王 鑫鄔國松 牛 明王伽伯趙 昕韓 杰郝亞冬溫瑞卿?李東輝?

（1.北京市海淀區(qū)食品藥品安全監(jiān)控中心，北京 100094；2.解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心全軍中醫(yī)藥研究所，北京 100039；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源科學(xué)與工程研究中心，廣東廣州 510006）

兩面針為蕓香科植物兩面針Zanthoxylum nitidum（Roxb.）DC.的干燥根。具有祛風(fēng)通絡(luò)、勝濕止痛、消腫解毒的功效，為傳統(tǒng)常用中藥，主產(chǎn)于廣西、廣東、福建、云南等地［1］。本實驗對廣西、廣東20 批不同產(chǎn)區(qū)的兩面針?biāo)幉慕Y(jié)合2020 年版《中國藥典》［2］一部的檢驗項目和HPLC 指紋圖譜進(jìn)行綜合評價。檢驗項目包括性狀鑒別、薄層鑒別、薄層檢查，水分、灰分、浸出物、氯化兩面針堿的含量測定。原藥材的安全性、有效性及質(zhì)量的一致性［3］直接關(guān)系到藥品的安全、有效，中藥材質(zhì)量的一致性是評價中藥材質(zhì)量的一個重要方面。由于中藥材成分復(fù)雜，中藥指紋圖譜［4-7］作為綜合的、可量化的色譜鑒別手段，可以較全面的反映中藥材的藥效學(xué)物質(zhì)特征評價藥材的質(zhì)量，因此選擇18 批鑒定為正品的兩面針?biāo)幉慕PLC 指紋圖譜，并進(jìn)行相似度評價和聚類分析，以期進(jìn)一步探討廣西、廣東不同產(chǎn)地的兩面針的質(zhì)量一致性，為兩面針道地藥材優(yōu)良品種質(zhì)量生物評價研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 儀器 Waters2695 高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；MSA125P 電子天平（德國賽多利斯公司）；FB15061超聲清洗儀（美國Fisher 公司）；硅膠G 薄層版（德國默克公司）；ACY-1002-U 制水機（艾科浦超純水處理有限公司）。

1.2 試劑與藥物 兩面針對照藥材（批號121014-201204，鑒別／檢查用）、氯化兩面針堿（批號110848-201604，純度91.0%）、乙氧基白屈菜紅堿（批號110847-200601，供鑒別用）、毛兩面針?biāo)兀ㄅ?11531-201603，供檢查用），均購于中國食品藥品檢定研究院。乙腈、甲酸、三乙胺均為色譜純（美國Fisher Scientific 公司）；甲醇、乙醇、三氯甲烷、濃氨試液、石油醚（60～90 ℃）、硫酸均為分析純。藥材20 批，具體信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀特征 20 批樣品中18 批呈厚片或圓柱形短段，長2～20 cm，厚0.5～10 cm。表面淡棕黃色或淡黃色，有鮮黃色或黃褐色類圓形皮孔樣斑痕。切面較光滑，皮部淡棕色，木部淡黃色，可見同心性環(huán)紋和密集的小孔。質(zhì)堅硬。樣品2 中栓皮碎塊較多。樣品3、9 表面呈灰棕色，可見疣狀突起。

2.2 薄層鑒別及檢查

2.2.1 兩面針、氯化兩面針堿 取樣品粉末1 g，加乙醇40 mL 超聲處理1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇1 mL使溶解，作為樣品溶液。另取兩面針對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。再取氯化兩面針堿對照品，加乙醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作為對照品溶液。吸取上述3 種溶液各2 μL，點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-濃氨試液（30∶10∶0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外燈（365 nm）下檢視。見圖1。

表1 樣品信息

圖1 兩面針薄層色譜鑒別（一）

對比薄層圖譜，20 份樣品與氯化兩面針堿對照品在相同的位置上均顯相同顏色的熒光斑點，但是樣品3、9 可見綠色的熒光帶。

2.2.2 乙氧基白屈菜紅堿 取乙氧基白屈菜紅堿對照品，加乙醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作為對照品溶液。吸取“2.2.1”項下樣品溶液、對照藥材溶液、對照品溶液各2 μL，點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（25∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。見圖2。

對比薄層圖譜，20 份樣品與乙氧基白屈菜紅堿對照品在相同的位置上均顯相同顏色的熒光斑點，但是樣品3、9可見藍(lán)色的熒光帶。

圖2 兩面針薄層色譜鑒別（二）

2.2.3 毛兩面針?biāo)?取毛兩面針?biāo)貙φ掌?，加乙醇制成? mL 含1 mg 的溶液，作為對照品溶液。另取樣品粉末（過3 號篩）約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加70%甲醇20 mL，超聲處理（功率200 W，頻率59 kHz）30 min，放冷，濾過，濾液置50 mL 量瓶中，濾渣和濾紙再加70%甲醇20 mL，同法超聲處理30 min，放冷，濾過，濾液置同一量瓶中，加適量70%甲醇洗滌2 次，洗液并入同一量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻，取溶液4 mL，濃縮至2 mL，作為樣品溶液。吸取上述2 種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）-三氯甲烷-甲醇（2∶13∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。見圖3。

對比薄層圖譜，樣品3、9 的薄層色譜呈藍(lán)色的熒光條帶，且與毛兩面針?biāo)貙φ掌吩谙嗤奈恢蒙巷@相同顏色的熒光斑點。

圖3 兩面針薄層色譜檢查

2.3 水分、總灰分、浸出物測定 根據(jù)2015 年版《中國藥典》 四部0832 水分測定法、2201 浸出物測定法、2302灰分測定法，檢測20 批樣品，結(jié)果見表2。藥典規(guī)定，水分不得超過10.0%，所有樣品均符合規(guī)定；總灰分不得超過7.0%，所有樣品均符合規(guī)定；浸出物不得少于5.5%，樣品2 小于標(biāo)準(zhǔn)，其他樣品均符合規(guī)定。

2.4 含量測定

2.4.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 DIONEX Acclaim C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.1%甲酸-三乙胺（pH 4.5）（B），梯度洗脫（0～30 min，20%～50% A；30～35 min，50%～100% A）；檢測波長273 nm。理論板數(shù)按氯化兩面針堿計算，應(yīng)不低于2 500。

表2 樣品水分、總灰分、浸出物及含量測定結(jié)果（%）

2.4.2 對照品溶液制備 精密稱取氯化兩面針堿對照品10.37 mg 至20 mL 量瓶中，70%甲醇溶解至刻度，精密量取2 mL 至20 mL 量瓶中，搖勻，制成47.18 μg／mL 溶液。

2.4.3 線性關(guān)系考察 分別精密吸取對照品溶液1、2、4、8、10、12、16、18、20 μL 注入液相色譜儀，記錄峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得方程為Y＝593.57X+5.622（r＝0.999 9），在0.047～0.944 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.4 供試品溶液制備 取樣品粉末（過3 號篩）約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加70% 甲醇20 mL，超聲處理（功率200 W、頻率59 kHz）30 min，放冷，濾過，濾液置于50 mL 量瓶中，濾渣和濾紙再加70%甲醇20 mL，同法超聲處理30 min，放冷，濾過，濾液置于同一量瓶中，70%甲醇洗滌2 次，洗液并入同一量瓶中，70% 甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.4.5 測定法 精密吸取對照品、供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，色譜圖見圖4，外標(biāo)法計算氯化兩面針堿含量，結(jié)果見表2。

藥典規(guī)定，按照干燥品計算，氯化兩面針堿含量不得少于0.13%，而樣品3、9、10、11、12、14 均低于0.13%。

圖4 氯化兩面針堿HPLC 色譜圖

2.5 兩面針HPLC 指紋圖譜建立

2.5.1 色譜條件 DIONEX Acclaim C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.1% 甲酸-三乙胺（pH 4.5）（B），梯度洗脫（0～30 min，20%～50%A；30～35 min，50%～100%A，36～45 min，80%～20%A）；檢測波長273 nm。

2.5.2 對照品、供試品溶液制備 分別按“2.4.2”“2.4.3”項下方法制備。

2.5.3 精密度試驗 取供試品溶液（樣品18），在“2.5.1”項條件下連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，采用國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012.1 版本）軟件進(jìn)行相似度評價，結(jié)果均≥0.999（RSD＜0.05%），表明儀器精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液（樣品18），在“2.5.1”項條件下進(jìn)樣，24 h 內(nèi)每間隔4 h 測定1 次，記錄色譜圖，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012.1版本）軟件進(jìn)行相似度評價，結(jié)果均≥0.997（RSD ＜0.15%），表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 重復(fù)性試驗 取6 份藥材粉末（樣品18）各1 g，按“2.5.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.5.1”項條件下進(jìn)樣測定，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012.1 版本）軟件進(jìn)行相似度評價，結(jié)果均≥0.989（RSD＜0.5%），表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.6 圖譜生成 取18 批經(jīng)鑒定為正品的藥材，按“2.5.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.5.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。將所有數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012.1 版本）軟件進(jìn)行處理，選擇S18 號樣品色譜為參照指紋圖譜。為減小極端數(shù)據(jù)的影響，選擇中位數(shù)法作為對照指紋圖譜的生產(chǎn)方法，運用手動多點校正方法對色譜峰進(jìn)行譜圖匹配，見圖5，建立共有模式。再用相對保留時間標(biāo)定共有指紋峰，結(jié)果確定了15個共有峰，見圖6。

圖5 18 批兩面針?biāo)幉腍PLC 指紋圖譜

圖6 兩面針?biāo)幉墓灿心Ｊ綀D譜

2.5.7 兩面針指紋圖譜評價

2.5.7.1 相似度評價 對18 批已處理的指紋色譜圖進(jìn)行相似度評價，結(jié)果見表3，可知相似度范圍為0.647～0.993，表明藥材質(zhì)量存在一定的差異；除S12、S20 相似度低于0.85 外，其他樣品均大于0.85。

表3 18 批樣品相似度（編號和含量測定等的編號保持一致，除去非正品樣品3 和9）

2.5.7.2 聚類分析 通過稱樣量量化，將18 批樣品的指紋圖譜的共有峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，組成18 階×15 階原始數(shù)據(jù)矩陣，運用iTOL 在線分析軟件，選用平均組間連接聚類方法，利用平方歐式距離法作為樣品間距計算方法進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，聚類結(jié)果見圖7。

18 批兩面針?biāo)幉目煞譃? 類，S1、S4、S8、S16～S17為Ⅰ類，S2、S6、S10、S18 為Ⅱ類，S5、S7、S11、S13～S15、S19 為Ⅲ類，S12 為Ⅳ類，S20 為Ⅴ類。

圖7 18 批樣品系統(tǒng)聚類樹

3 討論

性狀和薄層色譜鑒別是鑒定中藥材真?zhèn)蔚闹匾侄巍?0 批不同產(chǎn)地的兩面針樣品進(jìn)行檢驗和分析。薄層色譜鑒別出樣品3、9 均含有毛兩面針?biāo)?，且表皮灰棕色具有疣狀突起，性狀與飛龍掌血藥材一致［8］，推斷兩者可能為飛龍掌血［8-10］。

中藥材的有效成分為植物的次生代謝產(chǎn)物，次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生與生長環(huán)境有密切關(guān)系。生態(tài)環(huán)境條件的不同，可能導(dǎo)致相同品種藥用植物次生代謝過程的變化，影響同一品種藥材的內(nèi)在質(zhì)量［11-12］。本文對不同產(chǎn)區(qū)的兩面針?biāo)幉?，分別測定了水分、灰分、浸出物及氯化兩面針堿的含量。1 批樣品的浸出物含量未達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)，4 批樣品的含量未達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)，不同產(chǎn)地的兩面針?biāo)幉馁|(zhì)量有差異。

由于中藥材成分復(fù)雜，單一成分的含量不能全面的評價中藥材的質(zhì)量。因此對其他18 批鑒定為兩面針的樣品建立HPLC 指紋圖譜，通過相似度評價和聚類分析進(jìn)一步探討比較樣品間的整體化學(xué)成分的一致程度。相似度評價和聚類分析結(jié)果基本一致，因此，以上樣品可以分為五類，S12 為一類，S20 為一類，S1、S4、S8、S16～S17 為一類，S2、S6、S10、S18 為一類，S5、S7、S11、S13～S15、S19為一類。由此可見，廣東、廣西兩省之間及產(chǎn)自越南的野生兩面針?biāo)幉木鶡o明顯的地域性差異。

S8、S16 為產(chǎn)自廣西大新的野生樣品，僅采集時間不同，薄層色譜、液相圖譜、相似度評價和聚類分析結(jié)果顯示兩種樣品的質(zhì)量具有較高的一致性；S11 和S13 及S14 皆產(chǎn)自廣東且聚為一類，其中S11 和S13 同為廣東平遠(yuǎn)縣的栽培品種，分析結(jié)果顯示兩種樣品的質(zhì)量也具有較高的一致性；對于整體而言，雖然廣東、廣西作為兩面針?biāo)幉牡牡赖禺a(chǎn)地，大部分地區(qū)藥材的化學(xué)成分基本一致，栽培品種和野生品種也無明顯差異，但是以上數(shù)據(jù)顯示，來源（栽培／野生和產(chǎn)地）的統(tǒng)一更有利于保證兩面針?biāo)幉牡馁|(zhì)量一致性。

S11、S12、S13、S14 為不同地區(qū)的栽培品種，栽培年限分別為5.5、3、6.5、5 年，其中只有栽培6.5 年的樣品其氯化兩面針堿的含量高于藥典標(biāo)準(zhǔn)。有文獻(xiàn)報道氯化兩面針的含量與不同的生長期有密切關(guān)系［13-14］，提示由于生長年限不足導(dǎo)致了S11、S12、S14 中氯化兩面針堿的含量偏低，栽培年限是影響栽培品種質(zhì)量的重要因素。

綜上所述，不同產(chǎn)地來源的兩面針存在一定的差異，S1、S4～S8、S13、S15～19，按藥典檢驗符合規(guī)定，通過指紋圖譜和聚類分析表明這12 批兩面針?biāo)幉馁|(zhì)量具有較高的一致性。建立的兩面針的HPLC 指紋圖譜可有效反映出兩面針?biāo)幉馁|(zhì)量的一致性。