等調(diào)節(jié)機體免疫平衡，抑制性的細胞因子表達增加可抑制機體的造血功能。

目前國內(nèi)外學者較為關注調(diào)節(jié)TH1、TH2細胞平衡的轉(zhuǎn)錄因子T-bet及GATA3。Solomou等[2]研究發(fā)現(xiàn)在獲得性AA患兒外周T淋巴細胞中T-bet表達上調(diào)。而在獲得性AA患兒骨髓T-bet，GATA3的表達尚未見相關報道。本研究檢測獲得性AA患兒骨髓組織中促使Th細胞分化為TH1、TH2細胞的調(diào)節(jié)因子T-bet，GATA3蛋白的表達變化，同時分析其外周血細胞因子水平，進一步闡明獲得性AA的免疫病理機制，為獲得性AA科學研究以及臨床醫(yī)師治療獲得性AA決策提供客觀依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集同濟大學附屬同濟醫(yī)院兒科2005年8月—2018年8月保存完整的獲得性AA患兒骨髓活檢石蠟標本49例，該標本均為既往滿足臨床診斷后剩余的科學保存的石蠟標本。獲得性AA患兒診斷與臨床分型參考中華醫(yī)學會的診療建議[3]，臨床表現(xiàn)為外周血細胞減少，骨髓涂片和活檢等顯示造血功能降低，且除外低增生性白血病和骨髓異常增生綜合征等其他可導致外周血三系下降的疾病。重型為中性粒細胞<0.5×109/L、網(wǎng)織紅細胞<20×109/L、血小板<20×109/L，上述3項中滿足2項；若中性粒細胞<0.2×109/L則為極重型。非重型組25例，重型和極重型組24例。男性患兒27例，女性患兒22例，中位年齡8歲(4～10歲)。本研究獲得上海市同濟醫(yī)院倫理委員會批準(KYSB-2015-35)。

1.2 主要試劑

T-bet單克隆抗體與GATA3單克隆抗體由美國ABCAM公司生產(chǎn)，組化試劑盒DAB顯色劑由丹麥DAKO公司生產(chǎn)。

1.3 免疫組織化學染色

(1) 石蠟切片脫蠟至水；(2) 抗原修復；(3) 阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；(4) 血清封閉；(5) 加入一抗:在切片上滴加PBS按一定比例(預實驗約為1∶200)配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)，4℃孵育過夜；(6) 加入二抗:圈內(nèi)滴加二抗(HRP標記)覆蓋組織，室溫孵育；(7) DAB顯色:玻片置于PBS(pH=7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加新鮮配制的DAB顯色液；(8) 復染細胞核:Harris蘇木精復染，鹽酸乙醇分化，自來水沖洗，氨水返藍；(9) 脫水封片；(10) 切片掃描錄入，圖像采集分析。

1.4 平均光密度值(average optical density,AOD)測定

切片使用數(shù)字切片全景掃描儀器進行掃描錄入，隨機選取切片全景圖3處，進行放大400倍后采集圖像，T-bet，GATA3陽性表達圖片顯示為棕黃色。使用圖像分析軟件IPP6.0對所采集圖像進行平均光密度AOD值的測定，AOD值與T-bet，GATA3表達正相關，3次測定結(jié)果取平均值。

1.5 患兒外周血細胞因子水平測定

采取無發(fā)熱的獲得性AA患兒清晨空腹外周血，離心(離心半徑12.5cm，3000r/min，10min)，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定IL-2、IL-4、IFN-γ水平，測定時嚴格按照試劑盒說明書操作，試劑盒由上海瓦蘭生物有限公司提供。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組獲得性AA患兒基線情況

兩組患兒年齡、性別、外周血白細胞、中性粒細胞、血紅蛋白、紅細胞、網(wǎng)織紅細胞、血小板情況如表1所示。

表1 兩組獲得性AA患兒基線情況與單因素分析Tab.1 Baseline and univariate analysis of two groups of children with aplastic anemia

2.2 兩組患兒骨髓病理表現(xiàn)

相較與非重型獲得性AA患兒，在重型獲得性AA患兒骨髓的H-E染色中造血細胞下降更明顯，脂肪組織等非造血組織形成空泡更多，見圖1。

圖1 不同程度獲得性AA患兒骨髓H-E染色(×200)Fig.1 H-E staining of bone marrow in children with different degrees of acquired aplastic anemia(×200)A:非重型獲得性AA患兒骨髓H-E染色；B:重型獲得性AA患兒骨髓H-E染色

2.3 T-bet、GATA3蛋白在獲得性AA患兒骨髓表達

T-bet蛋白在獲得性AA患兒骨髓中多呈棕黃色陽性表達，T-bet在重型與極重型組較非重型組陽性表達顯著增多，見圖2A、B。GATA3在兩組獲得性AA患兒未見明顯陽性表達，見圖2C、D和表2。

表2 獲得性AA患兒骨髓T-bet、GATA3蛋白表達比較Tab.2 Comparison of T-bet and GATA3 protein expression in bone marrow of children with aplastic anemia

圖2 T-bet、GATA3蛋白在不同程度獲得性AA患兒骨髓表達Fig.2 Expression of T-bet and GATA3 protein in bone marrow of children with different degrees of acquired aplastic anemiaA:非重型獲得性AA患兒骨髓T-bet表達(×400)；B:重型獲得性AA患兒骨髓T-bet表達(×400)；C:非重型獲得性AA患兒骨髓GATA3表達(×400)；D:重型獲得性AA患兒骨髓GATA3表達(×400)

2.4 兩組獲得性AA患兒治療前外周血細胞因子水平比較

不同程度病情獲得性AA患兒IL-2，IL-4，IFN-γ表達比較，IL-2及IFN-γ在重型與極重型組顯著高于非重型組(P=0.000，P=0.007)，IL-4兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.289)，見表3。

表3 兩組獲得性AA患兒治療前細胞因子水平比較Tab.3 Comparison of cytokine levels between two groups of children with AA before treatment

3 討 論

我國屬于獲得性AA高發(fā)地區(qū)，年發(fā)病率為7.4/100萬[4-5]。獲得性AA的自然病程長、治療周期長，預計我國兒童獲得性AA的現(xiàn)患率并不低于白血病，且多為重型獲得性AA[6]。獲得性AA嚴重威脅我國兒童的生命健康，重型獲得性AA常因外周血下降導致嚴重感染或顱內(nèi)出血而引起死亡。應用免疫抑制治療獲得性AA可使部分患兒病情緩解，免疫抑制治療的有效性也進一步提示獲得性AA的發(fā)病機制主要為機體免疫異常所致。

獲得性AA涉及免疫紊亂可能為人體T淋巴細胞的異常激活，導致人體骨髓造血微環(huán)境的紊亂，進而影響造血干細胞增殖與分化[6-7]。獲得性AA主要發(fā)病機制涉及Th1/Th2細胞比例失衡。Th1及Th2細胞分化階段受不同抗原-抗原受體、共刺激信號分子等多種因素共同作用，而T-bet、GATA3蛋白在T細胞亞群分化過程中具有重要的調(diào)節(jié)功能[8-9]。

T-bet蛋白是Th1分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子，T-bet功能結(jié)構(gòu)域有與IFN-γ等造血抑制性細胞因子結(jié)合的能力。機體的T-bet不僅表達在Th1細胞，IFN-γ誘導下也可使NK細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞等表達[10]。Solomou等[2]發(fā)現(xiàn)獲得性AA患兒Itk激酶表達水平增加可刺激機體T-bet表達上調(diào)，進而促使IFN-γ基因的主動轉(zhuǎn)錄。IFN-γ等抑制性細胞因子通過Fas通路、半胱天冬酶和相關促凋亡基因的上調(diào)降低造血基因的表達，上調(diào)IFN-γ基因增強小鼠凋亡基因表達及活化細胞毒性T細胞，增加造血干細胞和祖細胞破壞[11-12]。既往研究顯示可通過免疫調(diào)節(jié)劑OCH調(diào)節(jié)NKT細胞改善免疫機制介導骨髓衰竭模型小鼠Th1/Th2的失衡，促使Th1細胞向Th2細胞分化而改善骨髓衰竭，同時檢測到骨髓中T-bet表達的改變[13]。

與T-bet相對的GATA3是GATA家族成員中的一種鋅指蛋白[14]。在外界環(huán)境刺激或外源性IL-4等誘導分化體系中能通過STAT通路促使Th細胞向著Th2方向分化且檢測到Th細胞胞內(nèi)GATA3的mRNA表達水平明顯增加[15]。Ouyang等[16]發(fā)現(xiàn)利用反轉(zhuǎn)錄病毒將GATA3的DNA轉(zhuǎn)入Th細胞，Th細胞可在不受外界誘導環(huán)境下分化為Th2細胞，甚至將GATA3轉(zhuǎn)入已經(jīng)進行早期Th1誘導環(huán)境中的T細胞后，可促使Th1細胞分化被逆轉(zhuǎn)為Th2細胞且分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-13等由Th2細胞分泌的相關免疫因子。近年來促炎細胞因子受到廣泛關注，如羅斌等[17]分析促炎因子IL-6與患者臨床結(jié)局之間的關系，發(fā)現(xiàn)IL-6有效地判斷患兒的疾病危重程度及預測患兒的臨床結(jié)局。本研究中顯示Th1細胞相關的細胞因子IL-2與IFN-γ在重型和極重型再障組明顯高于非重型再障組，說明T-bet相關的Th1的異?；罨讷@得性AA的發(fā)病中可能起著一定作用。

國內(nèi)有研究通過流式細胞術與RT-PCR檢測獲得性AA與正常人外周血Th1、Th2、外周單個核細胞轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA-3 mRNA基因表達，與正常人群相比，重型再障組T-bet明顯升高，GATA3相比正常對照顯著降低[18]。檢測獲得性AA患兒骨髓T-bet和GATA3的表達水平或可更直接反映骨髓Th1、Th2細胞分化水平，進一步揭示再障疾病的免疫病理機制。本研究顯示重型與極重型再障患兒T-bet蛋白表達較輕型表達顯著高，T-bet可能加重獲得性AA患兒骨髓細胞Th1/Th2失衡而加重獲得性AA的發(fā)生。本研究未檢測到GATA3蛋白在不同程度獲得性AA患兒骨髓病理切片表達差異，僅檢測出T-bet的差異，提示T-bet在判斷獲得性AA病情輕重方面優(yōu)于GATA3蛋白表達。目前獲得性AA疾病嚴重程度臨床診斷主要依靠于外周血常規(guī)，由于外周血常規(guī)計數(shù)受到輸血制品及感染等情況的影響，臨床指標并不一定能及時有效提示疾病嚴重程度，但機體骨髓在一定時間保持穩(wěn)定狀態(tài)，T-bet的表達高低一定程度上或可反映了機體免疫損傷的程度。兒童獲得性AA病因復雜，通過T-bet蛋白的檢測或可識別出免疫損傷因素導致的再障，排除先天性骨髓衰竭，以選擇免疫抑制治療，避免先天性骨髓衰竭患兒盲目使用免疫抑制治療，錯過了移植治療的最佳時機。

本研究涉及的骨髓活檢標本部分存放時間偏長，可能對實驗結(jié)果有一定影響；進一步研究還需要與先天性骨髓衰竭或其他疾病進行對比研究；該疾病為罕見病，需多中心進一步擴大臨床樣本進行分析；或結(jié)合患兒的預后情況進行相關分析，為獲得性AA患兒的精準治療方案的選擇提供一定的實驗室依據(jù)。