毛 睿，徐晶瑩，呂立夏，崔婷婷，劉彩瑩，徐國彤

(同濟大學醫(yī)學院，上海 200092)

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration,AMD)是一種后天性黃斑疾病，是主要致盲眼病之一。經(jīng)國內(nèi)外諸多調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，吸煙、二手煙霧是AMD的重要危險因素[1]。父母吸煙也會增加后代女子患AMD的風險[2-3]。背后機制涉及視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細胞的線粒體膜電位升高，超氧化物的生成，4- 羥基-2-壬烯醛、血管內(nèi)皮生長因子、血紅素加氧酶-1的表達升高等。近些年又有研究發(fā)現(xiàn)，香煙中的尼古丁通過刺激α-腎上腺素能受體促進血管收縮引起血管痙攣來影響視網(wǎng)膜細胞的正常功能[4-6]。目前，除尼古丁、一氧化氮外，鮮有報道香煙煙霧中的其他物質(zhì)與AMD的發(fā)生有關(guān)。本研究通過對構(gòu)建的香煙暴露大鼠進行代謝組學分析，探索香煙煙霧中導致AMD發(fā)生的其他潛在毒物。

1 材料與方法

1.1 香煙暴露大鼠和萘誘導大鼠模型的建立方法與染毒標準

選取健康SD大鼠體重約為280g(購自上海斯萊克公司)。遵守同濟大學醫(yī)學院/同濟大學生命科學與技術(shù)學院《實驗動物使用和管理》規(guī)定并符合美國視覺與眼科學研究學會眼科研究領(lǐng)域中使用動物的要求。經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)后，隨機將大鼠分為正常對照組(control group,CTL)、香煙暴露組(cigarette exposure group,CE)和萘誘導組(nap-hthalene induced group,NA)。對照組大鼠不做任何處理，自由呼吸室內(nèi)空氣。對香煙暴露組大鼠每周5d，每天分4次(共6h)進行暴露。每只大鼠按照每周10支84mm“紅雙喜牌”香煙(焦油量:11mg；煙氣煙堿量:1mg；煙氣一氧化碳量:13mg)的標準進行暴露。以每天1mg/kg劑量，連續(xù)2個月對SD大鼠經(jīng)口灌喂萘，作為萘誘導組體內(nèi)研究模型。

1.2 液相質(zhì)譜(liquid chromatography mass spectro-metry,LC-MS/ MS)相關(guān)的實驗動物組織的收集與處理

1.2.1 血漿提取 將大鼠按照每500g體重注射 1mL 2%戊巴比妥鈉的劑量進行腹腔注射麻醉，使用心臟取血法將血液收集在肝素抗凝管中。4℃離心(離心半徑13.5cm，1500r/min，15min)，收集上層血漿于干凈的離心管，分裝后放入液氮速凍后，于-80℃保存。

1.2.2 眼組織提取 將大鼠麻醉后脫頸處死。使用滅菌的眼科解剖器械取出眼球后，用預冷的無菌1×PBS洗凈。使用“前房穿刺法”收集房水，進而取出視網(wǎng)膜。將6只大鼠眼球的房水、視網(wǎng)膜、玻璃體收集于同一離心管中，制成混合樣本后放入液氮速凍后，于-80℃保存。

1.2.3 動物組織的實驗前處理方法 每10mg固體組織加入提前添加0.2%(體積分數(shù))冰醋酸的乙腈100μL。每10μL液體樣本加入提前添加0.2%(體積分數(shù))冰醋酸的流動相20μL。記錄稀釋倍數(shù)后于4℃下勻漿組織。而在4℃離心(離心半徑13.5cm，12000r/min，15min)，將上清液按1∶2的比例加入流動相進行稀釋，以進一步降低基質(zhì)效應(yīng)。最后添加終濃度為0.4μg/L的醋酸胺后快速進樣分析。

1.3 香煙暴露大鼠代謝產(chǎn)物分析

按照1.2的方法收集大鼠血漿、房水和視網(wǎng)膜，送至上海百趣生物醫(yī)學科技有限公司進行實驗檢測。

使用島津?高性能三重四極桿液質(zhì)譜聯(lián)用儀TM，安捷倫?SB-C18柱為實驗色譜柱，進樣分析時控制柱溫在45℃。單針進樣體積為5μL，流速為0.2mL/min。

1-萘酚使用負離子模式，監(jiān)測離子為143-99(m/z),Q1為27V,CE為8V,Q3為10V。2-萘酚使用負離子模式，監(jiān)測離子為143-99(m/z),Q1為16V,CE為9V,Q3為23V。1,2-二羥基萘使用負離子模式，監(jiān)測離子為159-115(m/z),Q1為10V,CE為21V,Q3為13V。1,2-萘醌使用正離子模式，監(jiān)測離子為159-131(m/z),Q1為-19V,CE為-19V,Q3為-22V。

對1-萘酚、2-萘酚、1,2-萘醌使用10%、50%、90%的乙腈進行梯度洗脫。對1,2-二羥基萘使用80%乙腈進行洗脫。進流動相沖洗色譜柱后，待柱壓穩(wěn)定在9～12MPa后進樣分析。

1.4 丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平及總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)測定

將大鼠麻醉后脫頸處死，取出眼球，在體視顯微鏡下快速分離視網(wǎng)膜。每10mg視網(wǎng)膜組織加入提前添加苯甲基磺酰氟(PMSF)與蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液100μL，4℃勻漿組織后于冰上放置15min，中途振蕩2～3次。4℃ 離心(離心半徑13.5cm，12000r/min，15min)，取離心后的上清液裝入新的離心管。

本實驗采用BCA法來測定組織內(nèi)蛋白含量。取視網(wǎng)膜蛋白提取液2μL，加入200μL BCA試劑盒中的工作液，37℃恒溫箱30min后，讀取562nm處的吸光度值(A562)。通過提前繪制好的標準曲線，通過測得吸光度，計算出樣本中蛋白濃度。

按碧云天生物技術(shù)研究所出產(chǎn)的丙二醛(MDA)檢測試劑盒及總抗氧化能力檢測試劑盒(ABTS法)中的使用說明進行檢測。

1.5 視網(wǎng)膜細胞衰老β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase,SA-β-gal)染色觀察

將大鼠麻醉后，腹部朝上固定在手術(shù)臺上，剪開胸腔。使用4%多聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)灌注固定大鼠。灌注完畢后用眼科剪快速取出眼球，于角膜處剪出小口后，置于4%PFA中4℃固定24h。在解剖顯微鏡下除眼前節(jié)和晶狀體后，將剩余視杯置于10%、20%、30%蔗糖液中梯度脫水。將脫水后的視杯使用OCT包埋，4℃平衡4h后轉(zhuǎn)移到-80℃長期保存。實驗前取出，在冰凍切片機上選擇過視神經(jīng)乳頭的位置附近制作12μm厚度的視網(wǎng)膜切片。

取出視網(wǎng)膜切片，室溫平衡15min，使用石蠟筆圈出組織，按碧云天生物技術(shù)有限公司出產(chǎn)的細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒使用說明，對視網(wǎng)膜切片進行染色。最后使用0.5μg/mL DAPI孵育切片1min染核，PBS清洗3次后使用DAKO熒光封片劑封片，加上蓋玻片于激光共聚焦下觀察熒光結(jié)果。因DAPI藍色熒光與β-gal+藍綠色不易區(qū)分，因此對DAPI進行了紅色濾色處理。

1.6 閃光視網(wǎng)膜電圖(flicker electroretinograms,F-ERG)

將大鼠麻醉后，按每500g體重注射琥珀膽堿0.1mL的劑量在大鼠大腿進行肌內(nèi)注射。兩眼滴加托吡卡胺、利多卡因混合滴眼液后等待5min。使用康華瑞明視覺電生理檢查儀采集視網(wǎng)膜電圖。每只鼠眼采集3次，F(xiàn)-ERG圖中波谷縱坐標定義為a波值，波谷后第5個波峰縱坐標定義為b波值。

1.7 CCK-8細胞活力檢測

將生長狀態(tài)良好的aRPE19細胞與r28細胞向96孔板中按照每孔加入6000個細胞的密度進行鋪板。使用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)配置終濃度為100mmol/L 1,2-DHN母液。使用相應(yīng)細胞培養(yǎng)基等比稀釋成濃度為100、50、25、12.5、6.25、0μmol/L 的1,2-DHN工作液。待鋪板細胞貼壁后，加入含不同濃度1,2-DHN的培養(yǎng)基處理細胞48h。

按10∶1的比例向培養(yǎng)基中加入CCK-8溶液。在培養(yǎng)箱內(nèi)37℃繼續(xù)孵育1h后，使用酶標儀測定450nm波長處的吸光度。

1.8 統(tǒng)計學處理

對代謝組學數(shù)據(jù)四分位數(shù)間距對偏離值進行過濾，實現(xiàn)對單個Peak的除噪。只保留單組空值不多于50%或所有組中空值不多于50%的峰面積數(shù)據(jù)對單個Peak進行過濾。對原始數(shù)據(jù)中的缺失值用最小值二分之一法進行填補。利用內(nèi)標進行歸一化實現(xiàn)數(shù)據(jù)標準化處理。差異代謝物篩選條件為VIP(該物質(zhì)在該組對比的OPLS-DA模型得到的變量投影重要度)大于1且P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 香煙暴露大鼠血漿、房水及視網(wǎng)膜代謝組學分析

使用熏煙箱對大鼠暴露1個月后，與對照大鼠一同收取血漿、房水和視網(wǎng)膜做代謝組學分析統(tǒng)計。對這些差異代謝物按照來源進行初步篩查后，決定重點關(guān)注血漿及房水中的外源性差異代謝物，以便篩查出香煙煙霧中的潛在毒物。通過比對香煙暴露組大鼠與對照組大鼠血漿及房水差異代謝物熱圖結(jié)果發(fā)現(xiàn)，香煙暴露大鼠血漿與房水中出現(xiàn)了尼古丁和尼古丁的初級代謝物可替寧，見圖1?？商鎸幨俏碂煵莺蟮捏w內(nèi)生物標志物，因此證明了香煙煙霧確實被大鼠吸入體內(nèi)并發(fā)生代謝。圖中1,5-萘二胺與3-氨基-2-萘甲酸在香煙暴露大鼠血漿和眼中增高。它們二者是萘的體內(nèi)中間代謝物1,2-二羥基萘(naphthalene-1,2-diol,1,2-DHN)的相關(guān)物質(zhì)，具有類似的生物學功能，在體內(nèi)可以相互轉(zhuǎn)化。曾有文章報道，萘是多品牌香煙燃燒后煙霧中含量最高的環(huán)芳烴[7]。萘的體內(nèi)最終代謝物1，2-萘醌具有很強的親電子性，非常容易與細胞內(nèi)的生物大分子物質(zhì)——DNA和蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的加合物。使細胞產(chǎn)生不可逆的損傷，誘發(fā)組織細胞進入癌癥或死亡[8]。

圖1 對照組大鼠與香煙暴露組大鼠的血漿及房水中的差異代謝物層次聚類數(shù)據(jù)矩陣熱圖Fig.1 A.Heat map of hierarchical clustering data matrix of differential metabolites in plasma and aqueous humor of CTL group rats and CE group ratsA：血漿，陽離子模式；B：血漿，陰離子模式；C：房水，陽離子模式

視網(wǎng)膜中內(nèi)源性差異代謝物也展示了香煙暴露對大鼠產(chǎn)生的影響。如2S氨基十八碳4E，6E二烯- 1,3R二醇、反-4,順-9-十六碳二烯醛、5,7-二乙基-9-甲基-3E,5E,7E,9E-十三碳四烯、9,12,15-十八碳三烯醛等不飽和烴鏈的在組織中的水平下降，見圖2，這提示組織內(nèi)物質(zhì)氧化水平升高。同時2-氨基十八烷酸、2-羥基肉桂酸等有機酸在組織內(nèi)水平升高，棕櫚酰胺、十二烷酰胺、油酰乙基酰胺等有機酰胺水平降低，也說明了組織內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)的增強。此外肉豆蔻酰肉堿、反-2-十六碳烯酰肉堿、棕櫚酰左旋肉堿、縮水甘油基肉堿等諸多酰基肉堿水平普遍下降，表明組織內(nèi)的脂代謝水平發(fā)生下降。通過對差異代謝物進行來源分析后發(fā)現(xiàn)，香煙暴露大鼠視網(wǎng)膜中亞油酸代謝通路有非常顯著的增強，這與AMD患者視網(wǎng)膜代謝組學結(jié)果相一致[9-10]。

圖2 對照組大鼠與香煙暴露組大鼠視網(wǎng)膜代謝組學分析結(jié)果Fig.2 The results of metabolomics analysis of the retina of CTL group rats and CE group ratsA：陽離子模式下差異代謝物層次聚類數(shù)據(jù)矩陣熱圖；B：陰離子模式下差異代謝物層次聚類數(shù)據(jù)矩陣熱圖；C：陰離子模式下差異代謝物代謝通路富集分析氣泡圖；D：陰離子模式下差異代謝物代謝通路富集分析樹狀圖

2.2 香煙暴露大鼠眼內(nèi)萘代謝物檢測

本研究建立了用于LC-MS的大鼠眼部組織中萘代謝物的物質(zhì)樣品前處理的方法與質(zhì)譜條件。使用優(yōu)化后方法檢測萘代謝物減小了生物基質(zhì)效的影響，使待測物質(zhì)響應(yīng)更高，保留時間穩(wěn)定，拖尾與雜峰減少，見圖3。

圖3 萘代謝物標準品在流動相及優(yōu)化前后空白生物基質(zhì)中的色譜表現(xiàn)Fig.3 Chromatographic performance of standard naphthalene metabolites in mobile phase and blank biological matrix before and after optimization綠色：1-萘酚、2-萘酚；棕色：1,2-二羥基萘酚；黑色：2-萘醌

實驗檢測了1-萘酚、2-萘酚、1,2-二羥基萘和1,2-萘醌在組織內(nèi)的存在情況。發(fā)現(xiàn)香煙暴露大鼠的眼內(nèi)多組織均檢測到了不同響應(yīng)大小的萘代謝物峰。萘代謝物基本以開環(huán)后的1,2-二羥基萘與最終氧化形式1,2-萘醌的形式存在于眼部組織中，見圖4。其中房水中的1,2-二羥基萘與視網(wǎng)膜中的1,2-萘醌響應(yīng)峰最高。

圖4 大鼠眼中的萘代謝物LC-MS分析結(jié)果Fig.4 LC-MS analysis results of naphthalene metabolites in rat eyes綠色：1-萘酚，2-萘酚；棕色：1,2-二羥基萘酚；黑色：2-萘醌；樣品為6只大鼠眼球收集的混合樣品

2.3 香煙暴露大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)MDA水平上升，T-AOC下降

經(jīng)過6個月的香煙暴露后，香煙暴露大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)MDA水平相比對照明顯升高(P<0.05)，總抗氧化能力也出現(xiàn)了下降(P<0.05)，見圖5。這表明較長時間的香煙暴露使得大鼠體內(nèi)抗氧化物質(zhì)消耗加速，組織細胞也一定上發(fā)生了氧化損傷。同時研究也對萘誘導組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)MDA水平和T-AOC進行了檢測，發(fā)現(xiàn)萘誘導組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)也同樣發(fā)生了氧化應(yīng)激，且作用更加劇烈。

圖5 對照組大鼠與香煙暴露組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)MDA水平及總抗氧化能力分析Fig.5 The analysis of MDA level and total antioxidant capacity in the retina of CTL group rats and CE group ratsn=6，結(jié)果表示為

2.4 香煙暴露引起大鼠視網(wǎng)膜細胞發(fā)生衰老

視網(wǎng)膜內(nèi)巨噬細胞衰老與RPE細胞衰老均與AMD的發(fā)病密切相關(guān)。代謝組學結(jié)果提示香煙暴露大鼠視網(wǎng)膜中有更多具有“衰老標志”的物質(zhì)在積累。為近一步觀察香煙暴露大鼠視網(wǎng)膜細胞是否發(fā)生衰老以及衰老發(fā)生的部位。本研究使用SA-β-Gal法對大鼠視網(wǎng)膜冰凍切片進行染色。實驗發(fā)現(xiàn)，香煙暴露大鼠視網(wǎng)膜細胞發(fā)生了衰老。且衰老細胞主要集中于RPE細胞層。同時節(jié)細胞層也有部分細胞表現(xiàn)出β-gal+，見圖6。

圖6 對照組大鼠與香煙暴露組大鼠視網(wǎng)膜切片SA-β-gal染色結(jié)果Fig.6 The SA-β-gal staining results in retina sections of CTL group rats and CE group rats衰老細胞，藍綠色；DAPI，紅色；n=6，選擇視網(wǎng)膜中視神經(jīng)旁出中段位置拍照

2.5 香煙暴露使得大鼠視網(wǎng)膜功能發(fā)生降低

當大鼠經(jīng)香煙暴露4、6個月時，對其進行F-ERG 檢測。F-ERG結(jié)果顯示，經(jīng)4個月香煙暴露后，大鼠視網(wǎng)膜b波較正常大鼠發(fā)生了下降(187.43vs398.21，n=6，P<0.05)。表示視網(wǎng)膜功能在香煙暴露4個月后出現(xiàn)下降。經(jīng)6個月的香煙暴露后，這種下降的趨勢則更為明顯(122.7vs364.1，n=6，P<0.05)，見圖7。

圖7 對照組大鼠與香煙暴露組大鼠F-ERG實驗檢查結(jié)果Fig.7 F-ERG examination results of CTL group rats and CE group ratsA：F-ERG檢查波形圖；B：對b波值的統(tǒng)計分析結(jié)果；n=6，結(jié)果表示為

2.6 萘經(jīng)口灌胃使得大鼠視網(wǎng)膜功能發(fā)生降低

對萘誘導組大鼠同樣進行F-ERG檢測發(fā)現(xiàn)，大鼠視網(wǎng)膜b波較正常大鼠發(fā)生了顯著下降(511.7vs375.2，n=6,P<0.01)，見圖8。表示萘誘導大鼠視網(wǎng)膜功能較對照大鼠發(fā)生了顯著下降。

圖8 對照組大鼠與萘誘導組組大鼠F-ERG實驗檢查結(jié)果Fig.8 F-ERG examination results of CTL group rats and NA group ratsA：F-ERG檢查波形圖;B：對b波值的統(tǒng)計分析結(jié)果；n=6，結(jié)果表示為

2.7 1,2-DHN會使視網(wǎng)膜細胞活力下降

通過LC-MS在香煙暴露大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)明確發(fā)現(xiàn)了1,2-DHN。為進一步確定萘代謝物對視網(wǎng)膜細胞的毒性作用。本研究選擇了aRPE19細胞系和r28細胞系的細胞進行了體外實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1,2-DHN在極低的濃度時便會對aRPE19與r28細胞產(chǎn)生強烈的細胞毒性，見圖9。圖中以相對細胞活力為縱軸，經(jīng)倍比稀釋的1,2-DHN濃度為橫軸，觀察到1,2-DHN作用于兩種細胞的半數(shù)致死量僅在10μmol/L左右。

圖9 通過CCK-8實驗檢測到1,2-DHN處理的r28和aRPE19的細胞活力Fig.9 Cell viability of r28 and aRPE19 treated with 1,2-DHN detected by CCK-8 assay初始細胞密度：8×104 /孔

3 討 論

不同于以往基于大規(guī)模流行病學調(diào)查來進行疾病代謝物的相關(guān)研究。近年來非靶向代謝組學分析技術(shù)的進步使得代謝物研究更加科學與高效。這使得視網(wǎng)膜中復雜的代謝物庫不斷完善和積累，如今代謝組學也已經(jīng)成熟地用于研究諸如高糖高脂等飲食干預、胃腸道菌群、各種微量營養(yǎng)素對AMD發(fā)生的各類動物和人體模型的重要研究方法[11]。本研究通過分析香煙暴露組大鼠與對照組大鼠之間代謝圖譜的差異，討論了經(jīng)香煙暴露后大鼠視網(wǎng)膜中代謝物變化差異。同時合理推測出香煙煙霧中會損傷大鼠視網(wǎng)膜的一種關(guān)鍵毒性物質(zhì)——萘，并在體內(nèi)體外設(shè)計了簡單的實驗來驗證萘代謝物對視網(wǎng)膜產(chǎn)生的影響。

雖然本研究證明了香煙煙霧中的萘會引起大鼠視網(wǎng)膜受損，但是也不可否認香煙暴露作為一個誘發(fā)疾病的環(huán)境因素，對視網(wǎng)膜的作用是復雜多樣的。此外通過代謝組學，發(fā)現(xiàn)香煙暴露會使得大鼠視網(wǎng)膜中包括左旋肉堿在內(nèi)的多種?；鈮A在視網(wǎng)膜中的水平發(fā)生了下降。左旋肉堿及其衍生物參與體內(nèi)諸多生理過程，包括糖的有氧代謝，氧化磷酸化，脂肪酸的氧化和滲透等。左旋肉堿可通過發(fā)揮抗氧化作用來延緩AMD的發(fā)生[12]。臨床試驗證明，對患有年齡相關(guān)性黃斑變性的患者補充乙?；笮鈮A，可以改善患者視野平均缺損，視敏度，中央凹敏感性和眼底情況，幫助其恢復視覺功能[13]。視網(wǎng)膜也是眼內(nèi)肉堿含量最豐富的組織結(jié)構(gòu)之一[14]。香煙暴露引起的大鼠視網(wǎng)膜?；鈮A水平下降，使得左旋肉堿在體內(nèi)具有的抗氧化作用也隨之降低。這會導致香煙暴露大鼠更易受到氧化損傷。香煙暴露組大鼠視網(wǎng)膜中諸多不飽和烴鏈水平相較對照組大鼠有著明顯的降低，也很好地證明了經(jīng)香煙暴露后組織內(nèi)氧化水平升高。同時香煙暴露大鼠視網(wǎng)膜左旋肉堿的水平降低也可能會導致肉堿在視網(wǎng)膜的抗凋亡和維持滲透壓的作用受到阻礙，不能很好地發(fā)揮其改善RPE細胞和內(nèi)皮細胞的細胞遷移，增殖和黏附的作用[15]，會引起視網(wǎng)膜組織動脈血流異常，進而影響視網(wǎng)膜的功能。AMD的發(fā)病機制涉及RPE細胞對光感受器外節(jié)的吞噬消化能力下降，使未被完全消化的盤膜殘余小體潴留于基底部細胞中，沉積于Bruch膜，形成玻璃膜疣。而玻璃體疣則主要由酯化膽固醇、磷脂酰膽堿和蛋白質(zhì)形成[16]。磷脂在體內(nèi)經(jīng)氧化分解可產(chǎn)生溶血磷脂和脂肪酸等物質(zhì)，視網(wǎng)膜細胞中磷脂的氧化也會參與AMD發(fā)病進程[17]。本研究發(fā)現(xiàn)香煙暴露大鼠視網(wǎng)膜中有著較對照更高的磷脂酰膽堿水平，以及更高的脂肪酸水平，這又從另一方面說明了香煙暴露大鼠視網(wǎng)膜中氧化水平的升高。除此以外，香煙暴露大鼠視網(wǎng)膜中亞油酸代謝通路的異常升高。有研究指出攝入過量特定類型的脂肪會增加人或小鼠AMD發(fā)病的風險[18]。背后機制涉及亞油酸通過激活p42/44，MAPK，進而誘導NF-κB轉(zhuǎn)錄激活，上調(diào)一氧化氮合酶和環(huán)氧合酶-2的表達，來對AMD發(fā)病進程產(chǎn)生影響[19]。并且組織內(nèi)高濃度的亞油酸還可以直接刺激RPE細胞來加速促炎基因的表達[20]。

本研究使用代謝組學及靶向鑒定的方法明確了萘代謝物在香煙暴露大鼠視網(wǎng)膜中存在。萘在體內(nèi)的代謝途徑包括環(huán)氧化物水解酶催化途徑制、CYP過氧化物酶催化途徑、醛酮還原酶催化途徑。萘在環(huán)境中經(jīng)呼吸道或食管進入體內(nèi)后，首先會被相應(yīng)組織內(nèi)的細胞色素P-450酶依賴的單氧化酶轉(zhuǎn)化成不穩(wěn)的環(huán)氧化物中間體，代謝后的環(huán)氧化物大部分會在水解酶的作用下形成1,2-二氫-萘二酚，同時一小部分會通過非酶促反應(yīng)代謝為1-萘酚與2-萘酚。1,2-二氫-萘二酚經(jīng)血液循環(huán)進入眼內(nèi)后，可以通過組織細胞中的酪氨酸酶將其脫氫氧化形成1，2-二羥基萘。1，2-DHN在組織內(nèi)又會被快速氧化為1，2-萘醌[21-22]。其實不只局限于視網(wǎng)膜，在采集的香煙暴露大鼠房水和玻璃體的混合樣本中，也發(fā)現(xiàn)了萘的代謝物。萘代謝物在眼中不同部位的分布略有不同：房水中的萘代謝物主要以1,2-DHN的形式存在，玻璃體中則觀察到了1,2-DHN和1,2-萘醌，視網(wǎng)膜中則更多的是以具有強氧化性的最終代謝物1,2-萘醌形式存在。這說明擁有更多細胞的視網(wǎng)膜組織中1,2-DHN到1,2-萘醌的氧化過程發(fā)生得更為迅速且徹底。其過程中伴隨生成的大量過氧化氫也可直接作用于視網(wǎng)膜細胞來造成氧化損傷。

以往對于吸煙導致AMD的機制解釋主要關(guān)注在尼古丁上，本研究證明了香煙煙霧中的新毒物——萘，對香煙暴露大鼠視網(wǎng)膜也具有損傷作用，這種損傷也可能同樣發(fā)生于人類。這或可從一個新的角度幫助認識吸煙與AMD發(fā)病之間的關(guān)系。此次萘代謝產(chǎn)物對視網(wǎng)膜毒性作用的發(fā)現(xiàn)補充了之前流行病學數(shù)據(jù)的結(jié)果。