許 玉，程忠平

(1.上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200011；2.同濟大學附屬第十人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200072)

宮頸癌是女性中第4位常見癌癥和癌癥死亡原因。化療是宮頸癌治療重要的組成部分?；陧樸K的方案一直是宮頸癌化療首選，但是部分患者對鉑類耐藥。因此，對宮頸癌患者進行化療藥物敏感性檢測，對于個體化治療具有重要的指導(dǎo)意義。其中，三磷酸腺苷-生物熒光腫瘤體外藥物敏感性檢測技術(shù)(ATP-TCA)具有靈敏度高、精確度高、重復(fù)性好等優(yōu)勢[1]。此外，采用新型3D細胞培養(yǎng)類器官模型，能夠接近或重現(xiàn)腫瘤真實的病理生理特征[2]，較準確地評估腫瘤對化療藥物的敏感性。但是宮頸癌藥物敏感性檢測尚未普及，需要有效的化療藥物敏感性預(yù)測手段進行補充。國內(nèi)外研究表明，免疫組化指標癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、細胞角蛋白5/6(cytokeratin 5/6,CK5/6)、細胞角蛋白7(cytokeratin 7,CK7)、細胞增殖相關(guān)抗原Ki-67、腫瘤蛋白16(tumer protein 16,p16)、腫瘤蛋白53(tumer protein 53,p53)、腫瘤蛋白63(tumer protein 63,p63)，與腫瘤對鉑類藥物的敏感性之間存在一定的相關(guān)性[3-9]。因此，本研究基于類器官模型，旨在通過以上免疫組化指標，對宮頸癌鉑類化療藥物敏感性進行分析與探索。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究對象為2018年3月—2020年1月同濟大學附屬第十人民醫(yī)院婦產(chǎn)科住院的宮頸癌患者共24例，術(shù)前病理診斷明確，肉眼病灶直徑≥1.5cm，征得患者和家屬同意行腫瘤化療藥物敏感性檢測。研究經(jīng)同濟大學附屬第十人民醫(yī)院倫理委員會批準(SHSY-IEC-4.1/20-128/01)。無菌操作下自術(shù)中剛離體的腫瘤中切取標本，4℃冷藏轉(zhuǎn)運至實驗室，其余標本送病理科行免疫組織化學檢測?；颊吣挲g31～81歲，平均(57.9±12.0)歲；按2018國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics,FIGO)宮頸癌分期:Ⅰ期7例、Ⅱ期12例、Ⅲ期3例、Ⅳ期2例；病理診斷為鱗癌21例，腺癌3例，其中低分化9例，低-中分化8例，中分化5例，中-高分化1例；原發(fā)性癌22例，復(fù)發(fā)性癌2例；術(shù)前有放療史1例，術(shù)前有順鉑化療史5例。

化療藥物順鉑、卡鉑、奈達鉑、吉西他濱、紫杉醇、多西他賽化療藥物均購自美國Selleck公司。75%乙醇為國產(chǎn)，Hank’s平衡鹽溶液(Hank’s balanced salt solution,HBSS)購自美國Cellgro公司。Ⅳ型膠原酶、1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清、三抗(青霉素、鏈霉素、抗真菌抗生素)、雙抗(青霉素、鏈霉素)為美國賽默飛世爾公司GIBCO品牌。氯化鈣溶液、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)購自美國Sigma公司。淋巴細胞分離液購自加拿大Cedarlane公司，無血清培養(yǎng)基購自瑞士LONZA公司。CellTiter-Glo熒光細胞活性檢測試劑購自美國Promega公司。

1.2 宮頸癌3D細胞化療藥物敏感性檢測方法

(1) 制備細胞懸液:將腫瘤組織用75%乙醇快速浸泡，用含三抗的HBSS沖洗。將組織切成1～3mm3小塊，加入Ⅳ型膠原酶混合溶液，37℃消化1～2h，每20min吹打混勻1次。當組織塊出現(xiàn)絮狀且細胞數(shù)目較多時，用含有雙抗的完全1640培養(yǎng)液終止消化。通過70μm細胞濾膜收集細胞懸液，離心后加入無血清培養(yǎng)基重懸。

(2) 藥物處理及3D細胞培養(yǎng):取出-20℃保存的400倍最高濃度化療藥物，自然解凍并混勻。使用無血清培養(yǎng)基稀釋藥物至10倍濃度，再依次對半稀釋，制備200%、100%、50%、25%、12.5%、6.25%標準濃度的藥物。100%標準濃度為化療藥物的血漿峰值濃度(peak plasma concentration,PPC)。根據(jù)相關(guān)文獻[10-11]各藥物的PPC為:順鉑6.3μg/mL、卡鉑25μg/mL、奈達鉑5.3μg/mL、紫杉醇13.8μg/mL、多西他賽10μg/mL、吉西他濱25μg/mL。96孔低吸附板每孔分別加入15μL不同濃度藥物，從上至下濃度依次遞減，不同種類藥物孔橫向并列排列。左側(cè)設(shè)置一列對照孔(M1)，每孔加入15μL無血清培養(yǎng)基，右側(cè)設(shè)置另一列對照孔(M0)，分別加入15μL濃度遞減的DMSO。每孔加入135μL細胞懸液，細胞密度約為104個/孔，其中對照孔M1只加入135μL無血清培養(yǎng)基。37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6d。

(3) ATP-TCA檢測:每孔加入50μL CellTiter-Glo試劑，振蕩5min，室溫孵育30min。每孔取80μL 溶液轉(zhuǎn)入不透明96孔板，放入GloMax發(fā)光檢測儀檢測熒光發(fā)光值。

(4) 評價宮頸癌3D細胞對化療藥物的敏感性:計算化療藥物每個濃度對宮頸癌3D多細胞腫瘤球的抑制率(inhibition rate,IR)。

(X為藥物孔發(fā)光值，M1為無細胞孔發(fā)光值，M0為DMSO孔發(fā)光值平均值)

以藥物濃度為自變量、抑制率為因變量繪制藥物抑制曲線，采用Origin 8.5軟件進行非線性擬合，函數(shù)模型選擇Logistic。Origin根據(jù)藥物抑制曲線計算出IC50和IC90。

化療藥物敏感性評價標準[12]:IC90≤100%測試藥物濃度(test drug concentration,TDC)和IC50≤25%TDC，強敏感；IC90>100%TDC和IC50≤25%TDC，中度敏感；IC90≤100%TDC和IC50>25%TDC，弱敏感；IC90>100%TDC和IC50>25%TDC，耐藥；敏感組包括強敏感和中度敏感，不敏感組包括弱敏感和耐藥。(100%TDC即藥物PPC)

1.3 免疫組織化學檢測

宮頸癌標本送病理科行免疫組織化學檢測，檢測CEA、CK5/6、CK7、Ki-67、p16、p53、p63及其他分子標志物。對免疫組化指標表達水平進行分級：對于CEA、CK5/6、CK7、p16、p53、p63，陽性、強陽性為高表達。部分陽性、少量陽性、弱陽性和陰性為低表達；Ki-67≥60%為高表達，Ki-67<60%為低表達。

1.4 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用SPSS.21統(tǒng)計軟件進行Spearman等級相關(guān)分析。r>0表示變量之間呈正相關(guān)，r<0表示呈負相關(guān)。|r|為0.0～0.2，極弱相關(guān)或無相關(guān)；|r|為0.2～0.4，弱相關(guān)；|r|為0.4～0.6，中等程度相關(guān)；|r|為0.6～0.8，強相關(guān)；|r|為0.8～1.0，極強相關(guān)。P<0.05表示在α=0.05的檢驗水準下相關(guān)系數(shù)r具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 宮頸癌3D細胞化療藥物敏感性檢測結(jié)果

宮頸癌細胞培養(yǎng)3～6d，取孔內(nèi)容物于生物倒置顯微鏡下觀察，可見多個3D多細胞腫瘤球。圖1為22號患者體外培養(yǎng)的宮頸癌3D細胞形態(tài)。

圖1 22號患者體外培養(yǎng)的宮頸癌3D細胞形態(tài)(×100)Fig.1 Morphology of cervical cancer 3D cell cultured in vitro from patient 22(×100)培養(yǎng)第3d；A:100%標準濃度紫杉醇+順鉑處理；B:100%標準濃度紫杉醇+卡鉑處理；C:100%標準濃度吉西他濱處理；D:100%標準濃度MDSO對照組

各種化療藥物對宮頸癌3D細胞的抑制曲線基本符合藥物作用規(guī)律，當藥物濃度增加時，抑制率以劑量依賴性方式增加。部分患者的宮頸癌3D細胞抑制曲線見圖2。

圖2 化療藥物對宮頸癌患者3D細胞的抑制曲線Fig.2 Inhibition curves of chemotherapy drugs on 3D cells of cervical cancer patientsA：16號患者；B：24號患者

宮頸癌3D細胞對化療藥物的敏感性程度。藥物敏感性結(jié)果見表1。

表1 宮頸癌3D細胞對化療藥物的敏感性Tab.1 Sensitivity of cervical cancer 3D cells to chemotherapy drugs

2.2 免疫組化結(jié)果

宮頸癌病理標本免疫組化指標CEA、CK5/6、CK7、Ki-67、p16、p53、p63表達見表2。Ki-67、p63、CEA高表達和低表達宮頸癌標本染色照片見圖3。

表2 宮頸癌標本免疫組化指標的表達Tab.2 Expression of immunohistochemical indices in cervical cancer specimens

圖3 Ki-67、p63、CEA高表達和低表達宮頸癌標本的免疫組化染色照片(×100)Fig.3 Stained photographs of cervical cancer specimens with high and low expression of Ki-67,p63,CEA(×100)

2.3 免疫組化指標與化療藥物敏感性的相關(guān)性分析

將宮頸癌病理標本的免疫組化指標CEA、CK5/6、CK7、Ki-67、p16、p53、p63表達水平，與宮頸癌3D細胞對化療藥物的敏感性程度分別進行雙向Spearman等級相關(guān)分析，結(jié)果見表3。Ki-67表達水平與宮頸癌3D細胞對紫杉醇+順鉑的敏感性呈正相關(guān)(r=0.485，P<0.05)，相關(guān)程度中等。p63表達水平與宮頸癌3D細胞對紫杉醇+卡鉑的敏感性呈負相關(guān)(r=-0.540，P<0.05)，相關(guān)程度中等。CEA表達水平與宮頸癌3D細胞對吉西他濱的敏感性呈負相關(guān)(r=-0.541，P<0.05)，相關(guān)程度中等。Ki-67、p63表達與順鉑或卡鉑單藥的敏感性未得到相關(guān)性結(jié)果，可能的原因是樣本數(shù)量過小(5例)。本研究中，CK5/6、CK7、p16、p53的表達與宮頸癌3D細胞對紫杉醇+順鉑、紫杉醇+卡鉑、奈達鉑、吉西他濱的敏感性均無相關(guān)性。

表3 宮頸癌免疫組化指標與化療藥物敏感性的相關(guān)性分析結(jié)果Tab.3 Correlation analysis between immunohistochemistry indices and chemosensitivity of cervical cancer

續(xù)表

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，采用ATP-TCA對多種腫瘤進行體外化療藥物敏感性檢測，其結(jié)果與臨床療效具有良好的相關(guān)性[13-15]。采用類器官模型可進一步提高檢測結(jié)果的預(yù)測度。3D多細胞腫瘤球是一種簡單的類器官，其核心因缺氧而壞死、外圍層較高的增殖率、內(nèi)部細胞外基質(zhì)的沉積、基因表達和表型，都與體內(nèi)腫瘤中觀察的現(xiàn)象非常相似[16]。本試驗運用液體覆蓋技術(shù)培養(yǎng)3D多細胞腫瘤球，聯(lián)合ATP-TCA，藥物敏感性結(jié)果接近于宮頸癌患者體內(nèi)腫瘤對化療藥物的反應(yīng)。

本試驗中，宮頸癌3D細胞對化療藥物表現(xiàn)為強敏感比例極少，中度敏感比例不高，不敏感比例較大，可推測宮頸癌3D細胞具有抵抗藥物毒性的機制。試驗檢測宮頸癌3D細胞對紫杉醇+順鉑的敏感率為65%，與Lorusso等[17]薈萃分析結(jié)果相符(基于順鉑的方案對晚期和復(fù)發(fā)性宮頸癌的緩解率為29.1%～67%)。試驗檢測宮頸癌3D細胞對吉西他濱的敏感率為38%，高于對紫杉醇+卡鉑的敏感率(6%)，顯示出吉西他濱對鉑類耐藥宮頸癌的治療潛力。有待更大規(guī)模試驗對以上結(jié)果進行驗證。

臨床上很多宮頸癌患者未進行腫瘤藥物敏感性檢測，本研究旨在探索免疫組化指標能否預(yù)測宮頸癌對鉑類化療藥物的敏感性。Ki-67是一種反映細胞增殖的核DNA結(jié)合蛋白，研究發(fā)現(xiàn)Ki-67高表達的晚期宮頸癌患者對順鉑化療反應(yīng)更好、生存率更高[18]。p63是p53抑癌基因家族成員，Zhou等[9]發(fā)現(xiàn)p63的表達產(chǎn)物可提高宮頸鱗癌細胞對順鉑化療的敏感性。癌胚抗原CEA是一種廣譜腫瘤標志物，Abbas等[3]發(fā)現(xiàn)高水平CEA與胃癌患者對順鉑聯(lián)合抗血管生成化療效果欠佳相關(guān)。

相關(guān)性分析顯示，基于3D細胞類器官模型，免疫組化指標Ki-67表達水平與宮頸癌對紫杉醇+順鉑的敏感性呈正相關(guān)，p63表達水平與宮頸癌對紫杉醇+卡鉑的敏感性呈負相關(guān)，CEA表達水平與宮頸癌對吉西他濱的敏感性呈負相關(guān)。因此，可通過Ki-67、p63、CEA表達水平初步預(yù)測宮頸癌患者對紫杉醇+順鉑、紫杉醇+卡鉑和吉西他濱化療的敏感性。Ki-67高表達(≥60%)預(yù)測宮頸癌患者可能對紫杉醇+順鉑化療敏感性高，Ki-67低表達(<60%)預(yù)測患者可能對紫杉醇+順鉑化療敏感性低。p63高表達(陽性或強陽性)預(yù)測宮頸癌患者可能對紫杉醇+卡鉑化療敏感性低，而p63低表達(陰性或少量表達)預(yù)測患者可能對紫杉醇+卡鉑化療敏感性高。CEA高表達預(yù)測宮頸癌患者對吉西他濱化療敏感。當然，還需要擴大樣本例數(shù)并進行臨床前瞻性研究，以評估這種預(yù)測方法的準確性。

此外，本研究結(jié)果為宮頸癌化療藥物機制的研究提供了一些證據(jù)和線索。Ki-67高表達宮頸癌對紫杉醇+順鉑的敏感性較高，反映Ki-67可能參與紫杉醇+順鉑對宮頸癌細胞的抗癌機制。p63高表達宮頸癌對紫杉醇+卡鉑的敏感性較低，反映p63或相關(guān)分子可能誘導(dǎo)宮頸癌細胞對紫杉醇+卡鉑耐藥。CEA可能通過某種途徑調(diào)節(jié)吉西他濱對宮頸癌的藥理作用。Ki-67、p63和CEA等腫瘤相關(guān)蛋白涉及復(fù)雜的調(diào)控途徑，受到微小核糖核酸(microribonucleic acid,miRNA)等非編碼RNA調(diào)節(jié)[19]，在宮頸癌化療中參與的信號通路有待進一步試驗探索。