鄢海良，趙 陽#，方 興，卓曉貴，鄭景輝

（1.廣西中醫(yī)藥大學，廣西南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院，廣西南寧 530001）

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是一種因缺血性或者出血性腦卒中而造成的認知、記憶和行為等認知功能障礙的臨床綜合征。屬于中醫(yī)癡呆、呆病范疇，與風、火、痰、虛、瘀等因素相關［1-2］。西醫(yī)病因主要由腦血管病（大小動靜脈病變、栓塞、小血管病變、腦血管意外、局部和遠處的缺血性功能改變等）和危險因素（腦血管病危險因素、卒中、缺血性白質病變等）兩個方面。根據流行病學統計［3］，歐美等國家VD 患者占癡呆總患者10%～20%；我國VD 的患病率為1.1%～3.0%，年發(fā)病率在5～9／1000人；VD 患者日常生活能力和社會功能嚴重受損，給家庭和社會帶來了沉重的負擔。血管性癡呆是可預防和有希望治療的一種癡呆，起病緩慢，持續(xù)進展，可通過早期預防和治療降低其殘障率。西醫(yī)主要從預防卒中、改善腦循環(huán)代謝、神經元保護等方面進行治療，短期內能改善患者的認知功能障礙，但不能從根本上阻止神經細胞的繼發(fā)性凋亡和壞死［4］。從傳統中醫(yī)中藥的整體辨證和治未病出發(fā)，發(fā)揮中醫(yī)中藥的多成分多靶點的辨證施治、未病先防既病防變作用，以期早期干預及延緩甚至阻止癡呆的發(fā)生。通竅活血湯出自清代著名醫(yī)家王清任的《醫(yī)林改錯》，具有活血祛瘀、通絡止痛、開竅醒神的功效，原文：立通竅活血湯，治頭面，四肢，周身血管血瘀之證［5］?，F代研究表明通竅活血湯具有抗腦血栓形成、減輕腦水腫、抑制脂質過氧化反應、減輕自由基對腦組織損傷、改善腦缺血后腦組織損傷、減少神經元丟失率，改善神經可塑性和突觸重構，改善VD 大鼠學習記憶能力［6-7］。當前大多數研究主要是通過臨床療效觀察和動物實驗來探討通竅活血湯作用于血管性癡呆的作用機制及療效，尚未闡述具體化合物靶點與疾病靶點的相互作用機制，而網絡藥理學是通過構建“藥物-靶點-疾病”網絡來更系統綜合地觀察藥物對疾病網絡的干預機制，利用中藥復方為多成分、多靶點的協同作用機制，在分子水平上闡明、成分和靶點藥物靶點、疾病靶點及藥物疾病共同靶點網絡之間的協同效應和潛在機制。

1 方法

1.1 通竅活血湯化合物的收集篩選、靶點預測 通竅活血湯由8 味藥材組成，分別是赤芍、川芎、桃仁、大棗、紅花、蔥白、生姜、麝香，通過文獻調研和中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）收集其所含化合物，并以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug likeness，DL）≥0.18 為限定條件對所收集到的化合物進行篩選［8］，將篩選出的有效化合物在TCMSP 中自帶的Related Targets 完成有效化合物作用靶點預測。

利用生物信息學分析工具（http：／ ／bionet.ncpsb.org／batman-tcm／，BATMAN-TCM），以化合物相關度得分（score cutoff）≥100、假定值P≥0.05 為限定條件對通竅活血湯有效化合物成分進行篩選及藥物作用靶點預測。為了使數據格式的整體一致，運用有機小分子生物活性數據庫（https：／ ／www.ncbi.nlm.nih.gov／pccompound／，Pub-Chem）對篩選出的兩組有效化合物進行統一ID 編碼。

1.2 通竅活血湯作用靶點基因名的校正、篩選 將“1.1”項下通竅活血湯有效化合物靶點導入STRING10.5數據庫（https：／ ／string-db.org），限定研究物種為人類，同時剔除非人源靶點，校正為其官方名稱并摘錄其標準基因名；BATMAN-TCM 篩選出的靶點即標準基因名，無需校正。將2 組通竅活血湯的靶點基因名導入VENNY2.1（http：／ ／bioinfogp.cnb.csic.es／tools／venny／index.html），剔除重復靶點后，即為通竅活血湯有效化合物作用靶點的基因名。

1.3 血管性癡呆疾病相關靶點的檢索、篩選 將“血管性癡呆”作為檢索詞，文獻查詢其英文名為“Vascular dementia”，通過GeneCards 數據庫（https：／ ／www.genecards.org／）、OMIM 數據庫（https：／ ／www.ncbi.nlm.nih.gov／omim／）檢索血管性癡呆發(fā)病相關靶點。GeneCards 數據庫通過Gifts 算法，能夠計算靶點與疾病的相關度，并按照相關度排序。按照靶點與血管性癡呆的相關程度，為減少冗余，選擇相關度得分≥15 的靶點作為血管性癡呆靶點進行研究，并摘錄相應的靶點的標準基因名。最后將這兩個數據庫檢索到的血管性癡呆疾病相關靶點導入VENNY2.1（http：／ ／bioinfogp.cnb.csic.es／tools／venny／index.html），得到兩組數據的共同靶點，即血管性癡呆疾病的靶點。

1.4 通竅活血湯對血管性癡呆作用靶點的預測 將“1.2”項下預測的通竅活血湯化合物作用靶點與“1.3”項下篩選的血管性癡呆相關發(fā)病靶點導入VENNY2.1（http：／ ／bioinfogp.cnb.csic.es／tools／venny／index.html），得到2 組靶點的共同靶點，即為通竅活血湯作用于血管性癡呆的靶點。將每個靶點與每個對其有藥理作用的化合物相對應，采用Cytoscape3.6.1 軟件繪制化合物-靶點圖。

1.5 通竅活血湯對血管性癡呆作用靶點的PPI 網絡構建將“1.4”項下預測的通竅活血湯作用血管性癡呆的靶點上傳至STRING10.5 數據庫（https：／ ／string-db.org），選擇研究物種為人類，設置靶點之間最低聯系分數為0.4，并隱藏不與其他靶點聯系的靶點，獲得通竅活血湯對血管性癡呆靶點之間聯系網絡圖，導入Cytoscape3.6.1 軟件進行拓撲學分析，并構建PPI 網絡。

1.6 通竅活血湯對血管性癡呆作用靶點的富集分析和通路注釋分析 把通竅活血湯對血管性癡呆作用靶點導入DAVID Bioinformatics Resources 6.8 數據庫（https：／ ／david.ncifcrf.gov／summary.jsp），選擇生物過程（biological process）、分子功能（molecular function）、細胞成分（cellular component）對通竅活血湯作用于血管性癡呆的靶點進行基因本體（GO）富集分析，通過KEGG 進行靶點基因通路注釋分析。采用GraphPad Prism 7 軟件將GO 富集分析滿足假定值P＜0.05 的結果做成可視化條形圖，Omicshare（http：／ ／www.omicshare.com ／）、HemI 將得到的KEGG 靶點基因通路注釋分析滿足假定值P＜0.05 的結果分別制成可視化氣泡圖、聚類圖。

1.7 通竅活血湯主要有效化合物與其作用的血管性癡呆靶點分子對接 利用RCSB PDB 數據庫（https：／ ／www.rcsb.org／）查找通竅活血湯作用的血管性癡呆靶點的PDB ID，將mol2 格式的化合物與PDB ID 形式的靶點上傳至Systems Dock Web Site 數據庫（http：／ ／systemsdock.unit.oist.jp／iddp／home／index）進行分子對接，通過所得的Docking Score 值分析對接分子與靶點之間的結合活性。一般認為對接分數（docking score）值＞4.25 表示對接分子與靶點之間有一定的結合活性，＞5.0 表明對接分子與靶點之間有較好的結合活性，＞7.0 則說明具有強烈的結合活性。

2 結果

2.1 通竅活血湯化合物的收集篩選、靶點預測 通竅活血湯有效化合物共165 個，其中赤芍25 個，川芎25 個，蔥白7 個，紅花26 個，大棗35 個，麝香5 個，桃仁22 個，生姜20 個，具體見表 1；有效化合物作用靶點2 203 個，其中TCMSP 數據庫收集到1 389 個，BATMAN-TCM 收集到814 個。

2.2 通竅活血湯作用靶點基因名的校正、篩選 通竅活血湯標準基因名共2 170 個，其中TCMSP 數據庫1 247 個，BATMAN-TCM 數據庫814 個，刪除重復靶點后得493 個。

2.3 血管性癡呆發(fā)病靶點收集 GeneCards 數據庫共檢索出2 966 個與血管性癡呆發(fā)病相關的靶點，相關度最高的是Vascular Endothelial Growth Factor A（95.7 分），最低的是Zinc Finger And AT-Hook Domain Containing 類靶點（0.2分），其中相關度得分≥15 的靶點共194 個，而OMIM 數據庫共檢索到1 047 個血管性癡呆發(fā)病的靶點，導入VENNY2.1（http：／ ／bioinfogp.cnb.csic.es／tools／venny／index.html）中后得到2 個數據庫的共同靶點109 個，即為血管性癡呆發(fā)病的靶點。

2.4 通竅活血湯作用血管性癡呆靶點的預測 分別將“2.2”“2.3”項下靶點、基因名導入VENNY2.1 軟件，共得到33 個共同靶點，包括AKT1、CCL2、CRP、F3、HIF1A、HMOX1、ICAM1、IFNG、IL1B、IL6、KDR、MAPK8、MMP2、MMP9、MPO、NOS3、PLAT、PLAU、PON1、PPARG、PTGS2、SELE、SERPINE1、SLC6A4、TGFB1、THBD、TP53、VCAM1、VEGFA、BCHE、NOS1、MTHFR、LPL，即為通竅活血湯作用于血管性癡呆的靶點，見圖1。將其與相對應的化合物進行聯系分析，共得到123對相關的聯系，通過Cytoscape3.6.1 軟件進行拓撲學分析，得到作用靶點數排名前6 的化合物為槲皮苷（26 個）、木樨草素（10 個）、山柰酚（8 個）、黃芩素（7 個）、β-胡蘿卜素（6 個）、β-谷甾醇（4 個），化合物-靶點聯系圖見圖2。

表1 通竅活血湯有效化合物

續(xù)表1

圖1 通竅活血湯作用血管性癡呆靶點的預測圖

2.5 通竅活血湯對血管性癡呆作用靶點的PPI 網絡 通過STRING10.5 數據庫分析得到33 個靶點之間340 條聯系的網絡圖，導入Cytoscape3.6.1 軟件進行拓撲學分析，發(fā)現靶點之間聯系個數排名前十的靶點為IL6（32 個）、NOS3（30 個）、SERPINE1（29 個）、IL1B（28 個）、CCL2（28個）、CRP（28 個）、VEGFA（27 個）、AKT1（26 個）、MMP9（26 個）、MMP2（25 個）、PTGS2（25 個）、ICAM1（25 個）、VCAM1（25 個），PPI 網絡圖見圖3。

2.6 通竅活血湯對血管性癡呆作用靶點的GO 富集分析和通路注釋分析 GO 富集分析生物過程、分子功能、細胞成分分別得到69、23、16 個條目，各取前15 個條目繪制可視化條形圖，見圖4。其中，生物過程與血管性癡呆相關的包括缺氧反應、基因表達的正調控、血管生成的正調控、一氧化氮生物合成過程的正向調控、細胞對缺氧的反應、內皮細胞增殖的正向調控、鈣離子轉運的負調控、蛋白質磷酸化的正調控、炎癥反應，分子功能與血管性癡呆相關的包括血紅素結合、細胞因子活性、一氧化氮合酶活性，細胞成分與血管性癡呆相關的包括血小板阿爾法顆粒腔、蛋白質的細胞外基質、血液微粒、蛋白質復合體。通路注釋分析得到P≥0.05 的通路有49 條，前20 條通路中共涉及26 個靶點，與血管性癡呆相關的包括腫瘤壞死因子信號通路、缺氧誘導因子-1 信號通路、血管內皮生長因子信號通路、補體和凝血級聯、核因子κB 信號通路，可視化氣泡圖見圖5，聚類熱圖見圖6。

圖2 通竅活血湯有效化合物作用血管性癡呆靶點網絡圖

圖3 通竅活血湯對血管性癡呆作用靶點的PPI 網絡圖

2.7 通竅活血湯主要有效化合物與其作用的血管性癡呆靶點分子對接 根據“2.4”項下拓撲學分析結果，選擇排名前四的槲皮苷（5280343）、木樨草素（5280445）、山柰酚（5280863）、黃芩素（5281605）作為主要有效化合物，與通竅活血湯作用的33 個血管性癡呆靶點進行分子對接。結果，51 組對接中Docking Score 值＞7 的有3 組，＞6 的有34 組，＞5 的有40 組，＞4.5 的有44 組，測不出的有7 組，具體見表2。

3 討論

圖4 通竅活血湯對血管性癡呆作用靶點的GO 富集分析

圖5 通竅活血湯對血管性癡呆作用靶點的KEGG通路注釋分析

表2 通竅活血湯主要有效化合物與其作用的血管性癡呆靶點分子對接結果

血管性癡呆是以認知、記憶等諸多功能障礙為主，而且可能伴有語言、人格或情感障礙的一種獲得性智能持續(xù)性損害疾病，而腦血管病變導致局部或全腦缺血、缺氧、細胞壞死，繼而引起腦部與認知、記憶等相關的特定神經組織損害是血管性癡呆發(fā)病的主要病理過程，其發(fā)病機制、生物學標志物、早期預防、后期治療是血管性癡呆研究領域中的重點和熱點。中藥是一種具有多種生物活性的多組分復雜體系，在干預疾病過程中體現出復方制劑多成分、多靶點、多通路整合調節(jié)的作用特點，故采用網絡藥理學構建疾病與藥物多通路、多靶點復雜的機制，系統研究藥物疾病靶點作用機制及發(fā)現潛在靶點，既可系統闡述與疾病相關作用機制，又可為潛在靶點及機制的研究提供新思路。

圖6 通竅活血湯對血管性癡呆作用靶點的KEGG 分析聚類熱圖

結果，通竅活血湯中有165 個有效化合物，33 個藥物疾病共同靶點共有198 對藥理作用?，F代研究表明，大棗具有增強免疫功能、抑制癌細胞增殖、降血壓、降膽固醇、抗氧化作用［9］，紅花具有保護腦組織、抗血小板聚集、增強抗應激能力、降低血液黏度、降低血壓、調節(jié)血脂平衡等作用［10］，桃仁具有免疫調節(jié)、抗氧化、抗炎、心血管保護、抗腫瘤作用［11］，赤芍具有抗血栓、抗氧化、抗內毒素、抗腫瘤、保護神經作用［12］，生姜具有改善腦組織能量代謝、清除氧自由基、抑制鈣超載、抑制神經細胞凋亡作用［13］，蔥白具有抑制炎癥細胞因子［14］；麝香具有抗炎、興奮中樞、蘇醒作用。Quercetin（槲皮苷）為大棗、紅花共有成分，經口服后在腸道細菌的作用下分解為槲皮素和糖類；槲皮素經腸上皮細胞吸收，發(fā)揮抗氧化、治療心血管疾病、抗炎、抗腦損傷中藥［15-16］。beta-sitosterol（β-谷甾醇）為桃仁、赤芍、大棗、紅花、生姜共有成分，具有抗氧化、降低膽固醇、抗焦慮、抗驚厥、抑制炎性因子分泌［17］。baicalein（黃芩素）為紅花、赤芍共有成分，是神經元細胞中的有效自噬誘導劑，通過抑制mTOR 途徑誘導神經元細胞自噬，促進α-syn 在神經元細胞中的降解，并拮抗α-syn 對神經細胞的毒性損傷以達到神經保護的目的［18］；β-carotene（β-胡蘿卜素）是天然的抗氧劑，可通過減輕eNOS 脫偶聯和硝化應激損傷，發(fā)揮抗缺血性腦損傷作用［19］；luteolin（毛地黃黃酮）為紅花成分，能通過提高因腦缺血再灌注損傷引起的SOD、GSH-Px、CAT 活性下降，降低升高的MDA 水平，進而發(fā)揮抗腦缺血再灌注腦損傷作用［20］。

對通竅活血湯作用于血管性癡呆的33 個共同靶點進行拓撲、聚類分析，發(fā)現靶點之間作用與被作用的復雜關系，并重點分析靶點之間聯系排名前十的靶點，初步揭示藥物疾病共同靶點的作用機制。IL6、IL1β、ICAM1、VCAM1 是炎癥因子，CRP 是炎癥特異性反應，血管內皮細胞損傷引起血管病變繼發(fā)腦缺血，缺血中心區(qū)神經元釋放相關分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）激活免疫應答，而后星形膠質細胞和小膠質細胞活化釋放TNFα，IL-1β，IL-6 等一系列炎癥因子，使得血管內皮細胞ICAM-1、血管內皮細胞黏附分子VCAM1 表達上調，引發(fā)細胞炎癥反應，使神經元發(fā)生不可逆死亡［21］。NO 是一種血管、神經活性物質，具有調節(jié)腦血流、抑制或促進神經遞質釋放、興奮神經元、引發(fā)炎癥、學習記憶功能。腦缺血缺氧以后，興奮性氨基酸增加激動NMDA 受體，灰質氧化和線粒體損傷、細胞內鈣超載，激活NOS 釋放大量對腦神經有害的NO，介導遲發(fā)性神經死亡，谷氨酸過度釋放，引起海馬區(qū)信號傳遞釋放障礙，繼而引起學習障礙；抑制神經膠質細胞NOS3 的生成可以防止軸突線粒體分裂，恢復線粒體活力，維持Miro-2 水平來保護軸突，進而保護腦損害［22-23］。CCL2 是人體內細胞趨化因子，介導單核細胞遷移；在腦缺血缺氧的情況下，氧化應激、細胞因子或者生長因子的刺激等的介導，其表達水平會顯著升高，然后損傷內皮細胞的緊密連接和破壞血腦屏障，增加免疫細胞的募集以加重炎癥反應，活化小膠質細胞，興奮多巴胺神經元，通過抑制CCL2 的表達可以減輕腦缺血后的炎癥反應及神經元損害［24］；同時CC 趨化因子受體（CCR2）是通過與CC 趨化因子配體（CCL2）結合發(fā)揮作用的，CCR2受體細胞在CCL2 的誘導遷移至炎癥部位，分化巨噬細胞，釋放炎癥因子，發(fā)揮吞噬功能；CCR2 神經祖細胞在CCL2的介導下被吸引至神經損傷處并分化成神經元，以發(fā)揮神經再生功能［25］。VEGFA 是通過與VEGFR2 結合激活兩條信號通路而發(fā)揮作用：第一，激活Src 信號通路后，導致內皮細胞上α6β1 整合素與其配體分離，進一步激活金屬基質蛋白酶（MMPs，主要是MMP2、MMP9），降解細胞外基質，促進內皮細胞的遷移；第二，激活經典的PI3／AKT 信號通路，釋放鈣離子、PKC 等第二信使促進內皮細胞活化、分裂、增殖，促進血管新生［26］。PTGS2 是前列腺素內源性過氧化物合酶PTGS 的2 個異構酶，PTGS 及其產物參與血壓調節(jié)、炎癥反應、凝血平衡、腫瘤新生等多種生理病理過程［27］。SERPINE1 基因多態(tài)性與aSAH 后遲發(fā)性腦缺血和功能預后有關。這些關聯可能來自纖溶酶原激活物抑制劑1 水平的改變［28］。

對通竅活血湯作用血管性癡呆的33 個靶點進行GO 富集分析以及上述重要靶點分析，在生物過程方面，排名前十五的條目中，angiogenesis（血管生成）、positive regulation of nitric oxide biosynthetic process（一氧化氮生物合成過程）、cellular response to hypoxia（細胞對缺氧的反應）、positive regulation of endothelial cell proliferation（血管內皮細胞增值的正向調控）、positive regulation of protein phosphorylation（蛋白質磷酸化的正調控）、inflammatory response（炎癥反應）、negative regulation of calcium ion transport（鈣離子轉運的負調控）

主要表現為腦損傷缺血缺氧后，發(fā)生應激免疫反應，一氧化氮合成、血管內皮再生、蛋白質受蛋白酶分解繼發(fā)內源化炎癥反應的級聯生物過程；分子功能方面，排名前15 的條目中，heme binding（血紅素結合）功能使血液中多余的游離血紅素與血紅素結合蛋白相結合后清除，防止游離血紅素導致氧化應激反應對血管系統造成損傷并加重炎癥反應［29-30］；serine-type endopeptidase activity（細胞因子活性）如TNF-α、IL-1β，IL-6 等炎性細胞因子的表達，是腦組織細胞損傷的表現也是進一步發(fā)展的加重機制。nitricoxide synthase activity（一氧化氮合酶活性），腦缺血缺氧，興奮性氨基酸增加激動NMDA 受體，細胞內鈣超載，激活NOS 釋放大量對腦神經有害的NO，最終造成血管內皮的損害，缺血區(qū)域腦組織支配相應功能的缺失［31］。細胞成分方面，排名前15 的條目中，platelet alpha granule lumen（血小板alpha 顆粒腔），血小板通過釋放血小板alpha 顆粒內容物促進血管內皮的修復，而血管內皮的損傷能夠引起血栓、血管炎、出血、動脈粥樣硬化等；proteinaceous extracellular matrix（蛋白質性細胞外基質）則與粥樣斑塊的穩(wěn)定性密切相關；extracellular matrix（細胞外基質）通過MMP9 介導分解細胞外基質，導致缺血再灌注后血腦屏障損傷，通過抑制MMP9 激活可改善血腦屏障通透性［32］；blood microparticle（血液微粒）如IL-6、VEGFA、MMP9 等微粒直接或間接與腦組織損害相關。通過拓撲分析及GO富集分析表明通竅活血湯對腦梗后血管性癡呆的多通路、靶點的作用機制，治療機制及靶點的多樣性。

經KEGG 及聚類分析得出與血管性癡呆相關關系較為密切的5 條通路，分別為TNF signaling pathway（腫瘤壞死因子信號通路）：由VCAM1，AKT1，ICAM1，IL-6，CCL2，PTGS2，MMP9，IL-1β 等主要靶點構成，腫瘤壞死因子可以誘導白細胞介素等促炎細胞因子，從而引起炎癥反及損傷血管內皮細胞［33］；HIF-1 signaling pathway（缺氧誘導因子-1 信號通路）：由AKT1，IL-6，HIF1A，HMOX1，VEGFA，SERPINE1，IFNG，NOS3 靶點構成的通路；缺氧時，線粒體呼吸鏈電子傳遞及氧化磷酸化發(fā)生障礙，進而導致電子傳遞鏈上酶活性抑制、氧化磷酸化水平降低，ATP 合成減少、自由基產生增多，突觸減少，神經傳導速度下降，神經元壞死或凋亡而出現臨床認知功能下降表現，HIF-1 能改善腦組織缺血，減少組織再灌注損傷，改善局部能量代謝障礙，促進血流動力學恢復和新生血管生成，維持神經細胞生存微環(huán)境的穩(wěn)定［34-35］；VEGF signaling pathway（血管內皮生長因子信號通路）：由AKT1，PTGS2，VEGFA，NOS3 靶點構成，VEGF 及其受體能誘導血管新生及神經發(fā)生、促進神經功能的恢復［36］；Complement and coagulation cascades（補體和凝血級聯）：由PLAT，THBD，F3，SERPINE1，PLAU 靶點構成；與凝血關系密切；NF-kappa B signaling pathway（NF-kappa B 信號通路）：NF-kB 通路由VCAM1，ICAM1，PTGS2，IL-1β 靶點構成；通過誘導細胞增殖分化、介導細胞炎性免疫和誘導細胞凋亡從而發(fā)揮基因轉錄的生物學效應；研究表明，川芎、紅花、赤芍、大棗、桃仁、生姜、蔥白、麝香的有效化合物通過誘導SERPINE1、VEGFA、PTGS2、COX-2、TNF-α、IL-6、IL-1β、AKT1 等靶點，啟動TNF signaling pathway、HIF-1 signaling pathway、VEGF signaling pathway、Complement and coagulation cascades、NF-kappa B signaling pathway 等通路而發(fā)揮對血管性癡呆治療機制及靶點的多樣性，如抗炎、抗氧化、鈣通道的調節(jié)、血腦屏障保護、調節(jié)腦血流、穩(wěn)定斑塊、抑制或促進神經遞質釋放、促進神經元再生等；本研究選取NF-kappa B signaling pathway 闡述其通路機制，見圖7，腦組織損傷后可出現不同程度的神經細胞損傷，而成人神經干細胞（NSCs）屬于休眠狀態(tài)，在病理及外因的刺激下可激活，表現出再生及修復能力，促進神經干細胞再生，其中NF-κB 是誘導細胞增殖分化、免疫、凋亡的關鍵性轉錄因子；NF-kappa B 信號通路由NF-κB、NF-κB 抑制蛋白（Iκβ）、Iκβ 激酶復合物（IKKs）和其上游激酶組成。腦缺血后，蛋白激酶級聯反應被激活，Iκβ 磷酸化，隨之被蛋白酶體快速降解，NF-κB 被激活，進入細胞核，啟動靶基因的轉錄，誘導與免疫、炎性反應和凋亡，激活局部內皮細胞和白細胞表面黏附分子的釋放數量及功能的上調，造成局部血管的堵塞。研究表明通過干預使Iκβα 表達增加、p-NFκB、p-p65 的表達減少，從而達到抑制NF-κB 信號通路中炎性介質反應起到腦保護作用［37］。

圖7 NF-κB 信號通路流程圖

綜上所述，本研究通過網絡藥理學對通竅活血湯作用于血管性癡呆的機制進行研究，分別從藥物疾病靶點預測篩選、PPI 分析、GO 富集、KEGG 通路、聚類進行分析，進而預測通竅活血湯通過如抗炎、抗氧化、鈣通道的調節(jié)、血腦屏障保護、調節(jié)腦血流、穩(wěn)定斑塊、促進血管再生、抑制或促進神經遞質釋放、促進神經元再生等機制發(fā)揮腦保護作用，最后通過分子對接，驗證了通竅活血湯有效化合物與其作用的靶點結合活性較好，建立在此基礎上的靶點預測具有較高的可信度，進而證明本研究預測的真實性。